張寬朝 張 琛 阮 飛 何孔泉 楊 超

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036)

食用色素是用于改善食品質(zhì)量和外觀的重要食品添加劑[1]。近年來，在食品工業(yè)、制藥和化妝品行業(yè)中食用色素被廣泛應(yīng)用。根據(jù)來源可將食用色素分為合成色素和天然色素兩類。然而，隨著醫(yī)學(xué)毒理學(xué)和生物學(xué)研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)合成色素中的不少品種具有慢性毒性和致癌性，因此天然色素的應(yīng)用和探索受到了更多的關(guān)注[2]。從生物體內(nèi)提取的天然色素，由于較高的安全性，另外還含有人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素或其近似的化學(xué)類似物，具有很大的生物活性和對人體至關(guān)重要的抗氧化活性，逐漸為人們所重視，研究逐步深入[3,4]。棕色素是色素中的黃色物質(zhì)與紅色物質(zhì)混合成的一類復(fù)合色素，常來源于植物成熟的果實(shí)、種子、果殼或果核中，可用于著色棕色食品[5]。目前，對龍眼、金櫻子、榛殼、山核桃殼、板栗殼等中的棕色素進(jìn)行了研究[6-10]。

油茶(CamelliaoleiferaAbel),山茶科山茶屬常綠小喬木，分布于中國南方的18個省市。油茶是我國特有的木本油料作物，據(jù)“山海經(jīng)”記載，油茶種子已在中國使用超過二千多年[11]。油茶的種子主要用于油脂提取，油茶籽還含有大量的生物活性多糖和蛋白質(zhì)、脂肪、鞣酸、咖啡因、皂苷等其他活性成分，因此，可以進(jìn)一步挖掘油茶籽的綜合開發(fā)利用價值[12]。油茶籽殼為油茶籽質(zhì)地堅(jiān)硬的外種皮，主要含有木質(zhì)素、多縮戊糖、色素和一定含量的抗氧化活性物質(zhì)[13,14]。針對油茶籽殼的利用研究主要集中在活性炭、木糖醇和糠醛等產(chǎn)品的制備上，利用率較低[15]。劉曉庚[16]分析油茶副產(chǎn)品成分時發(fā)現(xiàn)，油茶果殼色素、茶餅粕色素的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好。凌誠德等研究表明，國產(chǎn)食用天然色素油茶果殼棕色素具有巧克力樣色澤，未發(fā)現(xiàn)明顯的急性和亞急性毒性，可以作為一種很有前途的安全天然食用色素[17]。油茶籽殼中含有的色素成分尚未能得到有效地開發(fā)和應(yīng)用，對油茶籽殼棕色素的提取等的研究鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討油茶籽殼棕色素的提取工藝，并通過響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝條件，同時采用體外實(shí)驗(yàn)測定提取棕色素的抗氧化活性，以期為油茶籽殼綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成熟油茶籽：去仁留殼，60 ℃烘干，粉碎機(jī)粉碎，得油茶籽殼粉末備用。

無水乙醇，甲醇，丙酮，乙酸乙酯，過氧化氫，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵等均為分析純。

FW100型高速萬能粉碎機(jī)，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器， DHG-9425A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，UV-1600紫外-可見分光光度計(jì)，HH-2J數(shù)顯恒溫水浴鍋， JA2003C 電子天平。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

工藝流程：油茶籽殼粉末→溶劑浸提→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮→真空干燥→產(chǎn)品稱重。

棕色素含量(mg/g)=棕色素產(chǎn)品質(zhì)量/油茶籽殼質(zhì)量×1000。

1.2.2 不同提取溶劑比較

稱取5.000 0 g油茶籽殼粉末，在液料比(10 ∶1)、提取溫度(50 ℃)、提取時間(1 h)的條件下，分別用甲醇、50%乙醇、純水、丙酮和乙酸乙酯作為提取溶劑，按提取工藝對油茶籽殼進(jìn)行棕色素提取，研究不同溶劑對提取率的影響。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

溫度對提取率的影響：設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件為乙醇濃度50%、液料比10 ∶1、提取時間1 h，研究提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對油茶籽殼棕色素提取的影響。

液料比對提取率的影響：通過上述實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度，設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時間1 h，研究液料比(6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1、14 ∶1)對油茶籽殼棕色素提取的影響。

乙醇濃度對提取率的影響：通過上述實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度、液料比，設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件為提取時間1 h，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)對油茶籽殼棕色素提取的影響。

提取時間對提取率的影響：通過上述實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度、液料比、乙醇濃度，研究提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)對油茶籽殼棕色素提取的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取溫度(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、提取時間(D)4個因素作為自變量，編碼水平為-1、0 和1，以油茶籽殼棕色素提取含量為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)因素編碼及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.5 抗氧化能力測定

式中：A0是鄰苯三酚自氧化速率；A1是樣品溶液加入后的鄰苯三酚氧化速率。

清除H2O2能力的測定：參考紫外分光光度法[19]。

還原能力的測定：參考鐵氰化鉀法[20]。700 nm處測定反應(yīng)體系的吸光度，吸光度值越高,還原能力則越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑比較

采用甲醇、50%乙醇、純水、丙酮和乙酸乙酯作為提取溶劑，分別對油茶籽殼棕色素進(jìn)行提取。結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，50%乙醇作為提取溶劑時油茶籽殼棕色素提取率最高，丙酮溶液次之，其后依次是甲醇、純水、乙酸乙酯。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對油茶籽殼棕色素提取的影響

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

溫度、液料比、乙醇濃度、提取時間對油茶籽殼棕色素提取的影響如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比10 ∶1、提取時間1 h時，油茶籽殼棕色素的提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，可能色素分子運(yùn)動的速度加快，有利于油茶籽殼棕色素的溶解和釋放。提取溫度為40 ℃時，油茶籽殼棕色素提取率達(dá)到最大。其后，隨著溫度的升高，可能伴隨乙醇揮發(fā)加快以及色素化學(xué)結(jié)構(gòu)的破壞，棕色素提取率有所下降。由此，選用40 ℃為最佳提取溫度。

圖2 不同因素對油茶籽殼棕色素提取的影響

實(shí)驗(yàn)條件為提取溫度40 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時間1 h時，當(dāng)液料比小于10 ∶1時，隨著液料比的增大，油茶籽殼棕色素提取率逐漸增大，這可能是由于液料比的增加促進(jìn)了更多的棕色素溶解在乙醇溶液中。當(dāng)液料比大于10 ∶1時，可能因?yàn)樽厣匾呀咏咳艹?，油茶籽殼棕色素提取率略有下降。由此，從油茶籽殼棕色素提取含量和原料?jié)省方面考慮，選用10 ∶1為最佳提取液料比。

實(shí)驗(yàn)條件為提取溫度40 ℃、液料比10 ∶1、提取時間1 h時，隨著乙醇濃度的增加，油茶籽殼棕色素提取含量增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時，棕色素的提取量開始下降。這可能是因?yàn)橐掖紳舛仍礁?，對?xì)胞的破壞程度越大，越有利于棕色素的析出，但當(dāng)乙醇濃度過高時，可能會導(dǎo)致棕色素的部分降解，從而造成棕色素提取含量的下降。由此，選用60%乙醇體積分?jǐn)?shù)為最佳提取濃度。

以提取溫度40 ℃、液料比10 ∶1、乙醇濃度60%為實(shí)驗(yàn)條件，油茶籽殼棕色素提取質(zhì)量隨提取時間的增加呈現(xiàn)先增加后上升的趨勢。提取時間為2.0 h時，油茶籽殼棕色素提取含量最高。其后，提取時間延長，棕色素發(fā)生氧化分解，導(dǎo)致提取含量開始降低。由此，選用提取時間2.0 h為最佳提取時間。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面分析方案

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)響應(yīng)結(jié)果

2.3.2 方差分析及顯著性檢驗(yàn)

用Design-Expert.8.0.6軟件對表2所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型方差分析。分析結(jié)果如表3所示。對各因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程為：

油茶籽殼棕色素提取含量=-79.311 3+1.191 18A+5.446 25B+0.940 65C+14.405 67D-0.022 75AB-4.75×10-4AC-0.166AD-0.019 25BC+0.767 5BD-0.013CD-8.532 5×10-3A2-0.226 44B2-5.382 5×10-3C2-4.103D2。

各因素的F值可以直觀反映各因素影響的大小，F(xiàn)值越大，其對響應(yīng)值的影響也越大。對各因素影響程度的分析可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A=0.048，F(xiàn)B=2.085×10-3，F(xiàn)C=15.07，F(xiàn)D=51.26，各因素對油茶籽殼棕色素提取含量影響大小順序?yàn)樘崛r間>乙醇濃度>溫度>液料比。

2.3.3 因素交互作用分析

為進(jìn)一步分析溫度、液料比、乙醇濃度、提取時間對響應(yīng)值的影響，固定其中任兩個因素，繪制另兩個因素之間交互作用的等高線和響應(yīng)面圖，可視化分析各因素間的交互作用。

表3 回歸模型方差分析

注:模型的確定系數(shù)R2=0.899 4,模型的調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.798 8。**差異極顯著(P<0.01)；*差異顯著 (P<0.05)。

從等高線和響應(yīng)面圖可以看出各個因素之間的相互作用，直觀反映各自變量對響應(yīng)值的影響。等高線形狀和響應(yīng)面曲面坡度可以反映自變量交互效應(yīng)的強(qiáng)度。等高線形狀若趨向于橢圓形，則兩自變量之間交互作用明顯，若趨于圓形則相反；等高線密度大，表明因素間交互作用較強(qiáng)。響應(yīng)面曲面的傾斜度越高，即坡度越陡，說明因素間交互作用越顯著，同時，隨著變化趨勢的劇烈增加，曲面顏色也呈加深趨勢。由此，分析可知，溫度與提取時間、液料比與提取時間的交互作用對響應(yīng)值油茶籽殼棕色素提取含量的影響顯著(如圖3、圖4所示)，其他因素交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著。因素交互作用的分析結(jié)果驗(yàn)證了回歸模型方差分析。

2.3.4 最優(yōu)工藝條件確定與模型驗(yàn)證

通過軟件對方程進(jìn)一步分析得出，提取的最佳條件為提取溫度33.98 ℃，液料比10.99 ∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)63.82%、提取時間1.99 h，在此條件下提取率的預(yù)測值為15.23%。由于對條件可操作性考慮，將最佳提取工藝條件修正為提取溫度35 ℃、液料比11 ∶1、乙醇濃度65%、提取時間2h，經(jīng) 3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到提取率為15.09%，與預(yù)測值相偏差為0.91%，說明通過響應(yīng)面優(yōu)化后的提取條件參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)價值。

圖3 溫度及提取時間交互作用對油茶籽殼棕色素提取率的等高線和響應(yīng)面圖

圖4 液料比及提取時間交互作用對油茶籽殼棕色素提取率的等高線和響應(yīng)面圖

2.4 油茶籽殼棕色素抗氧化能力測定

圖5 油茶籽殼棕色素清除能力、清除H2O2能力及還原能力

在質(zhì)量濃度10.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)，隨著溶液質(zhì)量濃度的增加，油茶籽殼棕色素對過氧化氫的清除率也隨之增高。當(dāng)質(zhì)量濃度大于60.0 μg/mL時，油茶籽殼棕色素對過氧化氫的清除率趨向于平緩，基本維持在35%左右。

在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，油茶籽殼棕色素溶液具有良好的還原性能力，可作為良好的電子供應(yīng)者。隨著棕色素質(zhì)量濃度的最大，其還原能力也隨之增強(qiáng)。

3 結(jié)論

以油茶籽殼為原料，考察了提取溫度、液料比、乙醇濃度、提取時間4個因素對棕色素提取的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了油茶籽殼棕色素提取工藝。結(jié)果表明，影響油茶籽殼棕色素提取含量高低的因素主次順序?yàn)樘崛r間>乙醇濃度>溫度>液料比，溫度與提取時間、液料比與提取時間的交互作用顯著。最佳提取工藝條件為提取溫度35 ℃、液料比11 ∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間2h。在此條件下，得到油茶籽殼棕色素提取率為15.09%，與預(yù)測值基本一致。