潘娟 陳霞

1延安市人民醫(yī)院老年病科 716000； 2延安市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 716000

頸動脈粥樣硬化(CAS)已成為2型糖尿病(T2DM)患者最常見的致殘、致死原因之一。Irisin是近年來新發(fā)現(xiàn)的肌肉因子，由含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白5(FNDC5)經(jīng)剪切修飾產(chǎn)生，可顯著增加肌肉和脂肪組織對胰島素的敏感性，與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，機(jī)體irisin表達(dá)水平異?？赡苁荰2DM患者發(fā)生微血管和大血管并發(fā)癥的重要機(jī)制之一[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC5基因存在多個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與機(jī)體irisin表達(dá)水平相關(guān)，且與多種疾病臨床易感性相關(guān)[5-7]。本研究擬通過比較對照組和T2DM患者，以及有、無CAS的T2DM患者之間FNDC5基因rs16835198、rs3480和rs1570569位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率的差異，探討FNDC5基因多態(tài)性與T2DM及CAS的相關(guān)性，為臨床提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月至2018年7月在延安市人民醫(yī)院老年病科住院治療的T2DM患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80歲；T2DM診斷符合2013年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會指定的《中國T2DM防治指南》[8]，且糖尿病病程>5年；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)： 1型糖尿病患者；合并嚴(yán)重肝、腎疾病、惡性腫瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病等疾?。蝗焉锲谂?。本研究納入T2DM患者共358例，包括男211例，女147例，平均年齡(55.7±9.6)歲。另外，隨機(jī)選擇同期在延安市人民醫(yī)院體檢的200名非糖尿病且經(jīng)頸動脈超聲檢查正常的健康體檢者作為對照組，其中包括男115名，女85名，平均年齡(56.5±8.3)歲。 本研究通過延安市人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有入組成員均充分知情同意。

1.2 方法

1.2.1 頸動脈超聲檢查 患者取仰臥位，應(yīng)用Aplio 500彩色多普勒超聲儀(日本東芝公司)檢測頸總動脈分叉處，及分叉處遠(yuǎn)端和近端各1～1.5 cm處的頸動脈內(nèi)膜中層厚度(CIMT)值，取左右兩側(cè)CIMT最大值作分析用。參考2010年中國高血壓防治指南，將CIMT≥1 mm或頸動脈斑塊形成診斷為CAS，并以此將T2DM組患者分為無CAS組和CAS組。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測 (1)基因組DNA提?。翰杉宄靠崭雇庵莒o脈血3 ml，采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全血基因組DNA。(2)SNP選擇：根據(jù)Hapmap計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中國漢族人群基因型數(shù)據(jù)結(jié)果，按照r2≥0.8，最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.05的標(biāo)準(zhǔn)，選取rs16835198、rs3480和rs1570569 3個標(biāo)簽SNP位點(diǎn)，可覆蓋FNDC5基因全部MAF>0.05的常見SNP。(3)PCR擴(kuò)增：上、下游引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，嚴(yán)格按照PCR操作流程進(jìn)行。(4)純化和延伸：采用Shrimp堿性磷酸酶去除PCR反應(yīng)體系中剩余的dNTP和引物等進(jìn)行純化；然后加入延伸引物(表1)，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。(5)測序：采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法，使用MassARRAY Analyzer Compact儀器進(jìn)行基因型檢測。

1.2.3 其他參數(shù)采集 收集所有入組患者相關(guān)臨床資料，主要包括患者性別、年齡、體重指數(shù)、糖尿病病程、收縮壓、舒張壓以及空腹血糖、HbA1c、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)等。

表1 PCR引物序列

注：SNP：單核苷酸多態(tài)性

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床指標(biāo)比較 與對照組相比，T2DM組CIMT、舒張壓、空腹血糖、HbA1c、甘油三酯、總膽固醇和LDL-C水平均顯著升高(P均<0.05)；年齡、性別、體重指數(shù)、收縮壓和HDL-C差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

與無CAS組相比，CAS組CIMT、糖尿病病程、HbA1c、甘油三酯和總膽固醇水平均顯著升高(P均<0.05)；年齡、性別、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、LDL-C和HDL-C差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表3。

2.2 各組rs16835198、rs3480和rs1570569位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較 與對照組相比，T2DM組rs16835198、rs3480和rs1570569位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表4。

與無CAS組相比，CAS組rs16835198位點(diǎn)GG基因型和G等位基因以及rs1570569位點(diǎn)T等位基因分布頻率均顯著升高(P均<0.05)。rs3480位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表5。

2.3 T2DM患者發(fā)生CAS的危險(xiǎn)因素分析 在T2DM患者中，以是否發(fā)生CAS為因變量，以年齡、性別、糖尿病病程、HbA1c、甘油三酯、總膽固醇以及rs16835198位點(diǎn)G等位基因和rs1570569位點(diǎn)T等位基因等為自變量，采用logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病病程和rs16835198位點(diǎn)G等位基因是T2DM患者發(fā)生CAS的危險(xiǎn)因素，見表6。

3 討論

Irisin是2012年由Spiegelman首次發(fā)現(xiàn)的肌肉因子，可改善糖、脂代謝，降低體質(zhì)量，提高胰島素敏感性，阻止肥胖和T2DM的發(fā)生。近年來，越來越多研究證據(jù)表明，irisin可能還參與T2DM患者靶器官損害過程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者血清irisin水平顯著下降，合并糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者irisin水平下降更明顯[6,9]。李白潔等[10]研究顯示，在T2DM患者中，血清irisin水平與CIMT呈負(fù)相關(guān)。上述研究結(jié)果提示，irisin水平異?？赡軈⑴cT2DM患者微血管和大血管動脈粥樣硬化的病理改變過程。目前相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，irisin參與T2DM患者動脈粥樣硬化的可能機(jī)制在于： irisin可通過激活蛋白激酶-磷脂酰肌醇3激酶-絲/蘇氨酸蛋白激酶-內(nèi)皮型一氧化氮合酶信號通路，降低高血糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；抑制炎性因子mRNA表達(dá)，緩解炎性反應(yīng)，阻止動脈粥樣硬化進(jìn)程；促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，促進(jìn)血管再生，減輕糖尿病的血管損傷[4,11]。

表2 對照組和T2DM組一般臨床指標(biāo)比較

注：T2DM組：2型糖尿病組；CIMT：頸動脈內(nèi)膜中層厚度；LDL-C：低密度脂蛋白-膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-膽固醇；1 mmHg=0.133 kPa

表3 無CAS組和CAS組一般臨床指標(biāo)比較

注：無CAS組：無頸動脈粥樣硬化組；CAS組：頸動脈粥樣硬化組；CIMT：頸動脈內(nèi)膜中層膜厚度；LDL-C：低密度脂蛋白-膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-膽固醇；1 mmHg=0.133 kPa

表4 對照組和T2DM組rs16835198、rs3480和rs1570569位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較[n(%)]

注：SNP：單核苷酸多態(tài)性；T2DM：2型糖尿病

表5 無CAS組和CAS組rs16835198、rs3480和rs1570569位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較[n(%)]

注：SNP：單核苷酸多態(tài)性；無CAS組：無頸動脈粥樣硬化組；CAS組：頸動脈粥樣硬化組

FNDC5作為irisin的前體物質(zhì)，其表達(dá)水平和活性狀態(tài)與機(jī)體irisin水平密切相關(guān)。近年來，大量研究結(jié)果顯示，F(xiàn)NDC5基因存在多個SNP位點(diǎn)，具有明確的生物學(xué)效應(yīng)。Staiger等[12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC5基因rs16835198位點(diǎn)和rs726344位點(diǎn)基因多態(tài)性和機(jī)體胰島素敏感性密切相關(guān)。Tanisawa等[13]以日本人群為研究對象，發(fā)現(xiàn)rs16835198位點(diǎn)基因多態(tài)性與空腹血糖和糖化血紅蛋白有關(guān)。汪晶華等[6]在糖尿病腎病患者中發(fā)現(xiàn)，rs16835198位點(diǎn)基因多態(tài)性與病變嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究選取rs16835198、rs3480和rs1570569 3個標(biāo)簽SNP位點(diǎn)，比較T2DM患者和對照組，以及有或無CAS的T2DM患者之間各位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差異。結(jié)果顯示，各位點(diǎn)基因多態(tài)性與T2DM發(fā)病無明顯相關(guān)性，但CAS組和無CAS組相比，兩組rs16835198位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率存在顯著差異，rs1570569位點(diǎn)等位基因分布頻率存在顯著差異。進(jìn)一步行l(wèi)ogistic多因素分析結(jié)果顯示，攜帶FNDC5基因rs16835198位點(diǎn)G等位基因可增加T2DM患者CAS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FNDC5基因rs16835198多態(tài)性與T2DM患者發(fā)生CAS密切相關(guān)。當(dāng)然，本研究也存在諸多不足之處：首先，本研究為單中心小樣本研究，得到的結(jié)果可能與真實(shí)世界存在偏差；其次，irisin蛋白作為最終產(chǎn)物，本研究限于條件，缺乏對其表達(dá)水平的檢測，F(xiàn)NDC5基因多態(tài)性具體如何影響irisin的表達(dá)缺少證據(jù)支持；最后，由FNDC5基因到irisin蛋白涉及的過程復(fù)雜，調(diào)控因素眾多，單個SNP位點(diǎn)如何發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，及各位點(diǎn)如何相互影響，尚不明確，期待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

表6 T2DM患者發(fā)生CAS的危險(xiǎn)因素分析

注：T2DM：2型糖尿?。籆AS：頸動脈粥樣硬化