顧建強 陳子強 林艷 郭新睿 田大剛

摘?要：分子標記輔助選擇可快速實現對目標基因的準確選擇，為分子育種提供有效工具。以雜交水稻恢復系蜀恢527為受體親本，以攜帶抗白葉枯病抗性基因Xa23的IRBBL23為供體親本，利用雜交、回交育種結合分子標記輔助選擇的方法，將廣譜持久抗白葉枯病基因Xa23導入到優(yōu)良恢復系蜀恢527中， 獲得22份含有Xa23基因的改良株系。用白葉枯病菌致病菌系P6接種改良株系，篩選出1份高抗白葉枯病的新恢復系R527Xa23。進一步考察R527Xa23與不育系谷A、Ⅱ32A和特豐A配制雜交組合的農藝性狀，結果顯示R527Xa23與蜀恢R527的組合，在穗長、每株穗數、結實率和千粒重等相關農藝性狀上相似，表明該恢復系R527Xa23在培育白葉枯病抗性雜交水稻組合上具有廣闊的應用前景。

關鍵詞：水稻;蜀恢527;白葉枯病;Xa23;分子標記輔助選擇

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.002

Abstrat：Molecular markerassisted selection can achieve accurate selection of target genes quickly and provides an effective tool for molecular breeding. Using restorer line Shuhui 527 as receptor parent and IRBBL23， which carrying Xa23， a resistance gene to bacterial blight， as donor parent， the broadspectrum and persistently resistant gene Xa23 was introduced into the restorer line Shuhui 527 by crossing and backcross breeding combined with molecular markerassisted selection， 22 improved lines containing Xa23 gene were obtained. A New Restorer Line R527Xa23 with high resistance to bacterial blight was screened by inoculating the improved strain P6. The agronomic traits of hybrid combinations from R527Xa23 and sterile lines Gu A， Ⅱ32A and Tefeng A were further investigated. The results showed that the improved combinations of R527Xa23 and Shuhui R527 had similar agronomic traits in panicle length， number of panicles per plant and 1000grain weight， which indicated that the restorer line R527Xa23 had broad application prospects in breeding hybrid rice combinations that resistant to bacterial blight.

Key words：Rice; Shuhui 527; Bacterial blight; Xa23; Molecular markerassisted selection

水稻白葉枯病是由革蘭氏陰性菌稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo）引起的一種嚴重的細菌性病害，一般會造成水稻減產10%～30%，嚴重時可達到50%，甚至顆粒無收[1]。此病害在世界各水稻產區(qū)均有發(fā)生，尤其在中國、日本和印度發(fā)生最為嚴重[2]。這給水稻生產帶來了巨大風險。目前生產上使用化學農藥防治白葉枯病不僅成本高、效果差，還存在嚴重污染生態(tài)環(huán)境等問題。長期生產實踐表明，利用白葉枯病抗性基因培育抗病品種，是解決上述問題的有效措施。

截至2013年3月，經國際注冊確認和報道的水稻白葉枯病抗性基因共38個。已被定位的抗性基因有26個，已有7個基因被成功克隆[3]。Xa23是一個廣譜持久抗水稻白葉枯病基因，其對現有國內外白葉枯病鑒別菌系（如菲律賓小種1～10、中國致病型小種1～7和日本小種1～3）都表現高抗，且完全顯性、全生育期抗病[4]。迄今，該基因已被廣泛應用于雜交稻白葉枯病抗性改良[5-10]。

本研究以不抗白葉枯病的恢復系蜀恢527為受體材料，利用回交轉育技術和分子標記輔助選擇，將抗病基因Xa23導入到該恢復系中。隨后，對改良株系及其所配制雜交組合進行抗性和產量評價，以期利用改良的恢復系和不育系配制雜交組合，培育高抗白葉枯病的優(yōu)良雜交稻。

1?材料與方法

1.1?材料

供體親本：攜有Xa23基因的IRBBL23;受體親本：恢復系蜀恢527;鑒定菌系：水稻白葉枯病鑒別菌系P6。

1.2?試驗方法

1.2.1?將Xa23基因導入受體材料技術路線?以恢復系蜀恢527為受體親本，以IRBBL23為抗體基因供體親本配制水稻雜交組合，F1自交，與輪回親本蜀恢527進行回交。連續(xù)3次回交和1次自交獲得分離群體，利用已開發(fā)的EST分子標記C189對分離群體進行篩選，得到含有目的基因Xa23的抗性單株。

1.2.2?抗病基因的檢測?水稻基因組DNA提取參考張鳳娟等的方法[11]。利用王春連等開發(fā)的EST標記C189[9]（引物序列由福州擎科生物技術有限公司合成）進行PCR擴增。PCR體系為25 μL，包括2×reaction Mix（含dNTP，Mg2+）12.5 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）1 μL，Gloden Taq polymerase（5 U·μL-1）0.4 μL（天根公司），水稻基因組DNA

（20～30 ng·μL-1）1 μL，ddH2O 9.1 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min;94℃變性30 s;58℃退火30 s;72℃延伸40 s;共35個循環(huán);最終72℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結果。

1.2.3?病原菌接種鑒定?將白葉枯病菌強致病菌系P6接種在馬鈴薯半合成培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)72 h，用無菌水洗下菌苔并將菌液稀釋至6×108 CUF·mL-1。在水稻孕穗期，采用剪葉法進行人工接種菌株。每株材料選擇5片葉接種，接種后2～3周進行調查。根據《中國水稻品種試驗與審定》中主要病害鑒定方法與標準進行材料抗性評價[12]。

1.2.4?室內考種?配制的雜交組合按完全隨機區(qū)組設計排列種植福建省農業(yè)科學院生物技術研究所壽山試驗站，每小區(qū)種植4行，每行8株，3次重復。參考許桂玲等[13]的方法進行室內考種。

2?結果與分析

2.1?抗性基因Xa23的檢測分析

利用抗性基因Xa23的緊密連鎖分子標記C189對BC3F2群體單株進行PCR擴增。結果顯示，供體親本擴增出約800 bp的Xa23特征條帶，而受體親本擴增出約900 bp的條帶，BC3F2的部分單株擴增出含Xa23的特征條帶，說明抗白葉枯病基因Xa23被成功導入到恢復系蜀恢527中。在BC3F2群體中，共檢測出22份攜帶Xa23的純合株系。

2.2?病原菌接種鑒定分析

將22份改良株系和親本在孕穗期接種本試驗的白葉枯病菌系P6，劍葉剪葉接種水稻白葉枯病發(fā)病程度分級標準見表1。接種鑒定結果顯示，親本蜀恢527對白葉枯病表現感或中感，而絕大多數攜有抗性基因Xa23的改良系和供體親本表現抗白葉枯病，其中1份編號為R527Xa23的材料表現高抗白葉枯病。

2.3?雜交組合農藝性狀表現

用三系不育系谷豐A、Ⅱ32A和特豐A作母本，分別與純合的R527Xa23和對照蜀恢527配制雜交組合?？疾熳匀徊话l(fā)病條件下6個組合的穗長、有效穗數、結實率、千粒重等4個農藝性狀，并進行統(tǒng)計分析?？傮w看來，R527Xa23與不育系谷豐A配制的雜交組合，在穗長、每株穗數、結實率和千粒重上與對照差異不顯著，且表現出良好的恢復性能（表2）。而對于Ⅱ32A/R527Xa23和特豐A/R527Xa23，其分別在結實率和千粒重上高于對照，達到顯著水平。調查結果表明恢復系R527Xa23在培育白葉枯病抗性雜交水稻組合上具有廣闊的應用前景。

3?討論與結論

防治水稻白葉枯病最經濟有效的手段就是利用白葉枯病抗性基因培育抗病品種，包括Xa1、Xa3/Xa26、xa5、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、xa25 和Xa27。其中，Xa23是從我國普通野生稻種鑒定出的一個優(yōu)良抗白葉枯病基因，具有抗譜廣、抗性導入效應強、完全顯性和全生育期抗性等特點。因此，該基因成為我國在雜交稻白葉枯病抗性改良上一個主要基因資源。

目前，水稻抗病育種通常是采用傳統(tǒng)育種結合分子標記輔助選擇技術對水稻品種進行改良。相比傳統(tǒng)抗性育種利用人工接種或發(fā)病區(qū)鑒定篩選目標植株，該方法具有低資源投入，且不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點，能夠快速、準確、穩(wěn)定的改良目標性狀。利用這項技術成功地培育出一批含Xa23優(yōu)良品系，并育成了一系列雜交組合。如：利用分子標記輔助選擇已經將Xa23成功導入到閩恢3139[5]，9311、1826[6]，早稻恢復系東南恢01[10]，培矮64S、明恢86和C418[14]和HK01[15]，并顯著提高改良品系對白葉枯病的抗性。

蜀恢527（R527）是四川農業(yè)大學水稻所育成的一個強恢復系，具有株葉形態(tài)好、恢復力強、配合力高、品質優(yōu)、較抗稻瘟病等特點，其已配組出通過全國或省級審定的多種組合[16]。然而，由于蜀恢527本身及其所采用的不育系都不抗白葉枯病，限制其大面積推廣和應用。目前，黃廷友等[17]利用分子標記輔助選擇已成功將Xa21和Xa4導入蜀恢527，達到改良其抗白葉枯病的目的。而本研究基于Xa23與Xa21、Xa4抗譜的差異，以及Xa23廣闊的應用前景，通過傳統(tǒng)抗病育種結合分子標記輔助選擇的方法，在相對較短的年限內獲得了具有高抗白葉枯病的新的恢復系R527Xa23，而且該恢復系表現出與蜀恢527相似的農藝性狀。新材料R527Xa23可作為優(yōu)良的恢復系用于水稻生產。

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（責任編輯：柯文輝）