陳 雨，張亞琴，鄧秋林，楊正明，雷飛益，付羽萍，劉震東，陳興福*

（1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2 四川新荷花川貝母生態(tài)藥材有限公司，四川松潘 623301）

川貝母是名貴中藥材，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳、散結(jié)消癰鎮(zhèn)痛等功能[1]。川貝止咳糖漿、川貝母枇杷露和止咳化痰丸等中藥方劑均是以川貝母水煎劑制備。川貝母的主要活性成分為生物堿、核苷、皂苷、甾體和萜類等[2-3]，核苷類成分大多為水溶性成分[4-5]。貝母水溶性成分具有抗炎、抑制血小板凝聚、降壓、松弛平滑肌等作用[6-7]。貝母中核苷類成分的含量影響著川貝母的藥效，是評(píng)價(jià)人工栽培藥用貝母品質(zhì)的重要指標(biāo)。

施用化學(xué)肥料影響人工栽培藥用植物內(nèi)在成分的積累[8]。研究表明，微量元素肥料可以有效提高藥用植物的產(chǎn)量和質(zhì)量。竇明明等[9]研究發(fā)現(xiàn)微量元素和氮磷鉀配施能有效地提高澤瀉的產(chǎn)量。張亞琴等[10]研究結(jié)果表明葉面噴施鋅、硼、鉬有利于川白芷中香豆素類成分的積累和品質(zhì)的提高。伍燕華等[11]研究表明噴施微量元素肥料對(duì)川貝母 (Fritillaria cirrhosaD. Don) ?；ū９视酗@著的提高，有利于提高川貝母的掛果率。

瓦布貝母 (Fritillaria unibracteataHsiao et K. C.Hsia var.wabuensis) 為百合科貝母屬植物，是藥材川貝母重要的基源植物品種之一，主要分布在四川西北部海拔2500～3600 m的灌木林和草叢中[12-13]。目前，瓦布貝母的栽培研究還處于初步階段，微量元素肥料對(duì)瓦布貝母中內(nèi)在成分的影響尚無(wú)報(bào)道。本研究采用三因素五水平二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，研究了鋅、硼、鉬微肥的配施對(duì)瓦布貝母核苷類成分的影響，為提高人工栽培瓦布貝母藥用品質(zhì)提供養(yǎng)分管理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為五年生瓦布貝母栽培品種，由四川省茂縣松坪溝鄉(xiāng)新荷花生態(tài)藥材有限公司川貝母標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)基地提供，供試材料經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳興福教授鑒定為百合科貝母屬植物瓦布貝母 (Fritillaria.unibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis)。

1.2 供試試劑與設(shè)備

供試試劑：鋅肥為硫酸鋅 (優(yōu)級(jí)純，ZnSO4≥98.0%)，硼肥為硼砂 (優(yōu)級(jí)純，Na2B4O7·10H2O ≥95%)，鉬肥為鉬酸銨 (優(yōu)級(jí)純，H8MoN2O4≥98.0%)，甲醇 (HPLC級(jí))，超純水等。尿嘧啶 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號(hào)N-024-150730)，胞苷 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號(hào)B-109-150715)，腺嘌呤 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號(hào)X-060-150801)，肌苷 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號(hào) J-059-150730)，胸苷 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號(hào) X-074-150715)，腺苷 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號(hào)X-022-151027) 購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；胸腺嘧啶 (HPLC ≥ 98%，生產(chǎn)批號(hào)PS161216-03)，尿嘧啶核苷 (HPLC ≥ 98%，生產(chǎn)批號(hào)PS1216-0100)，鳥(niǎo)嘌呤核苷 (HPLC ≥ 98%，生產(chǎn)批號(hào) PS1215-0100)，2′-脫氧核苷 (HPLC ≥ 98%，生產(chǎn)批號(hào)PS161216-02) 購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司。

試驗(yàn)儀器：Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀，JD300-3千分之一精密電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)，101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 (天津市泰斯特儀器有限公司)，DZKW-4電子恒溫水浴鍋 (北京中興偉業(yè)儀器有限公司) 等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在四川省茂縣松坪溝鄉(xiāng)新荷花生態(tài)藥材有限公司川貝母標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)地土壤基本養(yǎng)分狀況：pH 5.7、有機(jī)質(zhì) 53.6 g/kg、堿解氮 (N)490 mg/kg、速效鉀 (K) 168 mg/kg、有效磷 (P) 105 mg/kg、速效鋅 (Zn) 0.63 mg/kg、速效硼 (B) 1.10 mg/kg、速效鉬 (Mo) 0.12 mg/kg。

2016年8月中旬按四年生瓦布貝母種莖大小約為12 mm的鱗莖進(jìn)行栽種。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)面積為3 m2(1 m × 3 m)，行距15 cm，株距10 cm，每小區(qū)種植鱗莖180顆，并稱重。在栽培前施用15000 kg/hm2的農(nóng)家肥作為底肥，齊苗時(shí)和初花期分別追施復(fù)合肥 (N∶P2O5∶K2O = 15∶15∶15) 225 kg/hm2和300 kg/hm2。其余栽培管理與基地生產(chǎn)管理措施一致。

試驗(yàn)采用三因素五水平二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，設(shè)置鋅肥 (ZnSO4·7H2O)、硼肥 (硼砂)、鉬肥[(NH4)2Mo4O13] 3個(gè)因素，5個(gè)水平，共23個(gè)小區(qū)隨機(jī)排布。將每小區(qū)的微肥用量溶解于1000 mL水中，在川貝母現(xiàn)蕾期、初花期、盛花期、幼果期進(jìn)行微肥噴施處理，分別施用各微量元素肥料總量的20%、30%、30%、20%，盡量避免掉液[14]。在瓦布貝母植株倒苗后進(jìn)行采收，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)按照五點(diǎn)法進(jìn)行鱗莖采挖，每個(gè)點(diǎn)挖10顆，每個(gè)小區(qū)共采挖50顆。試驗(yàn)各因素水平編碼見(jiàn)表1。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施方案見(jiàn)表2。

表1 因素水平編碼表（kg/hm2）Table 1 Factor level table

1.4 色譜條件

色譜柱為 Dlamonsil C18柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為水 (A)-甲醇 (B)，梯度洗脫 (0～10 min，1%～5% B；10～15 min，5%～10% B；15～22 min，15%～17% B；22～26 min，17%～20% B)；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量20 μL。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施方案Table 2 Experimental design and implementation plan

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

分別精密稱取對(duì)照品尿嘧啶2.12 mg、胞苷2.42 mg、尿嘧啶核苷2.01 mg、胸腺嘧啶3.50 mg、腺嘌呤2.03 mg、肌苷2.01 mg、鳥(niǎo)嘌呤核苷2.02 mg、胸苷 2.08 mg、腺苷2.50 mg、2′-脫氧核苷 2.04 mg置于10 mL容量瓶中，用超純水分別配成質(zhì)量濃度為尿嘧啶0.212 mg/mL、胞苷0.242 mg/mL、胸苷0.208 mg/mL、尿嘧啶核苷0.201 mg/mL、肌苷0.201 mg/mL、胸腺嘧啶0.350 mg/mL、腺嘌呤0.203 mg/mL、鳥(niǎo)嘌呤核苷0.202 mg/mL、腺苷0.250 mg/mL、2′-脫氧核苷0.204 mg/mL的單一質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液。

依次準(zhǔn)確吸取上述儲(chǔ)備液1.3 mL、1.0 mL、1.0 mL、0.5 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.0 mL、1.0 mL，在10 mL的容量瓶中定容，制成含10種核苷成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中尿嘧啶、胞苷、胸苷、尿嘧啶核苷、肌苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺苷、2′-脫氧核苷的含量分別為0.0265 mg/mL、0.0242 mg/mL、0.0201 mg/mL、0.0101 mg/mL、0.0101 mg/mL、0.0350 mg/mL、0.0203 mg/mL、0.0253 mg/mL、0.0250 mg/mL、0.0204 mg/mL。準(zhǔn)確吸取該溶液0.5 mL，用超純水定容于1 mL容量瓶中，制成6個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合系列溶液。

以標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，采用“1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到10種核苷的色譜圖 (圖1-A)。計(jì)算得到10種核苷含量。尿嘧啶、胞苷、胸苷、尿嘧啶核苷、肌苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤核苷、腺苷、2′-脫氧核苷的含量分別為0.265、0.242、0.201、0.101、0.101、0.350、0.203、0.253、0.0250、0.0204 mg/mL。

將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照1.4條件進(jìn)行分析，以各核苷成分的峰面積積分值 (Y) 與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度 (X)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、決定系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表3。

1.6 精密度試驗(yàn)

圖 1 10種核苷混合對(duì)照品溶液 (A) 和瓦布貝母 (B) 供試品溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of 10 nucleoside mixed reference solution (A) and the sample of Fritillaria unibracteata wabuensis (B)

表3 10種核苷類成分回歸方程與線性范圍Table 3 Regression equations and linear ranges of 10 nucleoside components

取標(biāo)準(zhǔn)混合對(duì)照品溶液，在“1.4”的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)得尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧核苷RSD分別為0.52%、0.78%、1.22%、1.53%、0.36%、0.87%、0.36%、1.33%、0.56%、0.66%，表明精密度良好。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

選取1號(hào)小區(qū)瓦布貝母樣品，準(zhǔn)確稱取貝母樣品粉末0.3000 g，稱取6份，置于10 mL離心管中，精密加水3 mL，混勻，室溫 (200 W，40 kHz) 超聲提取45 min，4000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。按“1.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，10個(gè)核苷成分色譜圖見(jiàn)圖1-B。6份溶液中尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧核苷峰面積的RSD分別為2.32%、1.13%、2.45%、0.99%、2.01%、1.68%、1.88%、2.56%、2.76%、2.33%，表明方法重復(fù)性良好。

1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一小區(qū) (1號(hào)小區(qū)) 瓦布貝母供試品溶液，分別于 0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧核苷峰面積RSD 分別為1.82%、2.44%、3.08%、1.15%、1.99%、2.45%、2.98%、1.67%、2.63%、1.35%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.9 加樣回收率

精密稱取已知含量的瓦布貝母樣品共6份，每份約0.5 g，分別精密加入尿嘧啶159.76 μg、胞苷28.55 μg、尿嘧啶核苷 93.90 μg、胸腺嘧啶 10.84 μg、腺嘌呤 5.33 μg、肌苷 105.62 μg、鳥(niǎo)嘌呤核苷18.22 μg、胸苷 34.67 μg、腺苷 26.87 μg、2′-脫氧核苷2.53 μg的對(duì)照品，按“1. 7”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.4”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定含量，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果表明，尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧核苷峰面積平均加樣回收率分別為：99.58%、98.21%、102.44%、101.23%、97.48%、103.21%、99.75%、103.74%、98.33%、101.11%，RSD值均分別為2.34%、3.53%、2.06%、1.89%、3.22%、2.61%、1.49%、3.61%、2.87%、1.51%。

1.10 樣品含量測(cè)定

取23個(gè)試驗(yàn)小區(qū)樣品粉末，分別按“1.7”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.4”項(xiàng)色譜條件測(cè)定10個(gè)核苷類成分含量的峰面積，分別計(jì)算10個(gè)成分的含量，結(jié)果表明，尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、胸苷全部小區(qū)都能檢測(cè)出來(lái)；腺嘌呤在6、7、9、11和13小區(qū)能檢測(cè)出來(lái)；腺苷在1、3、6、10和12小區(qū)不能檢測(cè)出來(lái)，2′-脫氧核苷在1～2和10～12小區(qū)不能檢測(cè)出來(lái)，具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型的建立與檢驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)小區(qū)核苷測(cè)定情況，建立尿嘧啶 (Y1)、胞苷 (Y2)、尿嘧啶核苷 (Y3)、胸腺嘧啶 (Y4)、肌苷(Y5)、鳥(niǎo)嘌呤核苷 (Y6)、胸苷 (Y7) 與鋅 (X1)、硼(X2)、鉬 (X3) 的回歸模型。用F檢驗(yàn)法分別檢驗(yàn)方程各項(xiàng)回歸系數(shù)、方程總回歸系數(shù)和失擬度，得到方差分析表 (表5)。

通過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)，方程Y1、Y3、Y7的總回歸系數(shù)均達(dá)到了顯著水平，方程Y2、Y6的總回歸系數(shù)均達(dá)到了極顯著水平，方程Y1、Y2、Y3、Y6的失擬度未達(dá)到顯著水平 (表5)，這說(shuō)明方程Y1、Y2、Y4、Y6的模型成立，表明回歸方程擬合度合理可靠。經(jīng)上述檢驗(yàn)，剔除顯著水平 ＜ 0.10不顯著的項(xiàng)后得到優(yōu)化的回歸方程 Y1′、Y2′、Y3′和 Y6′。

2.2 因子主效應(yīng)分析

根據(jù)表5中各項(xiàng)回歸系數(shù)的F值計(jì)算各因素對(duì)因變量的貢獻(xiàn)率，可得到各個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響效果，得到各因素對(duì)7種核苷的貢獻(xiàn)率見(jiàn)表6。

鋅、硼、鉬對(duì)7種核苷的貢獻(xiàn)率影響不同 (表6)。按貢獻(xiàn)率從大到小排列得到各因素對(duì)尿嘧啶核苷影響為鋅 ＞ 硼 ＞ 鉬，對(duì)胸腺嘧啶和肌苷的影響為鋅 ＞ 鉬 ＞硼，對(duì)胞苷的影響為硼 ＞ 鉬 ＞ 鋅，對(duì)鳥(niǎo)嘌呤核苷的影響為硼 ＞ 鋅 ＞ 鉬，對(duì)尿嘧啶的影響為鉬 ＞ 鋅 ＞硼，對(duì)胸苷的影響為鉬 ＞ 硼 ＞ 鋅。以上可以看出，鋅、硼、鉬對(duì)不同的核苷的影響效果不同，這可能與核苷合成時(shí)微肥對(duì)其的調(diào)控作用有關(guān)。

2.3 單因素效應(yīng)分析

使用降維法研究鋅、硼、鉬對(duì)瓦布貝母核苷的影響，固定其它因子為零水平，可分析出單因素對(duì)瓦布貝母核苷的影響。鋅肥對(duì)尿嘧啶有顯著影響，鋅肥和硼肥對(duì)胞苷有顯著影響，鉬肥對(duì)胸苷有顯著影響 (表5)。由此可以算出鋅、硼、鉬肥對(duì)瓦布貝母尿嘧啶、胞苷和胸苷的單因素效應(yīng)方程，由方程可得單因素效應(yīng)圖 (圖2)。

表4 試驗(yàn)小區(qū)樣品中10種核苷類成分含量 (μg/g)Table 4 The content of 10 nucleoside compounds in the sample of the test plot

不同因素水平對(duì)瓦布貝母核苷影響不同 (圖2)。隨著鋅肥濃度的增加尿嘧啶含量逐漸增加，胞苷含量逐漸降低，說(shuō)明鋅肥增加時(shí)尿嘧啶含量上升，胞苷含量下降，這就需要一個(gè)合適的施肥量來(lái)達(dá)到兩種核苷的平衡。隨鉬肥的施用量增加胸苷含量逐漸上升，合理增施鉬肥有利于胸苷含量的增加，當(dāng)硼肥和鋅肥施用量增加胞苷含量降低，說(shuō)明硼肥和鋅肥的施用量增加會(huì)抑制胞苷含量的增加。

2.4 互作效應(yīng)分析

交互項(xiàng)中存在著顯著的互作，鋅-硼、鋅-鉬和硼-鉬交互作用都會(huì)對(duì)核苷產(chǎn)生顯著影響 (表5)。利用降維法得到鋅、硼、鉬與核苷的互作效應(yīng)方程，由方程得到互作效應(yīng)圖 (圖3～圖5)。

在鋅肥和硼肥均處于高含量時(shí)，尿嘧啶的含量最高。在鋅肥處較高含量時(shí)，隨著硼肥的增加，尿嘧啶的含量越來(lái)越高；在硼處于較高含量時(shí)，隨著鋅肥的增加，尿嘧啶的含量越來(lái)越高。鋅 - 硼互作對(duì)尿嘧啶的含量有協(xié)同作用。在鋅肥處于較高含量時(shí)，隨著硼肥的增加，尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶和胸苷的含量越來(lái)越低；在硼肥處于較高含量時(shí)，隨著鋅肥的增加，尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶和胸苷的含量開(kāi)始降低，在鋅和硼均處于高含量時(shí)，尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶和胸苷的含量最低。說(shuō)明鋅 - 硼互作對(duì)尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶和胸苷含量有拮抗作用 (圖3)。

表5 瓦布貝母核苷與微肥的方差分析 (F值)Table 5 Analysis of variance of Fritillaria unibracteata var. wabuensis and micronutrient fertilizers (F-values)

表6 單因素貢獻(xiàn)率 (%)Table 6 Single factor contribution rate

圖 2 單因素效應(yīng)Fig. 2 Single factor effects

當(dāng)鋅肥和鉬肥處于高含量時(shí)，尿嘧啶、肌苷和尿嘧啶核苷的含量最高。在鋅肥處于較高含量時(shí)，隨著鉬肥的增加，尿嘧啶、肌苷和尿嘧啶核苷的含量越來(lái)越高；在鉬肥處于較高含量時(shí)，隨著鋅肥的增加，尿嘧啶、肌苷和尿嘧啶核苷的含量越來(lái)越高。說(shuō)明鋅-鉬互作對(duì)尿嘧啶、尿嘧啶核苷和肌苷的含量有協(xié)同作用 (圖4)。

圖 3 Zn和B互作效應(yīng)分析圖Fig. 3 Diagrams of Zn and B interaction analysis

當(dāng)鉬肥處于低含量，硼肥處于高含量時(shí)或者鉬肥處于高含量，硼肥處于低含量時(shí)，胞苷、尿嘧啶核苷和鳥(niǎo)嘌呤核苷的含量最高。在鉬肥處于較高含量時(shí)，隨著硼肥的增加，胞苷、尿嘧啶核苷和鳥(niǎo)嘌呤核苷的含量越來(lái)越低；在硼肥處于較高含量時(shí)，隨著鉬肥的增加，胞苷、尿嘧啶核苷和鳥(niǎo)嘌呤核苷的含量越來(lái)越低。在鉬肥和硼肥處于高含量時(shí)，胸苷的含量最高。在鉬肥處于較高含量時(shí)，隨著硼肥的增加，胸苷的含量先降低后增加；在硼肥處于較高含量時(shí)，隨著鉬肥的增加，胸苷的含量越來(lái)越低。在硼和鉬均處于高含量時(shí)胸苷含量最高。說(shuō)明硼-鉬互作對(duì)胞苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷、胸苷和尿嘧啶核苷產(chǎn)生拮抗作用 (圖5)。

2.5 配方肥優(yōu)化分析

通過(guò)已建立的產(chǎn)量的回歸模型，可計(jì)算出各核苷在最高含量下各微肥因素的最適施用配方的理論值?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)時(shí)存在溫度、光照等環(huán)境的差異影響，通過(guò)使用統(tǒng)計(jì)頻數(shù)法進(jìn)行分析可以得到一個(gè)合適的范圍 (表7)。

不同核苷的最佳施肥范圍不同，但是大部分集中在0水平左右 (表7)。綜合表4中有些小區(qū)未檢測(cè)出的三個(gè)核苷的結(jié)果，和表7取交集的結(jié)果，確定最優(yōu)的施肥范圍為鋅肥 (ZnSO4) 8.05～11.85 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O) 11.70～16.47 kg/hm2、鉬肥(H8MoN2O4) 0.36～0.51 kg/hm2。

圖 4 Zn和Mo互作效應(yīng)分析圖Fig. 4 Diagrams of Zn and B interaction analysis

圖 5 B和Mo互作效應(yīng)分析圖Fig. 5 Diagrams of B and Mo interaction analysis

表7 各核苷含量最優(yōu)的微量元素用量Table 7 Optimal micronutrient fertilizer rates for highest concentration of each nucleoside

2.6 基于灰色關(guān)聯(lián)度和DTOPSIS法綜合評(píng)價(jià)試驗(yàn)小區(qū)瓦布貝母核苷含量

為了能夠綜合對(duì)瓦布貝母的10種核苷做出一個(gè)客觀綜合評(píng)價(jià)，本文綜合了所測(cè)定的10種核苷成分，使用灰色關(guān)聯(lián)度法計(jì)算出10種核苷的權(quán)重值和灰關(guān)聯(lián)度 (表8)，從而計(jì)算出灰關(guān)聯(lián)評(píng)價(jià)指標(biāo) (表9)，并使用灰關(guān)聯(lián)權(quán)重值進(jìn)行了DTOPSIS法處理，得到DTOPSIS法的相對(duì)接近度值Ci及其排序，同時(shí)計(jì)算出待評(píng)材料與理想材料的關(guān)聯(lián)度。

采用灰色關(guān)聯(lián)度法和DTOPSIS法的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果幾乎一致 (表9)。兩種方法所得綜合表現(xiàn)最優(yōu)的處理是3號(hào)，即當(dāng)使用鋅肥 (ZnSO4) 15.71 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O) 5.53 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4)0.65 kg/hm2時(shí)瓦布貝母10種核苷的含量綜合最優(yōu)，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中可以根據(jù)所需核苷品種進(jìn)行相關(guān)的微肥施用。

3 討論

微量元素是作物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少和不可相互代替的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，微量元素是植物體內(nèi)酶或輔酶的組成部分，微量元素的缺失會(huì)影響植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累[15-16]。孟杰等[17]研究發(fā)現(xiàn)配施微量元素能有效地提高北柴胡皂苷a、d的影響；張亞琴等[10]的研究發(fā)現(xiàn)鋅硼鉬配施能顯著提高白芷中香豆素含量。本研究結(jié)果表明，在試驗(yàn)因素范圍內(nèi)鋅、硼和鉬都有利于瓦布貝母核苷類含量的增加。在測(cè)得的10種核苷中，不同核苷對(duì)微量元素的需求不同，三種肥料對(duì)單一核苷的貢獻(xiàn)率不盡相同。核苷的合成過(guò)程中需要的微量元素不同。

表8 10種核苷的關(guān)聯(lián)度 (γi) 和變異系數(shù)確定的權(quán)重值 (ωk)Table 8 The correlation degree (γi) of 10 nucleosides and the weight value (ωk) dependent of the coefficient of variation

表9 瓦布貝母10種核苷的加權(quán)關(guān)聯(lián)度γi與Ci排序值Table 9 Ranking of weighted correlation degrees γi and Ci of 10 nucleosides of F. unibracteata wabuensis

根據(jù)互作效應(yīng)得到兩因素互作對(duì)核苷含量產(chǎn)生的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果鋅-硼互作對(duì)尿嘧啶產(chǎn)生協(xié)同作用，對(duì)胸腺嘧啶、尿嘧啶核苷和胸苷產(chǎn)生拮抗作用；鋅-鉬互作對(duì)尿嘧啶、尿嘧啶核苷和肌苷產(chǎn)生協(xié)同作用；硼-鉬互作對(duì)胞苷、胸苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷和尿嘧啶核苷產(chǎn)生拮抗作用。這與小麥[18]、玉米[19]、花生[20]等作物的微量元素互作效應(yīng)研究結(jié)果相似。綜合以上原因，可能是鋅在參與葉綠素生成、防止葉綠素的降解和形成碳水化合物等光合作用過(guò)程中具有重要作用[21-22]；硼對(duì)植物的具體作用主要表現(xiàn)為參與作物體內(nèi)碳水化合物的代謝和植物的固氮作用[22]；含鉬元素的蛋白參與硝酸還原作用和固氮作用，提高蛋白質(zhì)質(zhì)量[24-25]，這些生理生化過(guò)程都會(huì)影響瓦布貝母核苷含量的增加。不同微量元素肥料對(duì)藥用植物的相關(guān)影響還處于探索階段，微量元素肥料對(duì)藥用植物產(chǎn)量和有效成分含量的積累機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究建立了微量元素肥料鋅硼鉬肥與瓦布貝母7種核苷之間的回歸方程。試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果表明，鋅、硼、鉬配施能促進(jìn)瓦布貝母核苷含量的增加。該試驗(yàn)得到的瓦布貝母單一核苷類成分量高于馬鵬等[4]、游靜等[26]對(duì)太白貝母和暗紫貝母的核苷成分量，一方面說(shuō)明鋅、硼、鉬配施能顯著提高核苷的含量，另一方面也說(shuō)明瓦布貝母具有較高的內(nèi)在成分，可以作為川貝母人工栽培的發(fā)展方向。Pan 等[5]對(duì)瓦布貝母的研究結(jié)果也表明鋅硼鉬配施能夠顯著提高尿嘧啶和肌苷的含量。綜合7種核苷的優(yōu)化配方施肥方案，得出最優(yōu)的施肥范圍為鋅肥 (ZnSO4)8.05～11.85 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O)11.70～16.47 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4) 0.36～0.51 kg/hm2時(shí)，能夠顯著提高瓦布貝母的7種核苷含量的增加。運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度和DTOPSIS法對(duì)檢測(cè)出的10種核苷進(jìn)行試驗(yàn)小區(qū)處理結(jié)果優(yōu)劣情況比較，灰色關(guān)聯(lián)度法所得關(guān)聯(lián)度最大差異為31.98%，DTOPSIS法所得Ci值最大差異可達(dá)63.86%，說(shuō)明根據(jù)DTOPSIS法可以使樣品之間的差異更加明顯，能夠更好區(qū)分試驗(yàn)材料的優(yōu)異。根據(jù)結(jié)果可得，施用鋅肥 (ZnSO4) 15.71 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O)5.53 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4) 0.65 kg/hm2時(shí)瓦布貝母10種核苷的含量綜合最優(yōu)，這與頻數(shù)分析法中最優(yōu)施肥范圍有一定差異，可能是有些小區(qū)未檢測(cè)出相關(guān)成分造成了這種差異。

4 結(jié)論

葉面噴施鋅、硼、鉬對(duì)瓦布貝母的核苷成分的含量具有一定影響。施用鋅肥 (ZnSO4) 8.05～11.85 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O) 11.70～16.47 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4) 0.36～0.51 kg/hm2時(shí)檢測(cè)的8種核苷成分含量綜合最佳。通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度和DTOPSIS法進(jìn)行分析，施用鋅肥 (ZnSO4) 15.71 kg/hm2、硼肥(Na2B4O7·10H2O) 5.53 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4) 0.65 kg/hm2時(shí)瓦布貝母10種核苷的含量綜合最優(yōu)。