張留記 李寧 屠萬倩 李向陽 王昌華 邵戰(zhàn)波

摘 要 目的：建立同時測定杜仲葉中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷等8種成分的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為203 nm（桃葉珊瑚苷、兒茶素）、239 nm（京尼平苷酸、車葉草苷）、220 nm（綠原酸）、354 nm（蘆丁、異槲皮苷）、266 nm（紫云英苷），進樣量為5 μL。結(jié)果：桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的線性范圍分別為0.812～6.090 μg（r=0.999 3）、0.438～3.285 μg（r=0.999 2）、0.045～0.336 μg（r=0.999 2）、0.882～6.615 μg（r=0.999 3）、0.097～0.726 μg（r=0.999 1）、0.064～0.483 μg（r=0.999 3）、0.048～0.360 μg（r=0.999 1）、0.014～0.108 μg（r=0.999 7）;精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗的RSD均小于3.5%（n=6）;平均加樣回收率分別為101.60%、103.06%、99.77%、96.93%、98.17%、96.75%、98.97%、99.60%，RSD分別為1.42%、2.65%、2.78%、2.05%、2.26%、0.93%、2.79%、3.08%（n=6）。不同采集時間、不同種植品種的12批杜仲葉樣品中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的含量范圍分別為10.903～17.245、5.578～7.892、0.198～0.440、13.890～19.782、1.008～1.547、1.102～2.396、0.267～0.701、0.150～0.412 mg/g，含量波動較大;杜仲皮樣品中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷的含量分別為0.299、0.123、0.580、0.112、0.026、1.961 mg/g。結(jié)論：本方法操作簡便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可用于評價杜仲葉的質(zhì)量;不同采集時間、不同種植品種的杜仲的不同藥用部位（皮、葉）中的成分組成及含量存在明顯的差異。

ABSTRACT?; ?OBJECTIVE： To establish content determination method for simultaneously determining aucubin，geniposidic acid，catechin，chlorogenic acid，asperuloside，rutin，isoquercitrin and astragalin in Eucommia ulmoides leaves. METHODS：HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18 column with the mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid（gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 203 nm for aucubin and catechin，239 nm for geniposidic acid and asperuloside，220 nm for chlorogenic acid，354 nm for rutin and isoquercitrin，and 266 nm for astragalin. The sample size was 5 μL. RESULTS： The linear range of aucubin， geniposidic acid， catechin， chlorogenic acid， asperuloside， rutin， isoquercitrin and astragalin were 0.812-6.090 μg（r=0.999 3），0.438-3.285 μg（r=0.999 2），0.045-0.336 μg（r=0.999 2），0.882-6.615 μg（r=0.999 3），0.097-0.726 μg（r=0.999 1），0.064-0.483 μg（r=0.999 3），0.048-0.360 μg（r=0.999 1） and 0.014-0.108 μg（r=0.999 7），respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3.5%（n=6）. The average recovery rates were 101.60%，103.06%，99.77%，96.93%，98.17%，96.75%，98.97% and 99.60%，with RSDs of 1.42%，2.65%，2.78%，2.05%，2.26%，0.93%，2.79% and 3.08%，respectively（n=6）. The contents of aucubin， geniposide， catechin， chlorogenic acid， plantain， rutin， isoquercetin and astragaloside in 12 batches of E. ulmoides leaves from different collection time and planting varieties were 10.903-17.245， 5.578-7.892， 0.198-0.440， 13.890-19.782， 1.008-1.547， 1.102-2.396， 0.267-0.701， 0.150-0.412 mg/g， respectively. The content fluctuated greatly. The contents of aucubin， geniposide， catechin， chlorogenic acid， rutin and pinoresinol diglucoside in cortex of E. ulmoides were 0.299， 0.123， 0.580， 0.112， 0.026，1.961 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， reproducible and accurate. It can be used to evaluate the quality of E. ulmoides leaves. There are obvious differences in composition and content of components in different medicinal parts （cortex， leaves） of E. ulmoides.

KEYWORDS Eucommia ulmoides leaves;HPLC;Aucubin;Geniposidic acid;Catechin;Chlorogenic acid;Asperuloside;Rutin; Isoquercitrin; Astragalin; Content determination

杜仲葉為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的干燥葉，收載于2015年版《中國藥典》（一部），具有補肝腎、強筋骨的功能，可用于肝腎不足、頭暈?zāi)垦?、腰膝酸痛、筋骨瘺軟等癥的治療[1]。杜仲是我國傳統(tǒng)名貴滋補藥材，傳統(tǒng)藥用部位為其樹皮。由于杜仲從種植到剝皮通常需要10年以上時間，周期較長，且剝皮后若養(yǎng)護措施不當(dāng)，極易造成原植物死亡，僅以皮入藥會嚴(yán)重影響杜仲資源的可持續(xù)發(fā)展[2-3]。據(jù)研究報道，杜仲葉有與杜仲皮相似的化學(xué)成分和藥理活性，有望代替杜仲皮入藥[4]。

杜仲葉中的主要化學(xué)成分為京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、車葉草苷等環(huán)烯醚萜類成分[2，5]，咖啡酸、綠原酸等苯丙素類成分[6]，以及兒茶素、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷等黃酮類成分[7-8]。據(jù)文獻報道，京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷等環(huán)烯醚萜類成分具有肝臟保護作用，京尼平苷酸可通過調(diào)節(jié)膽汁轉(zhuǎn)運體功能起到保肝利膽的作用[9]，桃葉珊瑚苷能夠拮抗轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞（LX-2）活化及細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)，從而起到抗肝纖維化作用[10];蘆丁等黃酮類成分可改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨微結(jié)構(gòu)、增加骨密度，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[11];綠原酸提取物則具有較強的抑菌和抗氧化作用[12]。2015年版《中國藥典》（一部）中杜仲葉項下收載有綠原酸的含量測定項目，考慮到綠原酸并非杜仲葉專屬活性成分，同時為綜合考察杜仲葉中其他具有藥理活性的成分，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定了不同種植品種的杜仲葉中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷等8種不同結(jié)構(gòu)類別化學(xué)成分的含量，旨在為更全面地評價杜仲葉的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，配置2996型二極管陣列檢測器、柱溫箱、Empower Ⅱ色譜工作站（美國Waters公司）;LIBROR-160DPT型萬分之一天平（日本島津公司）;AE240型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）;HH-S6型電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桃葉珊瑚苷對照品（批號：111761-200601，含量：>98%）、京尼平苷酸對照品（批號：111828-201604，含量：>97.4%）、兒茶素對照品（批號：110877-201604，含量：>99.2%）、松脂醇二葡萄糖苷對照品（批號：111537-201706，含量：>91.7%）均為含量測定用對照品，購自中國食品藥品檢定研究院;綠原酸（批號：2772，純度：≥98.0%）、車葉草苷（批號：4883，純度：≥98.0%）、蘆?。ㄅ枺?718，純度：≥98.0%）、異槲皮苷（批號：5650，純度：≥98.0%）、紫云英苷（批號：3975，純度：≥98.0%）均購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司;甲醇、乙睛為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

不同種植品種的杜仲葉和杜仲（皮）由靈寶德匯生態(tài)科技有限公司提供，產(chǎn)地均為河南省靈寶市朱陽鎮(zhèn)閆家馱基地（詳見表1），經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院都恒青研究員鑒定分別為杜仲科植物杜仲（E. ulmoides Oliv.）的干燥葉和干燥樹皮，憑證標(biāo)本存放于河南省中醫(yī)藥研究院中藥室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，5%A;7～9 min，5%A→8%A;9～28 min，8%A;28～30 min，8%A→20%A;30～42 min，20%A;42～43 min，20%A→50%A;43～63 min，50%A;63～64 min，50%A→5%A）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測波長：203 nm（桃葉珊瑚苷，0～9.5 min;兒茶素，19.5～21 min）、239 nm（京尼平苷酸，9.5～19.5 min;車葉草苷，25.0～32.5 min）、220 nm（綠原酸，21～25.0 min）、227 nm（松脂醇二葡萄糖苷，32.5～34.5 min）、354 nm（蘆丁、異槲皮苷，34.5～39.5 min）、266 nm（紫云英苷，39.5～60 min）;進樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的對照品各適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并配制成上述成分質(zhì)量濃度分別為406、219、22.4、441、48.4、32.2、24.0、7.2 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 杜仲葉供試品溶液 取杜仲葉藥材粉末（過三號篩，下同）約1 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷后再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 杜仲皮供試品溶液 取杜仲皮藥材約2 g，剪碎，精密稱定，置具塞三角瓶中，加入三氯甲烷50 mL，加熱回流1 h;取藥渣，揮去三氯甲烷后連同濾紙再次置于三角瓶中，加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量;濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別吸取“2.2”項下對照品溶液和供試品溶液各適量，并以甲醇為空白對照，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷分離良好，理論板數(shù)均超過3 000，空白溶劑無干擾（圖略）。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液2、4、6、8、10、15 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以各待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程和線性范圍見表2。結(jié)果表明，各待測成分在相應(yīng)的進樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取杜仲葉藥材（樣品編號：001）粉末約1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷峰面積的RSD分別為0.65%、0.47%、2.13%、0.60%、0.89%、0.90%、1.16%、2.90%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取杜仲葉藥材（樣品編號：001）粉末約1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后在室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷峰面積的RSD分別為0.65%、0.47%、2.13%、0.60%、0.89%、0.90%、1.16%、2.90%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取杜仲葉藥材（樣品編號：001）粉末約1 g，平行6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并采用外標(biāo)法計算樣品含量。結(jié)果，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的平均含量分別為11.32、6.45、0.25、13.90、1.35、2.35、0.45、0.12 mg/g，RSD分別為1.05%、1.59%、1.59%、0.87%、3.44%、1.43%、2.04%、3.15%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的杜仲葉藥材（樣品編號：001）粉末約0.5 g，平行6份，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液（以50%甲醇為溶劑，按“2.2.1”項下方法配制成桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的質(zhì)量濃度分別為518.6、310.4、14.7、560.6、55.6、121.6、22.6、8.4 μg/mL的混合溶液）10 mL和50%甲醇15 mL，按“2.2.2”項下方法制備加樣回收供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 杜仲葉含量測定

取各批次杜仲葉藥材粉末約0.5 g，平行3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算各待測成分的含量，結(jié)果見表4。

2.10 杜仲皮含量測定

取杜仲皮藥材樣品（樣品編號：013）約2 g，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算各待測成分的含量。結(jié)果顯示，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷的含量分別為0.299、0.123、0.580、0.112、0.026、1.961 mg/g;車葉草苷、蘆丁、異槲皮素和紫云英苷因含量較低、誤差較大，未能準(zhǔn)確定量。

3 討論

3.1 測定指標(biāo)成分的確定

參照文獻報道[13-16]，本研究前期分別以桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、蘆丁、兒茶素、車葉草苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、山柰素、咖啡酸、紫丁香苷、松脂醇二葡萄糖苷等15種成分為指標(biāo)，對杜仲葉中上述成分進行含量測定。結(jié)果顯示，紫丁香苷、松脂醇二葡萄糖苷、咖啡酸、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、山柰素等7種成分含量過低，與相鄰的雜質(zhì)峰分離度不理想，無法準(zhǔn)確測定其含量，因此最后選擇桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、蘆丁、兒茶素、車葉草苷、異槲皮苷、紫云英苷等8個成分為杜仲葉的含量測定指標(biāo)。

3.2 流動相的選擇

本課題組先后采用甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.4%磷酸水溶液等流動相系統(tǒng)進行考察。結(jié)果顯示，甲醇-0.1%磷酸水溶液洗脫時，環(huán)烯醚萜類成分桃葉珊瑚苷峰與相鄰色譜峰分離度較差;換用乙腈-水系統(tǒng)后，綠原酸峰有拖尾現(xiàn)象，在水相中加入磷酸調(diào)節(jié)流動相pH值可明顯改善色譜峰的分離度和拖尾現(xiàn)象。經(jīng)過反復(fù)調(diào)整梯度洗脫時間程序，最終確定了本文所采用的流動相系統(tǒng)和梯度洗脫時間程序。在該流動相條件下，8種待測成分的峰形基本對稱，與相鄰的色譜峰可達(dá)基線分離，確保了測定的專屬性和準(zhǔn)確性。

3.3 供試品溶液制備方法考察

在進行供試品溶液制備時，為考察不同制備方法對含量測定結(jié)果的影響，本課題組取杜仲皮和杜仲葉樣品，同時采用2015年版《中國藥典》（一部）中杜仲（皮）和杜仲葉項下含量測定中的相關(guān)方法進行供試品溶液制備。結(jié)果顯示，杜仲不同藥用部位樣品采用兩種供試品溶液方法制備后，所測各種成分的含量結(jié)果基本一致?？紤]到杜仲（皮）項下的供試品溶液制備方法需采用氯仿脫脂后再以甲醇回流提取，操作繁瑣、費時，且誤差較大;而杜仲葉項下方法直接采用50%甲醇超聲制備，方法簡便、快速，且8個待測成分含量測定精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度等均較好，故選擇與藥典一致的方法制備杜仲葉供試品溶液。

4 結(jié)語

2015年版《中國藥典》（一部）中杜仲葉項下的含量測定僅以綠原酸為指標(biāo)，而本研究建立了可同時測定杜仲葉中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、兒茶素、綠原酸、車葉草苷、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷等8個環(huán)烯醚萜類、苯丙素類或黃酮類成分含量的HPLC法。結(jié)果顯示，各批次杜仲葉樣品中綠原酸的含量均符合藥典規(guī)定;所建立的8種不同成分的含量測定方法操作簡便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度良好，可為更科學(xué)、全面地評價杜仲葉質(zhì)量提供方法基礎(chǔ)。但本研究也同時發(fā)現(xiàn)，不同采集時間、不同種植品種的杜仲葉中上述8種成分含量波動較大，其原因是否與種植品種或采集時間的差異有關(guān)，尚有待收集更多樣品進行比較研究并驗證。此外，本研究對同一來源的杜仲（皮）進行了含量測定，發(fā)現(xiàn)杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷含量明顯高于杜仲葉，杜仲葉中綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸含量則明顯高于杜仲皮，提示杜仲的不同藥用部位（皮、葉）中的成分組成及含量存在明顯的差異，二者所含化學(xué)成分的差異是否對其藥理作用、臨床功效產(chǎn)生影響，有待今后進一步探索。

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（收稿日期：2019-06-13 修回日期：2019-11-01）

（編輯：段思怡）