楊垚 張艷 黨江波 梁國(guó)魯 郭啟高 龐靜

摘 ?要：為使煙草染色體標(biāo)本制備過(guò)程中取材更方便，本研究以異源五倍體煙草（2n=5x=58）為材料，觀察了不同大小子房、不同預(yù)處理方法對(duì)煙草染色體制片效果的影響。首先，子房大小按花冠與花萼長(zhǎng)度比例分為6類;其次，預(yù)處理方法分為2類，即：（1）室溫下于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中預(yù)處理2、4和6 h;（2）7 ℃下于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中預(yù)處理12、24和36 h。結(jié)果顯示，當(dāng)花冠長(zhǎng)度小于或等于花萼長(zhǎng)度的1/2時(shí)，子房中分裂期細(xì)胞的比例最大，為97.00±17.82個(gè)/1000個(gè)。該時(shí)期子房于7 ℃經(jīng)24 h預(yù)處理后，染色體數(shù)目與形態(tài)清晰可辨。利用上述方法制作云煙87（2n=4x=48）和（2n=2x=20）的染色體標(biāo)本，均獲得較好的結(jié)果。此外，將上述方法制作的五倍體煙草染色體經(jīng)5S rDNA-FISH，獲得了清晰可辨的5個(gè)不同信號(hào)，與預(yù)期一致。可見(jiàn)，幼嫩子房可用于煙草染色體標(biāo)本的制作，且用改良的預(yù)處理方法制備的染色體標(biāo)本可用于染色體計(jì)數(shù)和核型分析，也可用于原位雜交分析。

關(guān)鍵詞：煙草;幼嫩子房;染色體制片;原位雜交

中圖分類號(hào)：S572.03 ?????????文章編號(hào)：1007-5119（2019）04-0056-06 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.04.009

Study on ?Chromosome Specimen?Preparation Using Ovary

YANG Yao， ZHANG Yan， DANG Jiangbo， LIANG Guolu， GUO Qigao， PANG Jing

（1. College of Horticulture and Landscape， Southwest University， Chongqing 400715， China; 2. Chongqing Tobacco Research Institute， Chongqing Municipal Tobacco Company， Chongqing 400715， China; 3. Zunyi Tobacco Company of Guizhou Province， Meitan Branch， Zunyi， Guizhou 564100， China）

?In order to obtain materials of ?plants easily when preparing chromosome?specimens， in this study， allopentaploid tobacco （2n=5x=58） was used as materials to observe?the effects of ovary?sizes and pretreatment methods on ?plants chromosome specimen preparation. First， ovaries were divided?into?6 types based on corolla length/calyx length; and then， two pretreatments were compared， one was pretreatment in 0.002 mol/L 8-hydroxy-quinoline solution at normal atmospheric temperature for 2， 4?and 6 h， the other one was pretreatment in 0.002 mol/L 8-hydroxy-quinoline solution at 7 ℃?for 12， 24 and 36 h. When the length of the corolla was less than or equal to 1/2 of the calyx， the ratio of mitotic cells reached the highest， being?97.00±17.82 in 1000 cells. When ovaries with the most mitotic cells were pretreated at 7 ℃?for 24 h， the number and configuration of chromosomes were clear and distinguishable. The above mentioned?methods?were?applied in chromosome specimen preparation of Yunyan87 （2n=4x=48） and ?（2n=2x=20）， and nice results were obtained， respectively. In addition， 5S rDNA-FISH?was carried out on chromosomes of ，?and?expected recognizable signals were found on 5 different chromosomes. These results indicated that tender?ovary could be used to prepare chromosome specimens of ?plants. Chromosome?specimens prepared with modified method were not only beneficial to chromosomes counting?and karyotype analysis， but also can be applied to in situ hybridization analysis.

?; tender ovary; chromosome specimen preparation; in situ hybridization

染色體是基因的載體，其數(shù)目和形態(tài)是生物的主要特征。根據(jù)染色體的數(shù)目和形態(tài)，可對(duì)生物的進(jìn)化和分類進(jìn)行研究。在生物育種中也常涉及對(duì)染色體數(shù)目、形態(tài)的觀察。染色體標(biāo)本制作是染色體觀察和研究的基礎(chǔ)，對(duì)生物研究和育種均較為重要。染色體標(biāo)本制作時(shí)需選取生長(zhǎng)旺盛的組織為

材料，如幼嫩根尖、幼嫩莖尖以及幼嫩葉片等，其中，種子萌發(fā)的根尖較為常用。

煙草為茄科（Solanaceae）煙草屬（）植物的通稱，煙草染色體制片主要以種子萌發(fā)的根尖和幼苗的根尖為材料。然而對(duì)于煙草屬植物，無(wú)論是種子萌發(fā)的根尖還是幼苗的根尖均較為細(xì)小，取材難度較大，后續(xù)處理過(guò)程中材料較易丟失，且切取根尖易對(duì)植株造成傷害，在單株材料的染色體分析中不宜應(yīng)用。幼嫩花蕾（子房）在部分植物中被用于染色體標(biāo)本的制備，而未見(jiàn)在煙草中應(yīng)用。煙草花量較多，花期較長(zhǎng)，取材方便，且取花蕾對(duì)植株的傷害較小，也不影響后續(xù)的結(jié)實(shí)以及雜交等環(huán)節(jié)，這有利于數(shù)量較少且較為珍貴的材料的染色體制備。

本研究以煙草屬異源五倍體植株為材料，對(duì)利用花蕾（子房）進(jìn)行煙草染色體制片的可行性進(jìn)行分析，為煙草染色體標(biāo)本的制作提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

煙草四倍體材料云煙87（2n=4x=48）、煙草二倍體材料（2n=2x=20）由國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)提供。煙草異源五倍體（2n=5x=58）材料是以云煙87八倍體（2n=8x=96）為母本與為父本雜交，經(jīng)組織培養(yǎng)繁育獲得。所有材料均種植于西南大學(xué)園藝園林學(xué)院試驗(yàn)基地。

1.2 ?方法

1.2.1??不同大小子房中分裂期細(xì)胞的比例觀察?根據(jù)前期的觀察與測(cè)量，按花冠與花萼長(zhǎng)度的比例將異源五倍體煙草的子房分為6類（表1）。于晴天在上午9：00—11：00取下6種不同類型的花蕾，自花托和子房連接處用鋒利刀片分割，將子房去花柱后置于卡諾固定液（∶=1∶3）中固定過(guò)夜。取出后用蒸餾水清洗2次，并于第3次清洗過(guò)程中浸泡約20 min以去除固定液。后將子房分割為約1 mm的組織塊，放入混合酶液（3%纖維素酶+0.3%果膠酶）中于37 ℃下孵育1.5 h。蒸餾水輕柔清洗2次以去除酶液，加卡諾固定液固定。采用壓片法觀察，記錄處于分裂期的細(xì)胞數(shù)量和觀察細(xì)胞總數(shù)量，計(jì)算分裂期細(xì)胞的比例。每類花蕾5個(gè)重復(fù)。

1.2.2??不同方法預(yù)處理及染色體制備??取有絲分裂細(xì)胞占比最大的異源五倍體花蕾類型，按前述方法分割后取子房浸沒(méi)于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中，按以下2類方法進(jìn)行預(yù)處理：

（1）在室溫（約25 ℃）條件下分別處理2、4和6 h。

（2）在7 ℃條件下分別處理12、24和36 h。

預(yù)處理后用卡諾固定液固定過(guò)夜，再按前述方法酶解，以涂片法進(jìn)行制片，火焰干燥，5%吉姆薩染色。各處理5個(gè)重復(fù)，經(jīng)鏡檢統(tǒng)計(jì)中期分裂相細(xì)胞的比例，觀察染色體形態(tài)，并以此對(duì)不同預(yù)處理方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

云煙87和的子房按最佳方法進(jìn)行預(yù)處理。

1.2.3??5S rDNA原位雜交??（1）5S rDNA探針制備：供試探針自擬南芥5S rDNA序列中選取，由上海生工生物工程公司合成，并利用TAMRA（四甲基羅丹明）對(duì)其5'端進(jìn)行修飾。（2）原位雜交方法：參照陳志的方法進(jìn)行，依次是染色體標(biāo)本的預(yù)處理與固定、探針和染色體的變性、雜交、雜交后洗脫、信號(hào)檢測(cè)與圖像處理。其中不同的是：雜交過(guò)程中探針終濃度為2?ng/μL，直接以2×SSC溶液配制，不經(jīng)變性直接進(jìn)行雜交，雜交時(shí)間為2?h;雜交后直接用2×SSC在常溫下洗脫2次。

2 ?結(jié)??果

2.1 ?不同大小子房中分裂期細(xì)胞數(shù)量

不同大小子房中處于分裂期的細(xì)胞比例見(jiàn)表2。由表2中可見(jiàn)，第2類子房即花冠長(zhǎng)度小于等于花萼長(zhǎng)度的1/2的子房中分裂期細(xì)胞占比最大，每1000個(gè)細(xì)胞中有97.00±17.82個(gè)（圖1），與其他類型子房中的比例相比差異顯著或極顯著;其次是第3類和第4類子房。但第3類與第4類子房相比差異不顯著?？梢?jiàn)，第2類子房最適于染色體標(biāo)本制備。

2.2 ?不同方法預(yù)處理子房制片效果

表3所示，同一方法在不同溫度下，隨著預(yù)處理時(shí)間的增加，制片中中期分裂相的細(xì)胞數(shù)目均增加，最長(zhǎng)染色體的長(zhǎng)度縮短，染色體的縊痕逐漸明顯，著絲點(diǎn)顯現(xiàn)出來(lái)。

室溫條件下，異源五倍體煙草經(jīng)2 h預(yù)處理，最長(zhǎng)染色體的長(zhǎng)度為10.30～15.24 μm，大部分染色體邊緣模糊，著絲點(diǎn)未見(jiàn)，著色較淺。經(jīng)4 h（圖2B）、6 h預(yù)處理，雖部分染色體著絲點(diǎn)顯現(xiàn)，但邊緣較模糊，形態(tài)仍較難清晰分辨。在7 ℃下，經(jīng)12 h預(yù)處理，大部分染色體著絲點(diǎn)已經(jīng)顯現(xiàn)，邊緣較清晰，但長(zhǎng)度稍長(zhǎng);24 h預(yù)處理（圖2A），所有染色體著絲點(diǎn)清晰可見(jiàn)，邊緣清晰，長(zhǎng)度適中，且分散性較好。在處理36 h后，大部分可見(jiàn)染色單體，但染色體長(zhǎng)度較短，過(guò)度凝縮，亦不利于形態(tài)識(shí)別和測(cè)量。

2.3 ?云煙87和制片

以子房為材料，經(jīng)7 ℃預(yù)處理24 h后對(duì)云煙87和進(jìn)行染色體制片。從制片結(jié)果中可以看出，兩種煙草的染色體均較分散，形態(tài)舒展，邊緣清晰，可用于計(jì)數(shù)和核型分析（圖3）。

圖3 ?以子房為材料及用改良的預(yù)處理方法制得的云煙87（A）和（B）的染色體

Fig. 3 ?Chromosomes of Yunyan87 and ?using ovaries as materials pretreated for 24 h at 7 ℃

2.4 ?異源五倍體煙草5S rDNA原位雜交效果

將最佳方法制備的異源五倍體煙草染色體標(biāo)本用于5S rDNA原位雜交。圖4結(jié)果顯示，雜交信號(hào)亮度較明顯，易于識(shí)別。該中期染色體上共有5個(gè)5S rDNA雜交信號(hào)，與預(yù)期相符合。說(shuō)明采用上述最佳方法所制的異源五倍體煙草染色體標(biāo)本可用于原位雜交。

3 ?討??論

花蕾由莖尖分生組織分化發(fā)育而來(lái)，幼嫩花蕾快速生長(zhǎng)、膨大，這是幼嫩花蕾可用于進(jìn)行染色體制片的主要原因。不同時(shí)期處于分裂期的細(xì)胞比例不同，說(shuō)明不同時(shí)期花蕾的生長(zhǎng)速度不同。染色體制片過(guò)程中，常采用單一方法進(jìn)行預(yù)處理，其中秋水仙素和8-羥基喹啉較為常用，低溫誘導(dǎo)也有見(jiàn)報(bào)道。低溫處理可間接地對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用，這樣有助于后期觀察染色體的形態(tài)。本研究采用化學(xué)試劑結(jié)合低溫誘導(dǎo)，效果較單一化學(xué)試劑處理較好。且低溫處理的染色體長(zhǎng)度分布范圍較常溫處理的小，表明低溫處理使染色體長(zhǎng)度較均一。這可能是低溫使整個(gè)花蕾在短時(shí)間處于同一條件，還延緩了花蕾的生長(zhǎng)活動(dòng)，使8-羥基喹啉更充分地滲入所有細(xì)胞，以使更多細(xì)胞所處條件更趨于一致。

原位雜交在煙草遠(yuǎn)緣雜交育種以及煙草屬植物的進(jìn)化、分類中有較多應(yīng)用。原位雜交要求分裂相背景較少，染色體形態(tài)舒展。在本研究中，以20 bp的5S rDNA保守序列為探針，進(jìn)行雜交，雜交后的分裂相背景淺，染色體形態(tài)清晰可辨，所獲得的信號(hào)也較強(qiáng)，且數(shù)量與預(yù)期一致。這說(shuō)明，這種方法獲得的染色體適于原位雜交，對(duì)較短的探針序列也較為實(shí)用，且效果良好。這為后續(xù)煙草屬植物細(xì)胞遺傳學(xué)分析過(guò)程中的染色體制備提供了較好的方法。

煙草育種特別是遠(yuǎn)緣雜交育種過(guò)程中常涉及重要單株材料的染色體鑒定和分析。這類分析過(guò)程中，往往面臨材料較少的問(wèn)題，且這類分析對(duì)制片的效果要求也較高。本研究所得結(jié)果為這類材料的?單株染色體制備提供了較好的方法。該方法在云煙87和N. plumbaginifolia及二者的雜種（異源五倍體）?材料中均有較好效果，表明這種方法有較為廣泛?的應(yīng)用范圍。較多野生煙草的子房較小，如本研究 中所用的，處于最佳時(shí)期的子房的長(zhǎng)度僅1～2 mm。這增加了部分處理過(guò)程的難度。為了取材和處理方便，在預(yù)處理時(shí)可將包含多個(gè)花蕾的花序一起放入預(yù)處理液中處理。

但是，以花蕾為材料制備染色體標(biāo)本，不能對(duì)材料進(jìn)行早期鑒定。一方面周期較長(zhǎng)，另一方面對(duì)場(chǎng)地面積有較多要求。故本方法并不太適于大規(guī)模篩選、鑒定以及對(duì)純系材料的早期鑒定。大規(guī)模篩選、鑒定可結(jié)合其他方法如流式細(xì)胞術(shù)、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞觀察等進(jìn)行初選，再用本研究所得方法進(jìn)行后期鑒定。

綜上所述，本研究的最佳方法適于煙草染色體標(biāo)本的制作，且制片可用于分子細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中，這為煙草的細(xì)胞遺傳學(xué)分析提供參考。

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