劉 偉，李薔薇，王 靜，潘躍銀

我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中位居第一位，而其中非小細(xì)胞肺癌(non- small cell lung cancer，NSCLC)所占比例最多，約為80%～85%[1-2]。腺癌約占非小細(xì)胞肺癌的55%左右，其最常見的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因敏感性突變[3]。約65%EGFR突變的肺腺癌患者使用第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR- tyrosine kinase inhibitors,EGFR- TKIs)10～14個(gè)月后出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥[4]。因T790M突變導(dǎo)致耐藥的患者改用第三代EGFR- TKI奧希替尼(osimertinib)后無進(jìn)展生存期也僅為8～18個(gè)月，最終仍不可避免出現(xiàn)耐藥[5]。

天然類黃酮槲皮素(quercetin)所具有的抗腫瘤特性已受到研究人員的關(guān)注和認(rèn)可[6]。第一代EGFR- TKI吉非替尼聯(lián)合槲皮素表現(xiàn)出顯著的協(xié)同抗腫瘤作用[7]。該研究的目的是探討奧希替尼與槲皮素聯(lián)合使用后對(duì)NCI- H1975細(xì)胞增殖以及凋亡潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料H1975細(xì)胞株由廣東省肺癌研究所無償饋贈(zèng)。奧希替尼購自英國(guó)Astra Zeneca公司；槲皮素、二甲基亞砜(DMSO)購于美國(guó)Sigma公司；MTT、ECL檢測(cè)試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、兔抗人β- actin多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(即二抗)購于北京索萊寶公司；RPMI- 1640培養(yǎng)液購自美國(guó)HyClone公司；Annexin V- FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于南京建成公司；胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液、SDS- PAGE凝膠快速配制試劑盒和RIPA裂解液均購自北京碧云天生物公司；兔抗人磷酸化Akt(p- Akt)單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人Bcl- 2單克隆抗體、兔抗人蛋白激酶B(Akt)多克隆抗體購自于英國(guó)abcam公司。

1.2 藥物配制與保存RPMI- 1640培養(yǎng)液按10%FBS的體積分?jǐn)?shù)、1×105U/L青霉素、1×105μg/L鏈霉素濃度配制保存于4 ℃冰箱。奧希替尼用PBS溶解，而槲皮素則用DMSO溶解，置于-20 ℃冰箱中保存。使用時(shí)，根據(jù)所需實(shí)驗(yàn)濃度用培養(yǎng)液予以稀釋，且DMSO最終的體積濃度需<0.1%。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)H1975細(xì)胞置于RPMI- 1640新鮮培養(yǎng)基中，保存于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。H1975細(xì)胞的傳代時(shí)間為48～72 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 使用MTT法檢測(cè)奧希替尼聯(lián)合槲皮素對(duì)H1975細(xì)胞增殖的影響將H1975細(xì)胞消化混勻接種于96孔板(各孔細(xì)胞數(shù)5×103)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用PBS將奧希替尼稀釋成2.625、5.25、10.5、21、42、84 μmol/L濃度梯度組，同樣用DMSO分別將槲皮素稀釋成15.625、31.25、62.5、125、250、500 mmol/L濃度梯度組。再用RPMI- 1640培養(yǎng)基按1 ∶1 000分別稀釋各濃度組的奧希替尼至終濃度為2.625、5.25、10.5、21、42、84 nmol/L、各濃度組的槲皮素至終濃度為15.625、31.25、62.5、125、250、500 μmol/L。同時(shí)將各濃度組的奧希替尼和槲皮素在同一管中稀釋1 000倍，即為奧希替尼和槲皮素聯(lián)合組。將原孔培養(yǎng)基棄去，3塊96孔板分別加入稀釋后的奧希替尼、槲皮素及兩藥聯(lián)合組，每個(gè)稀釋度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并相應(yīng)設(shè)置 PBS和DMSO對(duì)照組以及空白對(duì)照組。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μl MTT(5 g/L)溶液。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育4 h后，使用1 ml注射器小心吸走各孔中的上清液，每孔加入100 μl DMSO(200 μl/孔)，搖床搖動(dòng)15 min。使用酶標(biāo)儀讀取各孔的吸光度(optical density，OD)值，根據(jù)OD值計(jì)算可得出奧希替尼及槲皮素對(duì)細(xì)胞的抑制率。利用GraphPad Prism5軟件計(jì)算兩藥半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)，使用Compu Syn軟件計(jì)算兩藥聯(lián)合指數(shù)(CI)值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)奧希替尼聯(lián)合槲皮素對(duì)NCI- H1975細(xì)胞整體凋亡的影響根據(jù)以上MTT檢測(cè)得出的結(jié)果，將奧希替尼、槲皮素稀釋至22 nmol/L和110 μmol/L，然后將H1975細(xì)胞分成4組：空白對(duì)照組、22 nmol/L 奧希替尼組、110 μmol/L槲皮素組、22 nmol/L奧希替尼+110 μmol/L槲皮素聯(lián)合組，將各組藥物加入6孔板中(每孔細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè))。處理72 h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，將6孔板中的各組細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至合適離心管內(nèi)，使用PBS液輕輕洗滌貼壁細(xì)胞2次，最后使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞。待細(xì)胞消化下來后，使用吸管將細(xì)胞加入此前收集細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管內(nèi)，稍稍混勻，離心后收集細(xì)胞沉淀，用PBS液輕輕使細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)； 取5×105個(gè)重懸的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，接種至新的6孔板中。各孔加入500 μl AnnexinⅤ- FITC/ PI凋亡檢測(cè)試劑盒中的結(jié)合液，輕輕使細(xì)胞重懸； 再加入5 μl Annexin V- FITC，輕輕混勻；最后加入5 μl碘化丙啶，再次混勻。隨后在室溫下將細(xì)胞用鋁箔包裹避光孵育10 min，然后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，待檢測(cè)完成后使用 FlowJo7.6.1 軟件分析出各分組細(xì)胞的凋亡率。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)奧希替尼聯(lián)合槲皮素作用后對(duì) H1975細(xì)胞中 p- Akt、Bcl- 2及Bax蛋白表達(dá)的影響收集22 nmol/L 奧希替尼、110 μmol/L 槲皮素、22 nmol/L奧希替尼+110 μmol/L 槲皮素作用72 h后細(xì)胞，以及空白對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)。步驟如下：將細(xì)胞消化，離心5 min收集細(xì)胞；用PBS液輕輕洗滌細(xì)胞2次，再次離心收集細(xì)胞沉淀；每管細(xì)胞沉淀加入100 μl RIPA(含1 mmol PMSF);將細(xì)胞吹勻，放置于冰上裂解30 min，在此期間每5 min將細(xì)胞上下顛倒操作1次，收集上清液即為裂解后蛋白液；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各蛋白質(zhì)的濃度后沸水煮15 min，低溫高速離心機(jī)離心10 min(12 000 r/min)。將各待測(cè)樣品加入8%～10%SDS- PAGE凝膠中電泳，然后冰浴下轉(zhuǎn)膜，接著在室溫條件下用5%脫脂奶粉將轉(zhuǎn)好的膜封閉2 h。加入按合適比例的抗體稀釋，其中anti- Bax按1 ∶3 000稀釋；anti- Bcl- 2按1 ∶1 000稀釋；anti- Akt按1 ∶3 000稀釋；anti- p- Akt按1 ∶5 000稀釋；anti- β- actin按1 ∶2 000稀釋。放置于4 ℃冰箱過夜，然后使用TBST液清洗3次，每隔10 min洗1次，之后加入二抗，抗體稀釋度為1 ∶3 000，室溫孵育約1 h，再次TBST液涮洗5次，每10 min洗1次。避光顯影后使用Image J軟件分析待測(cè)蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 奧希替尼聯(lián)合槲皮素作用對(duì)H1975細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)MTT結(jié)果顯示，作用72 h后，奧希替尼和槲皮素對(duì)H1975細(xì)胞的IC50值分別為(21.54±1.05) nmol/L和(109.7±1.08)μmol/L，細(xì)胞增殖的抑制率隨著藥物濃度的增加而增高，不同濃度的藥物對(duì)細(xì)胞抑制率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.34、101.25，P<0.01)(圖1)。 經(jīng)過計(jì)算，不同濃度的奧希替尼聯(lián)合槲皮素處理組CI值均<1，顯示出明確的協(xié)同抑制作用(圖2)。

圖1 MTT檢測(cè)奧希替尼和槲皮素對(duì)NSCLC H1975細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)

圖2 奧希替尼聯(lián)合槲皮素作用于NSCLC H1975細(xì)胞的CI值

2.2 各藥物處理組H1975 細(xì)胞的凋亡率經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，奧希替尼單藥和槲皮素單藥處理72 h后的H1975細(xì)胞的凋亡率分別為17.14%和23.5%，而兩藥聯(lián)合處理后為47.8%。與單藥組及對(duì)照組比較，奧希替尼和槲皮素聯(lián)合組細(xì)胞的凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=226.38，P<0.01) (圖3)。

2.3 奧希替尼和槲皮素處理后H1975細(xì)胞中Akt/p- Akt及Bcl- 2、Bax蛋白的表達(dá)根據(jù)Western blot檢測(cè)結(jié)果可見，與對(duì)照組、奧希替尼單藥處理組和槲皮素單藥處理組比較，雙藥聯(lián)合處理組中，H1975細(xì)胞中p- Akt蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=143.48，P<0.01)；聯(lián)合組bcl- 2蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.72，P<0.01)。與奧希替尼單藥組比較，奧希替尼和槲皮素兩藥組bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.31，P<0.01)(圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)奧希替尼聯(lián)合槲皮素對(duì)|NSCLC H1975 細(xì)胞凋亡率的影響

A:各組細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；B：各組細(xì)胞的凋亡率；a：對(duì)照組；b：奧希替尼單藥組；c：槲皮素單藥組；d：兩藥聯(lián)合組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與奧希替尼單藥組比較：##P<0.01；與槲皮素單藥組比較：&&P<0.01

3 討論

亞洲EGFR陽性的非小細(xì)胞肺癌在肺癌中所占比例為30%～40%[8]。分子靶向藥物的出現(xiàn)改變了該類型肺癌的治療模式，第一代EGFR- TKI初始取得良好療效，但很快出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，而最常見的耐藥原因?yàn)門790M突變(約60%)[9]。第三代EGFR- TKI奧希替尼可選擇性抑制T790M突變的EGFR[5]。而根據(jù)J?nne et al[10]對(duì)127例EGFR- T790M突變陽性的患者所進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，對(duì)奧希替尼的客觀緩解率達(dá)到61%，然而中位無進(jìn)展生存期僅僅為9.6個(gè)月。

圖4 Western blot檢測(cè)奧希替尼聯(lián)合槲皮素對(duì)NSCLC H1975細(xì)胞中目的蛋白(Akt、p- Akt、Bcl- 2及Bax)表達(dá)的影響

A:對(duì)照組;B:奧希替尼單藥組;C:槲皮素單藥組;D:兩藥聯(lián)合組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與兩藥聯(lián)合組比較：△△P<0.01

槲皮素是一種天然的類黃酮，槲皮素是一種天然類黃酮，存在于許多中草藥和食品中，如銀杏、三七、蘋果、洋蔥、綠茶等。其抗腫瘤特性貫穿于癌變的各個(gè)階段，從腫瘤發(fā)生到侵襲和轉(zhuǎn)移，并在不同的遺傳、生化和免疫方面發(fā)揮作用，因此在近年來引起了癌癥研究人員的關(guān)注[6]。研究[11]顯示，槲皮素通過不同類型癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，增強(qiáng)了紫杉醇和順鉑等幾種化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3- kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用的一類信號(hào)通路。在多種腫瘤中觀察到PI3K/Akt通路的過度激活，致使細(xì)胞凋亡受阻[12]。Wang et al[13]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)PI3K/Akt通路的活性被抑制時(shí)，順鉑耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增強(qiáng)。當(dāng)PI3K開始活化，AKT的蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑っ富钚缘膒- Akt，使得下游效應(yīng)分子中具有抗凋亡效應(yīng)的原癌基因如Bcl- 2的表達(dá)也隨之增加，從而抵抗放化療所引起的腫瘤細(xì)胞凋亡，而Bax是Bcl- 2的同源基因，其編碼的蛋白與Bcl- 2形成異源二聚體后可對(duì)Bcl- 2的表達(dá)產(chǎn)生阻抑作用，因而被認(rèn)為是一種重要的促細(xì)胞凋亡基因[14]。

本研究將第三代EGFR- TKI奧希替尼聯(lián)合槲皮素作用于T790M突變陽性的 H1975細(xì)胞，驗(yàn)證兩種藥物是否具有協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，奧希替尼聯(lián)合槲皮素可以更顯著地抑制細(xì)胞增殖，各實(shí)驗(yàn)組的CI值均<1，顯示出協(xié)同抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)還進(jìn)一步表明，奧希替尼聯(lián)合槲皮素組所引起的H1975細(xì)胞凋亡比單一藥物組更為明顯，表現(xiàn)出更強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，其機(jī)制可能為兩藥聯(lián)合后下調(diào)Akt的磷酸化水平，使得抗凋亡Bcl- 2蛋白的表達(dá)受到抑制而促凋亡Bax蛋白的表達(dá)量增加。由此可見，槲皮素聯(lián)合奧希替尼可對(duì) H1975細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抗增殖與促凋亡作用。當(dāng)然，本研究為體外實(shí)驗(yàn)，尚未建立動(dòng)物模型驗(yàn)證，其作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。