喻廷君 杜娟 李尚偉

摘 要：九香蟲Coridius chinensis是一種重要的資源昆蟲，防衛(wèi)素是抗菌肽家族中一個重要的成員。本文從九香蟲中克隆了一種防衛(wèi)素基因CcDef1，其cDNA的長度為395 bp，包含一個300 bp的開放閱讀框，編碼99個氨基酸。CcDef1的前體由信號肽、前體肽和成熟肽組成，成熟CcDef1形成包含1個α-螺旋、2個β-折疊片和3個二硫鍵的三維結(jié)構(gòu)。CcDef1蛋白的相對分子量為4589.37 Da，總凈電荷量為+1，理論等電點為7.84。同源性和聚類分析顯示，CcDef1與紅尾碧蝽Palomena prasina防衛(wèi)素的親緣關(guān)系最近。該研究為進一步明確CcDef1基因的功能及開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：九香蟲;抗菌肽;昆蟲防衛(wèi)素;基因克隆

中圖分類號：R282

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）03-0006-06 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.002

Abstract：Coridius chinensis is an important resource insect and defensin is an important member of the antimicrobial peptides family. In this study，a defensin gene，designated as CcDef1，was cloned from C. chinensis. The CcDef1 cDNA is 395 bp in length，containing a 300 bp open reading frame （ORF） that encodes 99 amino acids. The precursor of CcDef1 is composed of a signal peptide，a propeptide and a mature peptide. The mature CcDef1 forms a three-demensional structure consisted of 1 α-helix，2 β-pleated sheets and 3 disulfide bonds. The molecular weight of CcDef1 protein is 4589.37 Da，the total net charge is +1，and the theoretical isoelectric point is 7.84. CcDef1 protein is involved in the immune protection process of organisms. Homology and cluster analyses showed that CcDef1 possesses the closest relationship with that of Palomena prasina and Halyomorpha halys.? The study laid the foundation for futher clarifying the function of CcDef1 gene and developing new antibacterial drugs.

Key words：Coridius chinensis; antimicrobial peptide; insect defensins; gene cloning

青霉素的發(fā)現(xiàn)及提純是人類歷史上最偉大的發(fā)現(xiàn)之一，它揭開了人們將抗生素應(yīng)用于臨床的序幕?？股卦谕炀壬耐瑫r，致使一些病原菌對其產(chǎn)生抗性，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1等。耐藥性細菌的產(chǎn)生加快了人們尋求新型抗菌藥物的步伐，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）以最有可能替代抗生素成為新型的抗菌藥物出現(xiàn)在人們的視線中[1]，其已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。抗菌肽是一類由外界病原菌誘導(dǎo)宿主生物而產(chǎn)生的具有免疫作用的短肽，具有分子量小、熱穩(wěn)定性強、水溶性好、強堿性、廣譜抗菌和不破壞正常細胞等特點，在免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。先前的研究表明，抗菌肽具有抑制細菌、原生生物、真菌、病毒和癌細胞生長等生物活性[2-8]。防衛(wèi)素（defensins）是抗菌肽中的一員，可大致分為α-防衛(wèi)素、β-防衛(wèi)素、θ-防衛(wèi)素、植物防衛(wèi)素和昆蟲防衛(wèi)素。

昆蟲防衛(wèi)素（insect defensins）是昆蟲產(chǎn)生的一種為了應(yīng)對創(chuàng)傷或病原菌感染的小分子陽離子短肽，由33～46個氨基酸組成，在位置Cys1-Cys4、Cys2-Cys5和Cys3-Cys6形成3個分子內(nèi)二硫鍵[9]。昆蟲防衛(wèi)素最先在褐尾麻蠅（Sarcophaga peregrina）[10]和新陸原伏蠅（Phormia terranovae）[11]中發(fā)現(xiàn)，它們對革蘭氏陽性菌都具有抗菌活性。此后，陸續(xù)有新型昆蟲防衛(wèi)素被發(fā)現(xiàn)，如來自白星花金龜（Protaetia brevitarsis）的Psdefensin，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有抗菌活性[12];在絲光綠蠅（Lucilia sericata）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的LSer-Def3和Lser-Def6，二者對革蘭氏陽性菌有控制作用[13];從版納繩蚋（Simulium bannaense）分離純化的SibaDef能抑制革蘭氏陽性菌的生長 [14];一種來自棉鈴蟲（Heliothis virescens）幼蟲抗真菌的防衛(wèi)素[15];來自桔小實蠅（Bactrocera dorsalis）的BdPho[16];從黑水虻（Hermetia illucens）幼蟲中分離的DLP4對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有抗性[17]以及來自銅綠蠅（Lucilia cuprina）的lucifensin和lucifensin II[18]等。

九香蟲（Coridius chinensis）是一種半翅目（Hemiptera）兜蝽科（Dinidoridae）昆蟲[19]，其發(fā)育類型為漸變態(tài)發(fā)育，其生活史包括卵、若蟲和成蟲三種形態(tài)，在自然條件下一年只產(chǎn)生一代[20]。九香蟲具有理氣止痛、溫中助陽的功效，它已經(jīng)被中國藥典（2014版）收錄，而且居住在中國貴州省劍河縣和道真縣的人們具有食用九香蟲的習(xí)慣。由此可見，九香蟲在藥用和食用領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)利用價值。先前的研究報道了一些半翅目昆蟲防衛(wèi)素，如使用大腸桿菌（Escherichia coli）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）的混合菌液誘導(dǎo)始紅蝽（Pyrrhocoris apterus）產(chǎn)生1種由43個氨基酸組成的防衛(wèi)素，對革蘭氏陽性菌具有抗菌活性[21];Chernysh等[22]在紅尾碧蝽（Palomena prasina）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)1種具有43個氨基酸的防衛(wèi)素含有6個半胱氨酸;Lopez等[23]從長紅獵蝽（Rhodnius prolixus）分離出由43個氨基酸組成的defensin A。先前的研究表明九香蟲體內(nèi)可能含有多種抗菌肽[24-25]，表明其體內(nèi)含有抗菌肽。目前關(guān)于九香蟲防衛(wèi)素的報道較少。因此，在本文中，我們從九香蟲中克隆獲得一種防衛(wèi)素基因，命名為CcDef1，并對其生物學(xué)特征進行分析，為進一步研究該基因的功能及開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

九香蟲采集于中國貴州省凱里市碧波鎮(zhèn)的一個農(nóng)場，人工飼養(yǎng)于貴州大學(xué)昆蟲研究所，溫度為（25 ±1）℃，80%的相對濕度，光周期為14 L：10 D。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

使用HP Total RNA Kit（Omega Bio-Tek，GA，USA）提取九香蟲成蟲總RNA，根據(jù)試劑盒說明書進行操作。RNA的質(zhì)量和濃度分別使用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000紫外分光光度計（Thermo Fisher，MA，USA）進行檢測。以獲得的九香蟲RNA為模板，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher，MA，USA）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此作為基因克隆的模板。

1.3 九香蟲防衛(wèi)素基因克隆

從九香蟲全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出防衛(wèi)素基因序列，根據(jù)此序列用Primer Premier 6.0設(shè)計PCR引物（CcDef1-F：ATCTTACCACTAACCTCTACTACAC; CcDef1-R：TAATTTAAGCAGCAAGCGATGG），并送至生工生物工程（上海）有限公司進行合成。通過T100 Thermal Cycler（Bio-Rad，CA，USA）進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗，反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2× TsingKe Master Mix（北京擎科生物科技有限公司），8.5 μL滅菌超純水，2 μL cDNA模板，上、下游引物（10 μM）各1 μL。反應(yīng)條件： 94°C 預(yù)變性3 min;94°C變性30 s，52°C退火30 s，72°C延伸30 s，進行30個循環(huán); 72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Gel Extraction Kit（Omega Bio-Tek，GA，USA）對目的基因進行回收純化。然后，將純化產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，菌落PCR篩選重組子。經(jīng)PCR驗證的陽性克隆最后送至生物工程（上海）股份有限公司進行測序。使用DNAMAN 9.0軟件，將測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行對比。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測該基因的開放閱讀框，用ProP 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProP/）分析信號肽和前體肽。用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測理化性質(zhì)，用DISULFIND（http：//disulfind.dsi.unifi.it/index.php）預(yù)測二硫鍵，用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析親/疏水性。糖基化位點預(yù)測采用NetNGlyc 1.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和NetOGlyc 4.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）進行分析，磷酸化位點預(yù)測采用NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線軟件進行分析。CcDef1的二級結(jié)構(gòu)使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行預(yù)測;亞細胞定位使用Target P 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進行預(yù)測;功能預(yù)測使用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）進行分析。用SWISS MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）的同源建模方法預(yù)測成熟CcDef1的三維結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL 1.4繪制其分子結(jié)構(gòu)圖。將該防衛(wèi)素在抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD（http：//aps.unmc.edu/AP/）中進行相似性搜索和特性分析。用Clustal Omega （https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）和GeneDoc 2.7將CcDef1氨基酸序列與其他12種昆蟲防衛(wèi)素氨基酸序列進行對齊分析;使用MEGA-X進行聚類分析。用于多序列對齊和聚類分析的防衛(wèi)素來源物種及GenBank登錄號列于表1中。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增CcDef1基因

九香蟲總RNA的電泳檢測結(jié)果顯示，28S 和 18S 這兩條帶清晰且明亮，沒有出現(xiàn)拖尾和彌散帶的現(xiàn)象（圖1-A），表明所提 RNA 的完整度好。紫外分光光度計檢測顯示總RNA的 A260/A280 值為 1.93，表明RNA的純度較好。RT-PCR電泳結(jié)果顯示，在約400 bp位置出現(xiàn)一條明亮的擴增帶，與預(yù)期大小一致（圖1-B）。

A：九香蟲總RNA;B：CcDef1基因擴增。M：DL2000 DNA marker;1：CcDef1基因

2.2 CcDef1的cDNA

九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef1的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序得到該基因的cDNA序列 （GenBank登錄號：MK304482）。該cDNA長395 bp，包含一個長度為300 核苷酸（nt）的開放閱讀框，編碼99個氨基酸;5’端有29 nt的非編碼區(qū)（UTR），3’端有66 nt的UTR。該防衛(wèi)素CcDef1的N端具有一段由17個氨基酸組成的信號肽和長度為39個氨基酸的前體肽（圖2）。

2.3 CcDef1的特征分析

九香蟲防衛(wèi)素CcDef1的分子式為C189H308N60O57S8，相對分子量為4589.37 Da，理論等電點為7.84，包含2個帶負電荷氨基酸殘基（D，E）和3個帶正電荷氨基酸殘基（R，K）。該防衛(wèi)素在N16處有一個N-糖基化位點，無O-糖基化位點，具有3個磷酸化位點（S63，T66，T82）。在CcDef1的氨基酸序列中，含有6個半胱氨酸，在59Cys1-90Cys4，76Cys2-95Cys5，和80Cys3-97Cys6形成3個二硫鍵（圖3）。對成熟CcDef1的親/疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，疏水氨基酸的比例大于親水氨基酸的比例，表明成熟CcDef1為疏水蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果顯示，CcDef1擁有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，位置在L4～Y21。

2.4 同源性比較和聚類分析

將CcDef1氨基酸序列在NCBI中進行Blast比對，結(jié)果顯示該防衛(wèi)素與紅尾碧蝽（P.prasina）、茶翅蝽（H.halys）及褐飛虱（N.lugens）的防衛(wèi)素分別具有76.76%、65.31%和63.16%的相似性。多序列對齊結(jié)果顯示，成熟CcDef1含有6個穩(wěn)定表達的半胱氨酸和2個連續(xù)而且穩(wěn)定表達的甘氨酸（圖4）。在抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD中的預(yù)測顯示，CcDef1與廄螫蠅（Stomoxys calcitrans，AP01366）的Smd2、 絲光綠蠅（Lucilia sericata，AP01532）的Lucifensin、溫帶臭蟲（Cimex lectularius，AP02651）的CL-defensin和銅綠蠅（Lucilia cuprina，AP02240）的lucifensin II 的相似性分別為66.66%、61.36%、59.09 %和59.09% 。

聚類分析顯示，紅尾碧蝽和茶翅蝽的防衛(wèi)素與CcDef1聚在一起，然后與膜翅目昆蟲防衛(wèi)素聚為一支;雙翅目昆蟲防衛(wèi)素與其他半翅目昆蟲防衛(wèi)素聚為另一支（圖5）。同源性比較和聚類分析的結(jié)果表明，CcDef1與紅尾碧蝽防衛(wèi)素的親緣關(guān)系最近，其次是茶翅蝽。

3 結(jié)論與討論

昆蟲是地球上數(shù)量最多的動物群體，它們的蹤跡幾乎遍布世界的每一角落，對環(huán)境具有極強的適應(yīng)能力。昆蟲資源的開發(fā)利用一直是人們關(guān)注的焦點，發(fā)現(xiàn)新的昆蟲抗菌肽能為人們抵抗病原菌的感染及癌癥治療提供新的方法。目前，生物信息學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于多個領(lǐng)域，包括基因結(jié)構(gòu)分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)功能分析[26-28]等。使用多參數(shù)綜合預(yù)測的方法對未知基因進行預(yù)測，可以顯著地提高預(yù)測結(jié)果的可靠性。在本文中，我們采用綜合分析方法對九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef1進行了特征分析。

昆蟲防衛(wèi)素是一種陽離子短肽，其成熟蛋白形成3個二硫鍵[9]，CcDef1蛋白的總靜電荷數(shù)為+1，在位置59Cys1-90Cys4，76Cys2-95Cys5和80Cys3-97Cys6形成3個二硫鍵。在無脊椎動物防衛(wèi)素氨基酸序列中，半胱氨酸的排列模式為Cys-X5～16-Cys-X3-Cys-X9～10-Cys-X4～7-Cys-X1-Cys [29]，CcDef1蛋白的半胱氨酸的排列模式為Cys-X16-Cys-X3-Cys-X9-Cys-X4-Cys-X1-Cys，符合無脊椎動物防衛(wèi)素的半胱氨酸排列模式。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，CcDef1蛋白含有1個CS-αβ結(jié)構(gòu)域，這是昆蟲防衛(wèi)素具有抗菌活性的一個重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[30]，參與生物體的免疫防護過程。 CcDef1蛋白是分泌通道蛋白，分布在細胞外和細胞質(zhì)的概率較高，因此可以推測CcDef1與其他昆蟲防衛(wèi)素一樣，在脂肪體中合成，經(jīng)過一系列修飾后分泌到血淋巴中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[31]。CcDef1與紅尾碧蝽和茶翅蝽防衛(wèi)素的親緣關(guān)系較近，可以判斷其為昆蟲防衛(wèi)素家族中的一員。

本研究成功克隆了九香蟲防衛(wèi)素CcDef1基因，并對其特征進行分析，為今后進一步研究該基因的功能及開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

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