姚澤晨,張根義

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

植物乳桿菌屬乳酸菌,是一種厭氧或兼性厭氧的益生菌[1],適宜生長溫度為30～35 ℃。目前研究證實植物乳桿菌具有調節(jié)腸道菌群異常、預防腸道感染、增強免疫功能、調節(jié)消化道蠕動等益生功能[2]。研究表明益生菌到達腸道的數(shù)量須在107cfu/mL以上才能夠發(fā)揮其對腸道的益生作用。但植物乳桿菌對胃液的酸性環(huán)境敏感,在經胃腸液消化后[3-4],到達腸道的數(shù)量將顯著減少[5-6],活性驟失,并且由于條件的限制使得一些保護菌體的方式不能應用于大規(guī)模生產[7]。

采用新的技術以及方法對益生菌進行保護正在引起人們的關注,將益生菌膠囊化是保護其活性和數(shù)量較為有效的方式[7-8]。微膠囊材料可隔絕外界光、熱以及氧氣,可防止其對菌體產生不利影響[9-10],且與活性物質有較好的生物相容性,并且其材料對pH以及電解質濃度變化不敏感,穩(wěn)定性好,且易儲存[11]。

目前,較為常見的微膠囊包載材料為海藻酸鈉,因其形成的微膠囊表面孔徑較大,不能完全防止酸液進入,而且在較低的pH條件下,海藻酸鈉分子會降解,導致微膠囊穩(wěn)定性變差,因此單獨包載益生菌時,無法較好地抵抗胃腸液的破壞。復合包載材料制備微膠囊作為一種新型復合包載技術,包載效果有待研究,相關報道較少。由于阿拉伯木聚糖具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性,在漆酶作用下其體系內部會發(fā)生共價交聯(lián),形成具有三維網狀結構的凝膠[12]。因此本文擬定以海藻酸鈉與阿拉伯木聚糖為復合材料包載植物乳桿菌,通過檢測其包埋效率、包埋產率、耐酸性、腸溶性以及儲藏特性,對其保護性能進行評價,以期制備一種新型高效的微膠囊材料,為復合包載技術的應用提供可靠的理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌N1 實驗室保藏菌種;阿拉伯木聚糖 食品質量與安全中心實驗室;漆酶(38429) 中國上海Sigma-Aldrich;胰酶、海藻酸鈉、胃蛋白酶、其他試劑均為AR試劑級 國藥集團化學試劑有限公司;MRS營養(yǎng)肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基、磷酸緩沖液(PBS)、模擬胃液、模擬腸液[2]自行配制。

WX-75211-30數(shù)顯型齒輪泵 美國Cole-Parmer公司;H01-1A恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦科學儀器儀表制造有限公司;AR2130電子精密天平、MB120水分含量測定儀 奧豪斯國際貿易(上海)有限公司;MX-F渦旋振蕩器 大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司;RJ-LD-50G低速離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司;SCIENTZ-10ND冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;MLS-3750壓力蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo;ULTRA-TURRAX T8均質機 德國IKA公司;ULT1786超低溫冰箱 美國Asheville North Carolina;SU1510掃描電子顯微鏡 荷蘭FEI公司;S3500激光粒度分析儀 美國Microtrac公司;IS10傅里葉變化紅外光譜儀 美國Nicolet公司;UV-1280紫外可見分光光度計 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;PYX-DHS 500-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博泰實驗設備有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;THZ-82A水浴恒溫振蕩器 新瑞儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌N1的活化培養(yǎng) 取保存于-80 ℃冰箱的植物乳桿菌N1,于超凈工作臺中操作,在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),37 ℃,48 h,挑取單個菌落接種到MRS營養(yǎng)肉湯中,并在37 ℃下培養(yǎng)24 h,然后進行傳代培養(yǎng)2～3次,使其完全活化[13]。

1.2.2 植物乳桿菌N1生長曲線的繪制 將活化完全的植物乳桿菌N1按5%的比例接種到滅菌的MRS營養(yǎng)肉湯中,并在37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h,每2 h測定菌懸液OD600,繪制生長曲線。

1.2.3 濃縮菌懸液的制備 將活化完全的植物乳桿菌N1以3%的比例接種到200 mL滅菌的MRS營養(yǎng)肉湯中,37 ℃靜置培養(yǎng)16 h(對數(shù)期),然后將此培養(yǎng)液于4 ℃,4000 r/min,低速離心15 min收集菌泥,并用無菌水洗滌兩次,然后懸浮于10 mL 0.9%的無菌生理鹽水中,其菌體數(shù)量在1010～1011cfu/mL左右,后期可進行平板培養(yǎng)對其精確計數(shù),4 ℃儲存?zhèn)溆肹9]。

1.2.4 活菌平板計數(shù) 于超凈工作臺中,準確吸取1 mL菌懸液樣品,用0.9%滅菌生理鹽水梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8),然后吸取適當稀釋梯度的稀釋液1 mL,置于無菌培養(yǎng)皿中,并傾注溫度在40～45 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基13～15 mL,搖動平板,靜置固化,后將固化的平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)(48±2) h,觀察菌體的生長情況,并計數(shù)。

菌體數(shù)量計算:活菌數(shù)(cfu/mL)=涂布平板菌落數(shù)平均值×稀釋倍數(shù)

式(1)

1.2.5 植物乳桿菌微膠囊化的制備工藝 將海藻酸鈉(2%)溶液與阿拉伯木聚糖(3%)溶液分別滅菌,冷卻至室溫,將二者等體積混合[14]。然后將1.2.3制備的濃縮菌懸液5 mL加入到海藻酸鈉-阿拉伯木聚糖的混合溶液中,并加入漆酶[15](1.67 nkat/mg阿拉伯木聚糖),混合均勻后,通過數(shù)字齒輪驅動泵(12～15 r/min)將上述混合溶液流入到0.1 mol/L無菌CaCl2溶液中,靜置30 min,使得海藻酸鈉與Ca2+之間的交聯(lián)反應充分進行[16],最終形成海藻酸鈣-阿拉伯木聚糖凝膠球體。然后,無菌水洗滌微膠囊表面殘余溶液,滅菌紗布過濾收集微膠囊,靜置30 min,以排除多余的水分,將制備的微膠囊真空冷凍干燥,得到微膠囊粉末顆粒[9]。

1.3 植物乳桿菌微膠囊包載效果表征

1.3.1 微膠囊包埋產率、包埋效率及有效載量計算方法

微膠囊包埋產率(%)=(微膠囊中活菌個數(shù)/最初加入活菌個數(shù))×100

式(2)

微膠囊包埋效率(%)=(1-微膠囊表面活菌個數(shù)/微膠囊中活菌個數(shù))×100

式(3)

微膠囊有效載量(%)=(微膠囊中活菌數(shù)目/微膠囊質量)×100

式(4)

1.3.2 微膠囊中活菌數(shù)目的計算 取0.1 g微膠囊至20 mL的無菌PBS緩沖液(pH7.4)中,攪拌1 h后,用均質機分散20 s,使微膠囊包載的菌體能夠完全釋放后梯度稀釋,采用傾注平板法進行活菌精確計數(shù)[17]。

1.3.3 微膠囊表層活菌個數(shù)的測定 取0.1 g微膠囊至20 mL 0.9%無菌生理鹽水中,攪拌1 h后,使微膠囊表層以及可以泄露的菌體從表面溶出,過濾并收集濾液后梯度稀釋,并采用傾注平板法進行活菌精確計數(shù)。

1.4 植物乳桿菌微膠囊物化性質的表征

1.4.1 植物乳桿菌微膠囊粒徑分布的測定 取一定數(shù)量的微膠囊粉末顆粒,使用激光粒度分析儀對樣品的粒徑分布進行測量,將微膠囊粉末顆粒置于樣品槽中,經過對粉末顆粒群衍射,計算機處理得到粉末顆粒相應粒徑分布結果。

1.4.2 植物乳桿菌微膠囊含水量的測定 稱取1 g植物乳桿菌微膠囊,放入水分含量測定儀中,啟動儀器,測定時間為5 min,平行三次測定。

1.4.3 植物乳桿菌微膠囊密度的測定 稱取一定質量的植物乳桿菌微膠囊粉末顆粒,放置于10 mL的量筒中,反復多次晃動,靜置后測量粉末顆粒的體積,根據計算公式,單位體積微膠囊顆粒的質量為微膠囊的密度[18]。計算公式如下:

P=W/B

式(5)

式中：P表示堆密度(g/cm3)；W表示樣品質量(g)；V表示樣品體積(mL)。

1.4.4 植物乳桿菌微膠囊流動性的測定 通過休止角法測定植物乳桿菌微膠囊粉末顆粒的流動性,具體方法如下:固定干燥的玻璃漏斗于鐵架臺上,其正下方水平處放置一表面皿,后向漏斗中加入微膠囊粉末顆粒,經漏斗流出,在表面皿上形成自然錐體,再按計算公式計算休止角[3],計算公式如下:

A=arctan(2H/D)

式(6)

式中：A表示微膠囊休止角(°)；H表示錐體高度(cm)；D表示錐體直徑(cm)。

1.4.5 植物乳桿菌微膠囊形態(tài)觀察 使用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy,SEM)觀察微膠囊的表面結構。樣品制備方法如下:在樣品臺上附一雙面膠,將植物乳桿菌微膠囊粉末顆粒放于上面,并去除過多粉末,后樣品上噴金供SEM觀察,加速電壓為10 kV。

1.4.6 植物乳桿菌微膠囊及其壁材的紅外譜圖分析 取10 mg樣品顆粒,1 g溴化鉀,即為1∶100的比例,然后將二者放入研缽中進行充分研磨,取少量研磨好的粉末,用壓片機壓制(1 min)成透明的圓片狀,在400～4000波數(shù)內進行傅里葉紅外光譜掃描[19]。

1.5 植物乳桿菌微膠囊胃腸道模擬實驗

1.5.1 植物乳桿菌微膠囊胃液溶解性的測定 稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,將其置于盛有40 mL,pH1.5模擬胃液的錐形瓶中,(37±1) ℃、130 r/min恒溫水浴振蕩器分別處理0、1、2、3 h后,使用分光光度計在波長為600 nm處測定其透光率,根據透光率差異分析模擬胃液中微囊的裂解情況[20]。

1.5.2 植物乳桿菌微膠囊腸液溶解性的測定 稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,將其置于盛有40 mL,pH7.4模擬腸液的錐形瓶中,(37±1) ℃、130 r/min恒溫水浴振蕩器分別處理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h后,使用分光光度計在波長為600 nm處測定其透光率,根據透光率差異分析模擬腸液中微囊的裂解情況。

1.5.3 植物乳桿菌微膠囊的耐酸性 實驗組:稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,分別放入7個無菌離心管中,依次在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時,加入pH為1.5的人工胃液4.9 mL,然后將離心管放置于37 ℃的恒溫水浴振蕩器中振蕩,并在3 h時,將離心管一同取出,4000 r/min低速離心5 min收集微膠囊,然后將4.9 mL pH7.4的無菌PBS緩沖液加入離心管中,并在37 ℃下振蕩30 min,均質機分散20 s,完全破碎微膠囊使菌體釋放,然后用0.9%無菌生理鹽水進行梯度稀釋,選取適宜的稀釋度,使用傾注平板法進行精確計數(shù)[21]。

對照組:吸取1.2.3離心收集的濃縮菌懸液1 mL,加入pH1.5的模擬胃液9 mL,置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩培養(yǎng),依次在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時取樣,然后用0.9%滅菌生理鹽水進行梯度稀釋,選取合適的稀釋度,使用傾注平板法進行精確計數(shù)菌體數(shù)目。

1.5.4 植物乳桿菌微膠囊的釋放實驗 稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,置于無菌離心管中,加入30 mL pH7.4的模擬腸液,置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩培養(yǎng),依次在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時取樣,用0.9%滅菌生理鹽水進行梯度稀釋,選取適宜的稀釋度,使用傾注平板法進行精確計數(shù)。

1.5.5 植物乳桿菌微膠囊連續(xù)胃腸道模擬實驗 實驗組:稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,分別放入滅菌的離心管中,向管中加入pH為1.5的人工胃液4.9 mL,將離心管置于37 ℃的恒溫水浴振蕩器中,130 r/min振蕩培養(yǎng),2 h后將上述離心管取出,吸取混合液0.1 mL,用0.9%無菌生理鹽水梯度稀釋,傾注平板法精確計數(shù)。將上述離心管4000 r/min低速離心5 min,收集沉淀物,并加入30 mL的pH7.4模擬腸液,37 ℃,130 r/min振蕩器中振蕩培養(yǎng),2 h時取出離心管,吸取混合液,用0.9%無菌生理鹽水梯度稀釋,使用傾注平板法精確計數(shù)。

對照組:取1.2.3制備的濃縮菌懸液0.1 mL,在相同處理條件下作對照試驗,平行進行3次實驗。

1.5.6 植物乳桿菌微膠囊的儲藏性實驗 將植物乳桿菌微膠囊分別放置于28、4以及-20 ℃的恒溫條件下儲藏7周。每周均使用模擬腸液將上述三種條件下的微膠囊溶解并進行梯度稀釋,運用傾注平板法測定三種溫度條件下,植物乳桿菌微膠囊中菌體的存活數(shù)量,用以評價其儲藏特性。

1.6 數(shù)據處理

以上實驗均重復進行3次，實驗所得數(shù)據用X(三組數(shù)據平均值)±S.D.(標準偏差)表示,采用SPSS 17.0(美國SPSS公司)統(tǒng)計軟件進行一元方差分析(One-way ANOVA),采用Duncan法進行顯著性檢驗,在顯著性水平α=0.05下進行分析。文中圖表中a、b、c等不同字母表示α=0.05水平下各實驗點具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌N1的生長曲線

植物乳桿菌生長曲線如圖1所示,植物乳桿菌在6 h時進入對數(shù)生長時期,16 h正式開始進入穩(wěn)定期,進入穩(wěn)定期的菌體細胞數(shù)量充足且活性較高,適宜收集用于后續(xù)實驗。

圖1 植物乳桿菌在MRS中的生長曲線(37℃)Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum in MRS(37 ℃)

2.2 植物乳桿菌微膠囊的包載效果

根據1.3方法及計算公式可得,微膠囊包埋產率為73.60%±0.01%,微膠囊包埋效率為81.27%±0.17%,微膠囊有效載量為(3.68±0.4)×1011cfu/g,產品呈淡黃色。

2.3 植物乳桿菌微膠囊物化性質

2.3.1 植物乳桿菌微膠囊的粒徑分布 使用激光粒度分析儀對未包載植物乳桿菌的微膠囊以及包載植物乳桿菌的微膠囊進行粒度分析,結果如圖2所示。

圖2 空白及載菌微膠囊粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution images of microcapsules without and with Lactobacillus plantarum

空白微膠囊粒徑分布為:800～600 μm占1.92%;599～500 μm占9.5%;499～400 μm占77.09%;399～300 μm占10.8%;299～200 μm占0.69%。載菌微膠囊粒徑分布為:800～600 μm占0.76%;599～500 μm占5.99%;499～400 μm占66.54%;399～300 μm占23.20%;299～200 μm占3.51%。同空白微膠囊相比,載菌微膠囊的粒徑普遍有所增大,推測是由于壁殼材料添加菌體細胞,使得微膠囊粒徑有所增加。

2.3.2 植物乳桿菌微膠囊的水分含量、密度以及流動性 如表1，植物乳桿菌微膠囊的水分含量為8.82%±0.01%,對于干燥的微生物制品來說,水分含量的多少是維持菌體數(shù)量以及活性的重要因素。Oliveira等[22]采用復凝聚法以酪蛋白和果膠為壁材材料用以包埋B.lactis和L.acidophilus,運用噴霧干燥的方法制備微膠囊,其水分含量分別為10.98%和9.58%。本實驗所制備的植物乳桿菌微膠囊水分含量較現(xiàn)有文獻報道的數(shù)據低,這樣將更有利于植物乳桿菌微膠囊的貯藏。在微膠囊的理化性質表征中,微膠囊密度對于微膠囊粉末的均勻分布具有重要影響,因此用堆密度法表征微膠囊粉末顆粒的密度,植物乳桿菌微膠囊密度為(0.25±0.01) g/cm3。植物乳桿菌微膠囊的休止角為(35.25±4.35) °,表明微膠囊的粘度小,流動性好,研究表明,休止角在30～45°范圍內的微膠囊粉末具有較好的流動性。

表1 植物乳桿菌微膠囊的水分含量、密度以及流動性Table 1 The moisture content,density and fluidity of Lactobacillus plantarum microcapsules

2.3.3 植物乳桿菌微膠囊的顯微形態(tài) 由于制作微膠囊的芯材,壁材以及制備方法的不同,因而微膠囊的粒徑分布范圍為幾微米到幾千微米之間[23],且各種方法制備出的微膠囊在外觀形態(tài),內部結構上均有較大差異。

從圖3和圖4中可以看出,空白微膠囊與載菌微膠囊結構緊密,表面沒有裂縫以及過多的褶皺,囊壁結構保持完整,二者由于真空冷凍干燥而脫水,整體出現(xiàn)干癟狀態(tài),當微膠囊吸水,仍可復原球形形狀,并且與空白微膠囊相比,載菌微膠囊表面布滿植物乳桿菌菌體,證明菌體數(shù)量充足,此微膠囊起到較好的載體作用。

圖3 空白微膠囊SEM圖像Fig.3 SEM images of microcapsules without Lactobacillus plantarum注：a:×500;b:×1000;圖4同。

圖4 載菌微膠囊SEM圖像Fig.4 SEM images of microcapsules with Lactobacillus plantarum

2.3.4 植物乳桿菌微膠囊及壁材的紅外譜圖 圖5是海藻酸鈣、阿拉伯木聚糖凝膠、海藻酸鈣-阿拉伯木聚糖凝膠(三者均不含菌)的紅外光譜(FT-IR)圖像,從圖5中可以看出,相比于譜圖a和b,譜圖c并未在官能團區(qū)增加明顯的吸收帶,表明在海藻酸鈣-阿拉伯木聚糖凝膠之間并未形成新的化學鍵,因此沒有產生新的吸收帶,可以推測阿拉伯木聚糖凝膠與海藻酸鈣間是物理性纏繞。

圖5 壁材的FT-IR光譜Fig.5 FT-IR spectrums of wall materials注:a:海藻酸鈣;b:阿拉伯木聚糖凝膠;c:海藻酸鈣-阿拉伯木聚糖凝膠。

2.4 植物乳桿菌微膠囊的胃腸道模擬實驗

2.4.1 植物乳桿菌微膠囊的胃液溶解性 植物乳桿菌經口進入人體后,首先需要抵御胃液的酸性環(huán)境,由于進食量、進食時間,食物組成以及進食者個體之間具有差異,使得人體胃液pH在1.5～5.0范圍內波動。從圖6可以看出,隨著處理時間的延長,雖然2～3 h的透光率與溶液初始透光率具有顯著性差異(p<0.05),但微膠囊在模擬胃液中處理3 h,僅有少量渾濁出現(xiàn),透光率從100%下降至96%,透光率的降低可能是由于微膠囊部分包埋不完全以及微膠囊表層部分植物乳桿菌泄露引起。絕大部分微膠囊保持正常形態(tài)而不崩解破碎,證明該微膠囊能夠給與其包埋的植物乳桿菌較好的保護環(huán)境,使其免受外部酸性環(huán)境的侵蝕,因此其中包載的植物乳桿菌有較高的存活率,絕大多數(shù)植物乳桿菌能夠通過胃液的酸性環(huán)境,順利進入腸道環(huán)境。

圖6 微膠囊胃液溶解性實驗Fig.6 Microcapsule gastric fluid solubility test

2.4.2 植物乳桿菌微膠囊的腸液溶解性 腸溶性是指物質在胃液的酸性環(huán)境中2 h不溶解,在腸液中1 h內溶解,較為理想的腸溶性產品在十二指腸就會開始出現(xiàn)裂解的情況。本次實驗選擇pH為7.4的模擬腸液進行實驗。從圖7可以看出,隨著處理時間的延長,0.5～2.0 h的透光率與溶液最初的(0 h)透光率具有顯著性差異(p<0.05),透光率從52.7%下降至2.66%,并且透光率在1 h后基本保持不變。將微膠囊在腸液中處理2 h后,腸液中基本無固體顆粒存在,微膠囊裂解完全,其中微膠囊表層以及內部包埋的植物乳桿菌得到充分釋放,微膠囊在腸液中有足夠的時間充分釋放其中包載的植物乳桿菌,具有較好的腸溶性。

圖7 微膠囊的腸液溶解性實驗Fig.7 Microcapsule intestinal fluid solubility test

2.4.3 微膠囊的耐酸性 按1.5.3進行植物乳桿菌微膠囊的耐酸性評價,結果如圖8所示,菌懸液的植物乳桿菌數(shù)量在pH1.5的胃液環(huán)境下3 h下降了6.4lg(cfu/mL)。而微膠囊包埋的植物乳桿菌數(shù)量在pH1.5的胃液環(huán)境下3 h僅僅下降了1.2lg(cfu/mL),3 h時植物乳桿菌數(shù)量仍有2.06×108cfu/mL,上述結果表明,與植物乳桿菌菌懸液相比,植物乳桿菌微膠囊能夠不受胃液的影響,有助于其包載的植物乳桿菌順利進入腸道。

圖8 植物乳桿菌微膠囊在模擬胃液(pH1.5)中的存活情況Fig.8 Survival of Lactobacillus plantarum microcapsules in simulated gastric fluid(pH1.5)

2.4.4 微膠囊的釋放實驗 植物乳桿菌作為一種益生菌只有順利進入腸道,且擁有足夠的數(shù)量,才能夠影響腸道菌群,發(fā)揮其益生作用,因而需要考慮植物乳桿菌微膠囊在模擬腸液中的釋放情況。按1.5.4的方法評價植物乳桿菌微膠囊的釋放特性,實驗結果如圖9所示。阿拉伯木聚糖與海藻酸鈉為壁材的植物乳桿菌微膠囊在模擬腸液中消化時,1 h左右基本能夠實現(xiàn)完全釋放其包載的植物乳桿菌,并且在之后的1～3 h,釋放的植物乳桿菌數(shù)量變化幅度較小,說明植物乳桿菌微膠囊可以實現(xiàn)在腸道中的充分釋放。

圖9 植物乳桿菌微膠囊在模擬腸液中(pH7.4)的釋放Fig.9 Release of Lactobacillus plantarum microcapsules in simulated intestinal fluid(pH7.4)

2.4.5 植物乳桿菌微膠囊連續(xù)胃腸道耐受實驗 由圖10可知,在連續(xù)胃腸道模擬實驗中,植物乳桿菌菌懸液經過人體消化液的處理后,菌體濃度下降5.6lg(cfu/mL),與原始菌體數(shù)目相比具有顯著性差異(p<0.05),其中胃液的酸性環(huán)境對菌體細胞破壞性最大。在相同的處理條件下,微膠囊化的植物乳桿菌在整個胃腸道模擬實驗中,菌體濃度僅下降0.5lg(cfu/mL),在經過胃液時菌體濃度略微下降,主要是存在于微膠囊表層以及不完全包埋的植物乳桿菌泄露導致菌體數(shù)量有所下降。由此可見,采用微膠囊包載植物乳桿菌,可顯著提升菌體的存活數(shù)量,使其絕大部分能順利到達腸道,從而能夠發(fā)揮益生功效,促進腸道健康。

圖10 菌懸液以及植物乳桿菌微膠囊對模擬胃腸道的耐受性Fig.10 Tolerance of bacterial suspension and Lactobacillus plantarum microcapsules to the simulated gastrointestinal tract

2.4.6 植物乳桿菌微膠囊的儲藏性實驗 為了評價植物乳桿菌微膠囊的儲藏穩(wěn)定性即貨架穩(wěn)定性,我們選取4、28以及-20 ℃的儲存條件連續(xù)存放7周,用以研究微膠囊化植物乳桿菌的存活情況,實驗結果如圖11所示。隨著儲藏時間的延長,微膠囊中菌體存活數(shù)量在不斷下降,其中在28 ℃的條件下,微膠囊中的活菌數(shù)在7周內,下降了5.2lg(cfu/mL),而在4以及-20 ℃條件下,相同時間內活菌數(shù)分別下降了1.7lg和1.2lg(cfu/mL)。實驗結果表明微膠囊包埋的植物乳桿菌具有較長的儲藏時間且呈現(xiàn)出儲藏效果:-20 ℃>4 ℃>28 ℃的趨勢,由此也證明植物乳桿菌需要在較低的儲藏溫度下進行保藏,以保證其有足夠的活菌數(shù)量和活力。

圖11 植物乳桿菌微膠囊在4、28和-20℃的儲藏穩(wěn)定性Fig.11 Storage stability of Lactobacillus plantarum microcapsules at 4,28 and -20 ℃

3 結論

本研究表明,以海藻酸鈉和阿拉伯木聚糖為壁材復合包載植物乳桿菌制備微膠囊,該微膠囊具有較低的胃液溶解性和較高的腸液溶解性,能夠保護其包載的菌體免受胃液侵蝕,順利到達腸道,并且能夠在腸液中充分釋放。阿拉伯木聚糖具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性,從而避免單獨使用海藻酸鈉包埋造成的微膠囊易降解破壞引起的突釋問題。SEM圖像表明,空白及載菌微膠囊結構緊密,表面沒有裂縫,囊壁結構保持完整,復合包載改善了單一包載存在的微膠囊表面孔徑過大的問題。儲藏性實驗表明,-20 ℃為最佳的儲存條件。本研究對于采用復合材料包載益生菌制備微膠囊,從而增強益生菌的存活率和耐受性,具有一定的參考價值和實踐意義。