何嘉敏,于蘭,于新,*,劉學云,江芳,王萍,郭靖

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工與食品學院,廣東 廣州, 510225)2(武漢天天好生物制品有限公司,湖北 武漢, 430090)

采用益生菌發(fā)酵技術(shù)研發(fā)具有保健功能的發(fā)酵果蔬汁,不僅豐富了果蔬制品的種類,增加了果蔬制品的保健作用,更改善了果蔬制品的風味,使果蔬加工產(chǎn)業(yè)有了快速的發(fā)展[1]。

甘蔗(Saccharumofficinarum)、番茄(Lycopersiconesculentum)、胡蘿卜(Daucuscarota)均是我國物美價廉的果蔬,且三者均含有多種可溶性糖、氨基酸、人體必需的微量元素及多種對人體有益的有機酸等物質(zhì)[2-3]。甘蔗含有具抗氧化作用的多酚類物質(zhì)及較高的糖類物質(zhì)可以為發(fā)酵提供碳源；番茄含有具抗氧化和增強免疫力的番茄紅素，番茄汁也是嗜酸乳桿菌的促生長因子[4-9]。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn),這3種復(fù)合果蔬經(jīng)過益生菌發(fā)酵之后,能夠產(chǎn)生較好的揮發(fā)性成分,而揮發(fā)性成分是評價果蔬汁感官質(zhì)量的重要指標之一[10]。

束文秀等[11]采用靜態(tài)-頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法,測定胡柚汁經(jīng)此2種乳酸菌發(fā)酵后揮發(fā)性成分和相對含量變化。本試驗在前期益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上,采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析復(fù)合果蔬汁益生菌發(fā)酵前后揮發(fā)性成分,并對頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法進行優(yōu)化。為進一步提高和監(jiān)控發(fā)酵果蔬汁制品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗、番茄及胡蘿卜,購于家樂福；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),購于丹尼斯克(中國)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD100-3B電子分析天平,上海精科天美科學儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司；手動SPME進樣器，美國Supelco公司；Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene(PDMS/DVB)萃取頭，美國Supelco公司；Agilent Technologies 6890-5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵果蔬汁的制備

原料預(yù)處理：將甘蔗清洗、瀝干，用甘蔗機榨汁備用；將胡蘿卜、番茄去蒂，清洗、瀝干、切塊，用榨汁機榨汁，酶解后備用。

工藝流程：

按V(甘蔗汁)∶V(番茄漿)V∶(胡蘿卜漿)=5∶1∶2裝入500 mL玻璃瓶→酶解→80目濾布過濾→調(diào)配至pH 6.7→按V(嗜酸乳桿菌)∶V(嗜熱鏈球菌)∶V(植物乳桿菌)=3∶2∶1,接種量為3%→38 ℃ 恒溫發(fā)酵→益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁。

操作要點：試驗用具都需事先消毒,接種需在無菌條件下。

1.3.2 固相微萃取條件的優(yōu)化

1.3.2.1 萃取溫度的選擇

其他萃取條件不變,將萃取溫度分別設(shè)定為40、45、50、55、60 ℃,啟動儀器采集數(shù)據(jù),每個樣品重復(fù)3次,取平均值。

1.3.2.2 萃取時間的選擇

其他萃取條件不變,將萃取時間分別設(shè)定為20、30、40、50、60 min，啟動儀器采集數(shù)據(jù),每個樣品重復(fù)3次,取平均值。

1.3.2.3 NaCl的加入量

其他萃取條件不變,NaCl的加入量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，啟動儀器采集數(shù)據(jù),每個樣品重復(fù)3次,取平均值。

1.3.3 GC-MS參數(shù)條件

色譜條件：DB-5ms柱石英毛細管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；萃取頭熱解析溫度為250 ℃,時間為3 min,不分流模式。進樣口溫度250 ℃；起始溫度50 ℃,保持1 min；然后以2 ℃/min的速度升溫到180 ℃,保持4 min；再以2 ℃/min的升溫速度升溫到180 ℃,保持4 min。載氣為He,流量1 mL/min。

質(zhì)譜條件：全掃模式,掃描質(zhì)量范圍為33～450m/z。電離方式為EI+,電子能量70 eV,燈絲發(fā)射電流350 pA,檢測器電壓350 V,離子源溫度230 ℃,接口溫度250 ℃[12-13]。每個樣品重復(fù)3次,取平均值。

1.3.4 揮發(fā)成分的定性定量

香氣成分采用Wiley7n.1質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合參考文獻[14-16]進行定性分析。用峰面積歸一化法進行各種香氣成分相對含量的計算,即各種香氣物質(zhì)的峰面積占總揮發(fā)性成分總出峰面積的百分數(shù)。每個樣品重復(fù)3次,取平均值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8.5和IBM SPSS 21.0處理試驗數(shù)據(jù),表中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溫度選擇

由圖1可知,隨萃取溫度的升高,總峰面積及總峰數(shù)先呈遞增趨勢,溫度達45 ℃為最高點后逐漸降低?？赡苁禽腿囟葘腿⌒Ч绊戄^大,溫度升高,加快揮發(fā)物質(zhì)的分子運動速率,有利于萃取頭對目標物的吸附[17]；當溫度過高,某些不穩(wěn)定物質(zhì)容易分解,影響研究結(jié)果[18]。所以選擇萃取溫度45 ℃。

圖1 萃取溫度對益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁飲料揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction effect of volatile components of sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics注：不同大小寫字母表示差異顯著。下同。

2.1.2 萃取時間選擇

由圖2可知萃取20～40 min時總峰面積及總峰數(shù)呈增長趨勢,40～60 min時總峰面積及總峰數(shù)變化不明顯。這可能是因為萃取時間較短時,樣品中揮發(fā)性物質(zhì)不能被萃取頭充分吸附[19]；萃取時間過長,可能導致樣品中某些不穩(wěn)定化合物發(fā)生氧化分解等副反應(yīng)[20]。故萃取時間應(yīng)設(shè)定為40 min。

圖2 萃取時間對益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁飲料揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction effect of volatile components from sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics

2.1.3 NaCl加入量

由圖3可知,NaCl加入量在0.0～1.0 mg/L時總峰面積及總峰數(shù)呈增長趨勢,NaCl加入量在1.0～3.0 mg/L時總峰面積及總峰數(shù)呈遞減趨勢。可能是因為適量加入NaCl產(chǎn)生鹽析效應(yīng)降低揮發(fā)性成分在水中的溶解度,有助于揮發(fā)性成分逸出,增加其在頂空瓶上空的濃度,增加萃取效率；過量加入NaCl,使基質(zhì)黏度增加,影響揮發(fā)性成分逸出,減少其在頂空瓶上空的濃度,降低萃取效率[21]。故本研究選擇NaCl加入量1.0 mg/L。

圖3 NaCl添加量對益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁飲料揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig.3 Effect of NaCl addition on extraction effect of volatile components from sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics

2.1.4 解吸時間選擇

由圖4可知,解析時間在2～4 min時總峰面積及總峰數(shù)呈增長趨勢,解析時間在4～5 min時總峰面積及總峰數(shù)呈平緩趨勢。可能是因為解析時間不足時,萃取頭上尚殘存部分揮發(fā)性化合物；解析時間過長時,部分物質(zhì)可能發(fā)生熱分解或聚合反應(yīng),降低檢測效率[22-23]。故本研究將解析時間設(shè)定為4 min。

圖4 解析時間對益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁飲料揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig.4 Effect of analytical time on extraction effect of volatile components from sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics

2.2 較優(yōu)條件下益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁飲料揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果

2.2.1 各類揮發(fā)性化合物的對比分析

根據(jù)圖5發(fā)酵前后總離子流圖及表1分類對比分析各類揮發(fā)性化合物。

a-發(fā)酵前；b-發(fā)酵后圖5 益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁飲料揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流Fig.5 Total ion flow diagram of volatile substances in sugarcane compound fruit and vegetable beverage fermented by probiotics

2.2.2 醇類化合物

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前檢查出10種醇類物質(zhì)，總含量12.782%；益生菌發(fā)酵后含12種，總含量為18.777%。發(fā)酵后比發(fā)酵前醇含量明顯增加，其中，已醇5.326%增加至7.326%、苯丙醇1.933%增加至2.439%、反-2-已烯醇1.089%增加至1.434%、1-戊烯-3-醇1.540%增加至2.528%，均具有果香氣味，對益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁飲料風味貢獻較大[24]。發(fā)酵之后減少了一種香氣成分異戊醇，其具有令人不愉快的雜醇氣息和辛辣味道[24]；發(fā)酵后比發(fā)酵前增加了3種醇類物質(zhì)：α-戊基肉桂醇具有甜的果香、辛香[24]；α-丙基苯乙醇具有水果、清香香氣[24]；苯乙醇具有香甜的玫瑰樣花香[25]等。

2.2.3 有機酸類化合物

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前檢查出7種有機酸類化合物，總含量為0.622%；發(fā)酵后含15種，總含量為13.657%。發(fā)酵之后酸類化合物急劇增長是因為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物。酸類化合物含量多的且可能香氣成分貢獻較大的有：乳酸(3.209%)具有溫和的令人愉快的酸味；丁酸(2.234%)果香香氣[24]；戊酸(1.523%) 水果香氣[24]；庚酸(0.215%～1.121%) 甜的、蠟香、水果的香氣[24]；甲酸(0.007%～1.234%)尖刺的酸、辣、醋香、果香香氣[24]等。

2.2.4 酯類化合物

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前檢測出酯類化合物5種，總含量為1.25%；發(fā)酵之后含12種，總含量為15.426%。這表明發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物及果蔬汁本身酸類化合物與醇類化合物發(fā)生某種酯化反應(yīng)生成大量酯類化合物。酯類化合物含量較多的且可能香氣成分貢獻較大的主要有：戊酸丁酯(0.102%～3.242%)具有甜的、水果、蜜餞、冰淇淋香氣；辛酸乙酯(2.429%)具有類似白蘭地的香味及甜味[26]；異丁酸乙酯(2.201%)具有甜的、水果、黃油、朗姆酒香氣；辛酸異戊酯(1.898%)具有甜的、水果、脂肪、青香香氣；γ-戊內(nèi)酯(1.507%) 具有水果椰子香氣等。

表1 益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前后主要揮發(fā)性成分及相對含量Table 1 Main volatile components and relative contents of probiotic fermentation sugarcane compound fruit and vegetable beverage before and after fermentation

續(xù)表1

編號保留時間/ min揮發(fā)性物質(zhì)相對含量/%發(fā)酵前發(fā)酵后447.3604-甲基聯(lián)苯0.4460.788458.7741-甲基-4-(1-甲基亞乙基) -環(huán)己烯-0.2564614.966月桂烯0.4461.0714728.792(E) -7,11-二甲基-3-亞甲基 - 1,6,10-十二碳三烯 0.459-4832.588羅勒烯0.1421.4024933.605金合歡烯 0.3071.5235037.6211,5,5-三甲基-6-亞甲基 - 環(huán)庚烷-0.2975138.709六甲基 -環(huán)三硅氧烷0.1560.234炔烴5230.0082,3-二氫-3-甲基 -呋喃 0.0220.531醛類533.365己醛 0.0400.6685413.6722-壬烯醛0.0650.4345517.878反-2-已烯醛0.2450.4655623.456肉豆蔻醛0.1940.5565725.4142-乙基丁醛-0.1345828.701正戊醛0.1200.4865930.0972,4-庚二烯醛0.1220.334酚類608.315丁香酚-0.784619.211異丁香酚-0.5626214.3132-甲氧基-4-甲基苯酚-0.2186317.7844-乙基愈創(chuàng)木酚0.2130.5866419.913麥芽酚-0.2876524.311乙基麥芽酚-0.473其他6624.165乙基香蘭素-2.3266731.428異丁基噻唑-1.231

注：“-”代表未檢出。

2.2.5 烴類化合物

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前檢測出烴類化合物10種，總含量為3.263%；發(fā)酵之后含10種，總含量為8.048%。發(fā)酵之后烴類化合物急劇增長是因為益生菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物。據(jù)文獻報道烴類化合物通常對風味貢獻較大的多為不飽和烴類[27]，所以發(fā)酵之后香氣成分貢獻較大的主要有：3,6-辛三烯(0.086%～0.554%)及羅勒烯(0.142%～1.402%)具有甜的、青香、熱帶水果、木香、萜烯香[24]氣；α-松油烯(0.159% ～0.269%)具有果香和木香氣味；d-檸檬烯(0.847%～1.654%)具有甜香、柑橘香、檸檬香；金合歡烯(0.307%～1.523%)具有萜香、青香、草香、藥草香氣味[24]；月桂烯(0.446%～1.071%)具有果香、木香、熱地水果香、木香氣味[24]。

2.2.6 醛類化合物

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前檢測出醛類化合物6種，總含量為0.812%；發(fā)酵之后含7種，總含量為3.61%。相對而言，醛類化合物氣味閾值通常比其同系醇類較低，含量也很低，但對整體的香氣都具有較大的貢獻[28-29]。這7種醛類化合物分別是[24]：己醛(0.040%～0.668%)具有青香、葉香、果香、木香；2-壬烯醛(0.065%～0.434%) 具有脂肪氣息、青香、蠟香、黃瓜香、甜瓜香；反-2-已烯醛(0.245%～0.465%)具有青香、果香、木香、辛香、脂肪香；肉豆蔻醛(0.194%～0.556%)具有脂肪香、蠟香、牛奶香、果香；2-乙基丁醛(0.134%)具有甜香、果香、青香，并帶有可可香韻；正戊醛(0.120%～0.486%)有微辛辣氣息，具果香、面包香；2,4-庚二烯醛(0.122%～0.334%) 具有青香、醛香。

2.2.7 酚類化合物

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前只檢測出1種酚類化合物，總含量為0.21%；發(fā)酵之后含6種，總含量為2.91%。由于益生菌的作用發(fā)酵使果蔬汁多酚含量增加，酚類物質(zhì)主要提高了飲料的陳香、果香、木香香韻。如丁香酚(0.784%)具有強烈的丁香辛香香氣[24]；異丁香酚(0.562%)具有甜辛香、木香及子丁香味道[24]；2-甲氧基-4-甲基苯酚(0.218%)具有辛香、藥香香氣[24]；4-乙基愈創(chuàng)木酚(0.213%～0.586%)天然存在于番茄中，發(fā)酵之后香味更加濃郁，具有辛香、藥香、木香及類似丁香香氣[24]；麥芽酚(0.287%)具有甜香、果香、焦糖香氣[24]；乙基麥芽酚(0.473%)具有甜白糖、焦糖、果醬香氣[24]。

2.2.8 其他

復(fù)合果蔬汁益生菌發(fā)酵前后檢測出乙基香蘭素(2.326%)具有香甜、巧克力氣味[30]；異丁基噻唑(1.231%)具有青香、蔬菜香、草香、番茄香，是原料的主體香[24]。

3 結(jié)論

本研究對采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析了甘蔗-番茄-胡蘿卜復(fù)合果蔬汁益生菌發(fā)酵前后揮發(fā)性成分方法做了優(yōu)化并進行檢測。結(jié)果顯示,復(fù)合果蔬汁益生菌發(fā)酵前后香氣成分發(fā)生很大變化,共鑒定出67種揮發(fā)性成分。發(fā)酵后新產(chǎn)生27種揮發(fā)性成分,消失了3種揮發(fā)性成分,相對含量也由發(fā)酵前的18.938%增加為67.904%。其中醇類化合物、酸類化合物、酯類化合物、烴類化合物、醛類化合物、酚類化合物均有顯著增加,還測定出其他香氣成分包括乙基香蘭素及異丁基噻唑。益生菌發(fā)酵改變了復(fù)合果蔬汁原本的香氣種類及含量,致使發(fā)酵后的復(fù)合果蔬風味發(fā)生了很大變化,比發(fā)酵前甘蔗-番茄-胡蘿卜復(fù)合果蔬汁更為醇香、濃郁、獨特,為產(chǎn)品增加感官附加值,可促進消費。此試驗為發(fā)酵果蔬風味物質(zhì)的研究提供了理論基礎(chǔ),并在產(chǎn)品品控方面發(fā)揮一定作用。但本研究還存在局限性,對不同果蔬及發(fā)酵果蔬香氣成分仍需進一步深入研究。