陳興江　汪漢成　向立剛　崔夢嬌　周浩　代園鳳　陳雪

摘? 要：為了解煙草白粉病菌在貴州煙區(qū)的寄主植物種類，采集煙田植物白粉病樣品，基于真菌rDNA-ITS區(qū)的序列分析對其白粉病菌進行分子生物學鑒定，采用柯赫氏法則回接驗證。結果表明，貴州煙區(qū)共發(fā)現18科36種不同植物感染白粉病，其中菊科苣荬菜、向日葵、苦苣菜及大麗花，車前科車前草，及玄參科阿拉伯婆婆納的白粉病病原菌均為，與煙草白粉病病原菌（）相同，其余30種植物白粉病病原菌與煙草白粉病菌均不相同;接種后，阿拉伯婆婆納、車前草及苦苣菜在培養(yǎng)30 d內均發(fā)生白粉病，苣荬菜、向日葵、大麗花等33種植物均未發(fā)病。因此，阿拉伯婆婆納、車前草及苦苣菜3種植物可明確為煙草白粉病菌在貴州煙區(qū)的寄主植物。

關鍵詞：二孢白粉菌;分子鑒定;煙草;寄主植物

中圖分類號：S435.72????????? 文章編號：1007-5119（2019）03-0055-05????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.008

This study was conducted to investigate the host plants of the tobacco powdery mildew pathogen in Guizhou tobacco-growing field. Plant tissues with typical powdery mildew symptoms were sampled， pathogens of these hosts were identified by molecular method through analyzing the rDNA-ITS gene of the pathogens， and host plants of the? tobacco powdery mildew pathogen were identified by Koch's postulates. The results showed that a total of 36 plant species in 18 different families showed typical powdery mildew symptoms. Among them， the pathogens of powdery mildew in plant species Linn.， L.， L.， Cav.， and were all ， the powdery mildew pathogen? of ， which is not the pathogens of the other 30 plant species. After inoculating with on host plants， tobacco， ， and all showed typical powdery mildew symptoms during a 30 days’ incubation period， while the other 33 plant species did not. In summary， hosts of from tobacco in Guizhou tobacco-growing filed included ， and .

; molecular identification; tobacco; host plant

煙草（L.）是我國重要的經濟作物，其在生產過程中極易受到煙草白粉?。╰obacco powdery mildew）的危害。煙草白粉病是煙草生長中后期普遍發(fā)生、且危害嚴重的葉部真菌病害，可侵染煙草葉片、莖、葉柄、花梗、蒴果等多個部位，導致煙葉失去烘烤價值，造成煙葉產量和質量下降，給煙農造成嚴重經濟損失。了解煙草白粉病病原菌來源和寄主范圍，對指導煙草種植和煙草白粉病的防治均具有重要作用。

煙草白粉病屬于典型氣傳真菌性病害，喜中溫中濕環(huán)境，在烤煙生產季節(jié)，極易發(fā)生與流行。該病害由子囊菌亞門（Ascomycotina），核菌綱（Pyrenomycetes），白粉菌屬（）的二孢白粉菌（）引起。除危害煙草外，還能侵染菊科（Asteraceae）、葫蘆科（Cueurbitaceae）等多種作物。在貴州煙田周圍，二孢白粉菌的寄主包括大麗花（ Cav.）、苦苣菜（ L.）等。然而，局部煙區(qū)這些植物并不常見，而煙草白粉病依然頻繁發(fā)生。煙草白粉病菌的初侵染源除源自閉囊殼釋放的子囊孢子外，還可能來自其他植物上二孢白粉菌的粉孢子。據筆者調查發(fā)現，煙田周邊多種植物在煙草生育期前后也嚴重發(fā)生白粉病。這些植物是否為二孢白粉菌的轉主寄主目前還不清楚。為此，本文對煙田周邊植物白粉病病原菌進行分子生物學鑒定，并對鑒定為二孢白粉菌的植物進行煙草白粉菌回接驗證，旨在明確煙草白粉病菌在貴州煙區(qū)的寄主范圍。現將研究結果報道如下。

1? 材料與方法

1.1? 供試病原菌與試劑

煙草白粉病菌（）由貴州省煙草科學研究院微生物實驗室提供，將其長期保存于溫室大棚的活體煙草植株葉片上，溫度范圍為20～28 ℃，相對濕度大于70%，自然光照條件。保存品種為云煙87，該品種為當地烤煙主栽品種。真菌基因組DNA提取試劑盒（Code：D304）、TaKaRa Ex Taq（Code：DRR001A）、DL2000TM DNA Maker（Code：B6301A），均購自寶生物工程（大連）有限公司;真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），均由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.2? 白粉病菌樣本采集

于2017年3—11月，采集貴州省畢節(jié)市、貴陽市煙田及其周邊感染白粉病植物的葉片，將其分別裝于無菌采樣袋中，依次編號，4 ℃保存，并迅速帶回貴州省煙草科學研究院微生物實驗室，用于分子生物學鑒定。

1.3? 白粉病菌分子生物學鑒定

選取1.2中植物感病葉片上白粉病的單個病斑，以其粉孢子為對象，參照寶生物工程（大連）有限公司試劑盒（Code：D304）的說明裂解其粉孢子，獲得其基因組DNA。以各病原菌DNA為模板，采用引物ITS1和ITS4對各病原菌的rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增。擴增條件為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán);最終72 ℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產物，并送上海生工生物工程技術有限公司測序。測序結果在GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中進行BLAST對比分析，并在NCBI數據庫中登錄各病原菌的基因序列信息。

1.4? 煙草白粉菌寄主植物鑒定

依據柯郝氏法則進行回接鑒定。采集1.2中植物的健康葉片，將葉片從基部剪下，洗凈、晾干。用無菌水保濕的脫脂棉包住葉片莖基部，將植株葉片置于帶有瀝水板的保鮮盒內（29 cm×15 cm×6 cm），在盒內加入適量的無菌水保濕，采用孢子抖落接菌法接種煙草白粉病菌（），每種植物接種4張葉片。接菌后將植物葉片置于溫度范圍20～28 ℃、相對濕度大于70%、自然光照下的玻璃溫室中培養(yǎng)，9～30 d后觀察各植物葉片白粉病的發(fā)生情況，并參照1.3的方法采集發(fā)病葉片單個孢子堆白粉病菌樣品，進行分子生物學鑒定。

2? 結? 果

2.1? 貴州煙田感染白粉病植物

煙草生長季節(jié)前后，在貴州省畢節(jié)市和貴陽市煙田發(fā)現36種植物感染白粉病（表1），采集各植物白粉病單孢子堆樣品。其中，菊科植物14種，包括苣荬菜（ Linn.）、薇甘菊（ Kunth）、向日葵（ L.）、苦苣菜（）、小蓬草（ L.）、蒲公英（Hand.-Mazz.）、鱧腸（ L.）、牛膝菊（ Cav.）、豨薟草（L.）、大麗花（）等;葫蘆科植物4種，包括南瓜（ （Duch. ex Lam.） Duch. ex Poiret）、葫蘆（（Molina） Standl.）、甜瓜（ L.）;茄科植物2種，包括烤煙（ L.）和番茄（ Mill.）;小檗科植物2種，包括紫葉小檗（var. atropurpurea Chenault）和十大功勞（（Lindl.）Fedde）;豆科植物2種，包括三葉草（ L.）和黃豆（ （Linn.） Merr.）;其他植物13種，分別屬于車前科、鳳仙花科、薔薇科、大戟科、唇形科、旋花科、蓼科、傘形科、蘇木科、禾本科、玄參科、馬桑科、及杜鵑花科（表1）。

2.2? 白粉病菌分子生物學鑒定

煙田周邊植物白粉病菌rDNA-ITS區(qū)PCR擴增均獲得500 bp左右的片段，經GenBank數據庫BLAST對比發(fā)現，除鐵莧草白粉病菌外，所有植物白粉病菌的同源性達93%以上。分子生物學鑒定結果表明，菊科植物鱧腸、牛膝菊、豨薟草、百日菊、翅果菊和藿香薊，及3種葫蘆科植物的白粉病病原菌均為;苣荬菜、向日葵、苦苣菜、大麗花、車前科植物車前草、及玄參科植物阿拉伯婆婆納的白粉病病原菌均為;小蓬草和蒲公英的白粉病病原菌均為;薇甘菊的白粉病病原菌為;金雞菊的為（表1）。其余植物白粉病菌的病原菌鑒定結果如表1所示。將各植物白粉病菌擴增獲得的rDNA-ITS區(qū)序列提交NCBI，獲得基因登錄號如表1所示。

2.3? 二孢白粉菌（）寄主植物鑒定結果

煙田周邊36種植物葉片經過煙草白粉病菌（）接菌培養(yǎng)結果表明，阿拉伯婆婆納、車前草、苦苣菜的葉片上均產生白色霉層，出現典型的白粉病癥狀;苣荬菜、大麗花及其余測試植物葉片上均未出現白粉病癥狀。挑取發(fā)病植物葉片上白粉病單個孢子堆，進行分子生物學鑒定，結果表明，所鑒定病原菌均為。根據上述結果，確定阿拉伯婆婆納、車前草、苦苣菜3種植物為煙草白粉病菌的寄主植物。

3? 討? 論

煙草白粉病嚴重威脅著煙草的生產，生產上可采用多種殺菌劑進行該病害的防治。本文通過系統(tǒng)調查、分子鑒定、回接驗證等分析，初步明確了貴州煙區(qū)煙草白粉病寄主植物種類，對了解煙草白粉病的初侵染來源和指導煙草白粉病的防治具有重要意義。

白粉病菌的鑒定通常需要結合病原菌的形態(tài)學和分子生物學特征，本文僅采用了分子生物學的手段對病原菌進行了鑒定，下一步研究中，有待通過鏡檢完善煙田周邊植物白粉病菌的形態(tài)學特征。植物白粉病菌的分子生物學鑒定通?；谡婢颂求w基因轉錄間隔區(qū)（ITS）的序列分析。本研究中，大部分植物白粉病菌被鑒定到種，包括、等;然而，部分病原菌所測ITS區(qū)與其近源種的同源性較低，如：、、等。這可能與這些植物的白粉病菌在ITS區(qū)的保守性較低有關。此外，本文對少部分植物白粉病菌基于ITS的鑒定結果與文獻報道的病原菌種類并不完全一致，這可能與測序結果在進行Blast同源性比較時結果的選擇有關，也可能是寄主植物存在其他新的未見報道的白粉病病原菌。隨著基因組學的發(fā)展，基于多基因的病原微生物的鑒定技術正在被開發(fā)應用，然而，

白粉病菌這方面的研究還未見報道，下一步有待篩選白粉病菌的特異性引物，將其用于多種植物白粉病的鑒定。

據報道，煙草白粉病菌除為害煙草外，還能侵染胡蘿卜科、茄科、菊科、薔薇科、豆科和旋花科等115個屬以上的植物，本研究僅發(fā)現6種植物的白粉病菌與其相同，這可能與本地區(qū)感白粉病植物種類的區(qū)域分布局限性有關，同時也可能與采樣時間有關，下一步有待增加采樣范圍和種類，特別是采集煙草生長季節(jié)之外時期感染白粉病植株樣品，并對其病原菌進行鑒定。本文采集到的36種植物白粉病樣品中，大部分寄主屬菊科植物，發(fā)現菊科植物間的白粉病菌并不相同;此外，其余17科植物的白粉病菌間也存在較大差異。這可能與同一區(qū)域植物的白粉病菌在環(huán)境中存在著豐富的多樣性有關。研究發(fā)現菊科植物苣荬菜和苦苣菜的白粉病菌均被鑒定為，與煙草白粉病菌的病原菌相同，但柯赫氏法則回接驗證時，苣荬菜在培養(yǎng)期內并未發(fā)病，其原因目前并不清楚，有待下一步深入研究。大麗花和向日葵培養(yǎng)期內未觀察到發(fā)病，可能與培養(yǎng)時間不夠有關，有待繼續(xù)觀察。此外，本研究發(fā)現3種植物為貴州煙區(qū)的煙草白粉病病原菌的寄主，在今后本地區(qū)煙草生產和煙草白粉病的防治過程中，需要關注煙田周邊植物車前草、阿拉伯婆婆納、苦苣菜上白粉病的發(fā)生時期，做好煙草白粉病發(fā)生的預測預報工作，同時對這些植物上的白粉病也應進行綜合防治。

4? 結? 論

貴州省畢節(jié)市、貴陽市煙田及其周邊18科36種感染白粉病植物中，菊科苣荬菜、向日葵、苦苣菜及大麗花，車前科車前草，及玄參科阿拉伯婆婆納的白粉病病原菌均為，與煙草白粉病病原菌（）相同，其余30種植物白粉病病原菌與煙草白粉病菌均不相同;接種煙草白粉病菌后，阿拉伯婆婆納、車前草及苦

苣菜在培養(yǎng)30 d內均發(fā)生白粉病，苣荬菜、向日葵、大麗花等33種植物均未發(fā)病。為此，阿拉伯婆婆納、車前草及苦苣菜3種植物可明確為煙草白粉病菌在貴州煙區(qū)的寄主植物。

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