熊龑 徐濤 龔良國(guó)

[摘要]目的 探討CCK-8法測(cè)定纖維蛋白膠對(duì)人脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞毒性。方法 選取2018年11月12日來(lái)我院進(jìn)行成人吸脂術(shù)的某位28歲健康女性的術(shù)后廢棄脂肪組織，并從中得到人脂肪干細(xì)胞，分別制成50%浸提液組、100%浸提液組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組，采用CCK-8檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組纖維蛋白培養(yǎng)液中的吸光值。結(jié)果 原代脂肪干細(xì)胞（ASCs）生長(zhǎng)緩慢，傳代后生長(zhǎng)加速，且脂肪干細(xì)胞呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài);陰性對(duì)照組的吸光值與50%、100%形態(tài)放置24 h和72 h的纖維蛋白膠浸提液組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。50%及100%纖維蛋白膠浸提液組、陰性對(duì)照組的吸光值均小于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 纖維蛋白膠在與脂肪干細(xì)胞相混合的情況下無(wú)顯著細(xì)胞毒性，能夠?yàn)樘剿骰诶w維蛋白膠作為支架材料的有關(guān)脂肪結(jié)構(gòu)提供參考。

[關(guān)鍵詞]CCK-8法;纖維蛋白膠;脂肪干細(xì)胞;細(xì)胞毒性

[中圖分類號(hào)] R628? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）6（c）-0038-03

[Abstract] Objective To explore the cytotoxicity of fibrin glue to human adipose stem cells by CCK-8 method. Methods Human adipose stem cells were obtained from the waste adipose tissue of a 28-year-old healthy woman who came to our hospital on November 12， 2018 for adult liposuction， and made into the 50% fibrin glue leaching solution group， the 100% fibrin glue leaching solution group， the negative control group and the positive control group respectively. The absorbance values in each fibrin glue medium was determined by CCK-8 method. Results The growth of primary adipose stem cells （ASCs） was slowly. The growth of ASCs was accelerated after passage， and ASCs appeared fibroblast-like morphology. There were no significant differences in the absorbance between the 50% fibrin glue extract group， the 100% fibrin glue extract group and the negative control group at 24 and 72 hours （P>0.05）. The absorbance values of 50% and 100% fibrin glue extract group and the negative control group were lower than that of the positive control group， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Fibrin glue has no significant cytotoxicity when mixed with ASCs， which can provide a reference for the exploration of adipose structure based on fibrin glue as scaffold material.

[Key words] CCK-8 method; Fibrin glue; Adipose stem cells; Cytotoxicity

在整形外科的臨床實(shí)踐活動(dòng)中常?？梢钥吹杰浗M織缺失的情況，目前存在著兩類能夠作為軟組織充填物的材料，首先是經(jīng)過(guò)人工方式合成的正常肌理組織為主的臨時(shí)性填充物，諸如膠原蛋白、透明質(zhì)酸等，這些物質(zhì)的良好生物相容性和可降解性讓其應(yīng)用范圍廣泛，但其填充效果卻不能持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間;其次是通過(guò)人工方式合成的惰性材料，諸如硅膠等，但這樣的填充物等于異物植入，無(wú)法獲得自然的整形術(shù)后效果[1-2]。目前快速崛起的自體脂肪顆粒一直存在著較低的術(shù)后脂肪存活率，這無(wú)形之中讓以最終填充效果為目標(biāo)的手術(shù)次數(shù)增多[3-4]。近年來(lái)，以組織再生理論為基礎(chǔ)的脂肪組織工程因?yàn)橹靖杉?xì)胞（adipose stem cells，ASCs）的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了飛躍，也讓基于脂肪肝種子細(xì)胞為基礎(chǔ)的脂肪組織工程日漸受到醫(yī)學(xué)界關(guān)注[5]。本研究采用CCK-8法測(cè)定纖維蛋白膠對(duì)人ASCs的細(xì)胞毒性，旨在為基于纖維蛋白膠支架為基礎(chǔ)的脂肪組織工程深化提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、低糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Ⅰ型膠原酶、纖維蛋白原、凝血酶（Sigma）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olpmpus公司，型號(hào)為CKX41;CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，型號(hào)為Skan Spertrum。

1.2研究方法

1.2.1人脂肪干細(xì)胞的獲取? 選取2018年11月12日來(lái)我院進(jìn)行成人吸脂術(shù)的某位28歲健康女性的術(shù)后廢棄脂肪組織并從中得到人脂肪干細(xì)胞，本研究在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)和患者本人的授權(quán)下進(jìn)行。將5 ml廢棄的吸脂術(shù)后人體脂肪組織與Ⅰ型膠原酶溶液混合，溶液濃度與脂肪組織相同且濃度為1.0 mg/ml，簡(jiǎn)單搖勻后在37℃的水浴箱內(nèi)部靜置消化30 min，之后在離心機(jī)上按照1000 r/min的速度連續(xù)離心5 min來(lái)消去表面油脂和液體。利用FBS DMEM培養(yǎng)基來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，培養(yǎng)基的FBS濃度為10%，細(xì)胞濃度設(shè)置為（5×105～10×105）個(gè)/L，然后將細(xì)菌接種到規(guī)格為25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48 h再進(jìn)行第一次液體更換，融合度達(dá)到80%后利用胰蛋白酶消化傳代，傳代數(shù)目為3代，完成后的干細(xì)胞留作后用。

1.2.2纖維蛋白膠浸提液的制備? 纖維蛋白膠浸提液的萃取參照ISO 10993醫(yī)療用具的生物學(xué)評(píng)價(jià)準(zhǔn)則來(lái)進(jìn)行。將濃度分別為50 mg/ml和500 U/ml的纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液按照等體積抽吸到雙聯(lián)注射器之中，并將其轉(zhuǎn)注到6孔板上，令纖維蛋白膠在6孔板底層均勻鋪開(kāi)。將培養(yǎng)基加注到已經(jīng)成型的纖維蛋白膠上，加入時(shí)材料表面積和液體體積之間的比值為3 cm2/ml，將在37℃的孵化箱內(nèi)部完成3 d浸提后形成的纖維蛋白膠百分百純度浸提液和等量體積的DMEM培養(yǎng)基相融合，并讓浸提液的濃度降低到50%。然后將10%濃度的胎牛血清放置其中并按照4℃低溫保存以備后用。

1.2.3 CCK-8試劑測(cè)定各組培養(yǎng)液中吸光值? 將制備的纖維蛋白膠制成不同濃度的纖維蛋白膠浸提液，分別為陰性對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基）、50%纖維蛋白膠浸提液組、100%纖維蛋白膠浸提液組和陽(yáng)性對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含6.4%苯酚溶液），完成細(xì)胞毒性檢測(cè)。令第3代ASCs胰酶完成消化，之后按照1×107/L的濃度制造細(xì)胞懸液，按照每孔100 μl的比例在96孔板中完成接種，24 h以后提取培養(yǎng)完成的細(xì)胞貼壁并吸收廢棄培養(yǎng)液。將制備的培養(yǎng)液分別添加到陰性對(duì)照組、50%纖維蛋白膠浸提液組、100%纖維蛋白膠浸提液組和陽(yáng)性對(duì)照組4個(gè)分組中，4個(gè)分組培養(yǎng)液均包括5個(gè)復(fù)孔配置，細(xì)菌種版2個(gè)，培養(yǎng)箱溫度為37℃。培養(yǎng)24 h和72 h時(shí)，將一塊96孔板取出并對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行吸收，每孔加入10 μl CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm雙波長(zhǎng)處測(cè)得相應(yīng)的吸光值（A值）。

1.3觀察指標(biāo)

觀察傳代后的ASCs生長(zhǎng)速度以及人脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)的形態(tài)學(xué)狀況，比較各組的A值，A值越大，表示物質(zhì)對(duì)光的吸收越大，毒性也越大。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)比較采用單因子方差法，跨組別比較采用SNK-q檢驗(yàn)法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1人脂肪干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

利用酶消化手段從提取的人體脂肪吸收物中提取第一代ASCs，7 d以后，第一代ASCs才完全布滿培養(yǎng)瓶。但是傳代后的生長(zhǎng)速度加快，代際傳遞時(shí)間只需要3 d。傳代完成的ASCs有著最典型化的纖維細(xì)胞形狀，足突與細(xì)胞核大而且明顯。密集生長(zhǎng)的細(xì)胞之間還呈現(xiàn)出渦狀排布。

2.2各組培養(yǎng)液中A值檢測(cè)結(jié)果的比較

對(duì)所有完成24 h和72 h培養(yǎng)的分組細(xì)胞上清液進(jìn)行A值測(cè)試，結(jié)果顯示兩個(gè)培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)內(nèi)的50%及100%纖維蛋白膠浸提液組的A值與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。完成24、72 h培養(yǎng)時(shí)，50%及100%纖維蛋白膠浸提液組、陰性對(duì)照組的A值均小于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

支架材料是搭建脂肪組織工程的重要環(huán)節(jié)，須滿足包括優(yōu)良生物相容性和固定時(shí)間段高降解特性等一系列性質(zhì)。在凝血反應(yīng)的擬態(tài)之下，凝血酶與纖維蛋白原發(fā)生作用，產(chǎn)生了帶有一定物理強(qiáng)度的膠狀纖維蛋白膠（fibrin gel）。將纖維蛋白膠作成多種組織架構(gòu)的支架材料已經(jīng)有了多次見(jiàn)諸報(bào)端的實(shí)例[6]。然而，融入復(fù)合ASCs的纖維蛋白膠支架材料被用于搭建脂肪組織工程的研究范例還較為少見(jiàn)[7]。本研究中，ASCs被按照酶消化模式從脂肪組織中萃取出來(lái)，采用CCK-8模式對(duì)這一物質(zhì)進(jìn)行體外培養(yǎng)后與纖維蛋白膠相融合產(chǎn)生的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示纖維蛋白膠與ASCs相融合后并沒(méi)有明顯的毒性，從而為該物質(zhì)與復(fù)合ASCs相容共同作為脂肪組織工程支架材料的探索提供了參考。

一般情況下，組織搭建的工程思路是把支架材料和種子細(xì)胞的合成材料按照一定誘導(dǎo)模式植入人體，但這就需要種子細(xì)胞和支架材料兩個(gè)關(guān)鍵性的東西。在2001年，Zuk等[8]第1次對(duì)基于脂肪吸取物培養(yǎng)而成的命名為ASCs的間充質(zhì)干細(xì)胞特質(zhì)種群進(jìn)行報(bào)道?；谥窘M織的大獲取量和低獲取難度，將脂肪作為ASCs的提取來(lái)源有著良好的實(shí)際潛力。脂肪組織工程因?yàn)锳SCs的出現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)了飛躍，也讓基于脂肪肝種子細(xì)胞為基礎(chǔ)的脂肪組織工程日漸受到醫(yī)學(xué)界關(guān)注[9-10]。

種子細(xì)胞在組織工程的環(huán)境下必須在三維支架上實(shí)現(xiàn)種植，這也讓支架材料在構(gòu)建組織的過(guò)程中起到了重要的作用。支架可以基于塑型特質(zhì)分為預(yù)塑型多孔材料和注射性凝膠材料[11-12]，在脂肪組織工程的狀態(tài)下，注射型凝膠支架搭建的注射型軟組織填充物更具有常態(tài)化的優(yōu)點(diǎn)，創(chuàng)面小、填充均勻、可以更好地完成對(duì)不規(guī)則缺失的填補(bǔ)[12]。

纖維蛋白原加上凝血酶造就的纖維蛋白膠其實(shí)就是凝血反應(yīng)的最后擬態(tài)，水凝膠由纖維蛋白聚合而成，注射填充的活動(dòng)只需要雙聯(lián)注射器即可輕松完成。良好的降解性讓纖維蛋白膠在作為支架材料時(shí)可以擁有更好的組織工程潛力，在諸如平滑肌、骨骼、軟組織等多個(gè)組織工程領(lǐng)域?qū)w維蛋白膠的利用探索已經(jīng)多次出現(xiàn)在相關(guān)報(bào)道中[13-15]。

生物相容性是測(cè)試任何機(jī)體植入材料的必須標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)這些機(jī)體植入材料的生物相容性的國(guó)際通用測(cè)試活動(dòng)主要分三步：①基于體外培養(yǎng)細(xì)胞繁殖干擾力的體外細(xì)胞毒性檢測(cè);②測(cè)試材料對(duì)于機(jī)體的局部或全身毒性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn);③病患活體實(shí)驗(yàn)。這也讓細(xì)胞毒性作用的測(cè)試成為了材料生物相容性測(cè)試的第一步，而測(cè)試細(xì)胞毒性的主要標(biāo)準(zhǔn)就是CCK-8標(biāo)準(zhǔn)。

本研究存在100%濃度液和50%濃度液的纖維蛋白膠浸提液，檢測(cè)時(shí)間均在培養(yǎng)活動(dòng)的第1、3 d進(jìn)行。測(cè)試結(jié)果顯示，兩組浸提液的A值與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。完成24、72 h培養(yǎng)時(shí)，50%及100%纖維蛋白膠浸提液組、陰性對(duì)照組的A值均小于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過(guò)CCK-8法測(cè)定各組各時(shí)段的A值，結(jié)果顯示，ASCs下纖維蛋白膠不存在顯著細(xì)胞毒性。

在脂肪組織工程內(nèi)部應(yīng)用纖維蛋白膠支架材料尚無(wú)足夠研究實(shí)例，本研究也只是纖維蛋白膠在體外ASCs內(nèi)部所產(chǎn)生獨(dú)行的CCK-8檢測(cè)，未來(lái)對(duì)于纖維蛋白膠組織結(jié)構(gòu)支架材料的實(shí)用安全研究還需要更加全面。

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（收稿日期：2018-11-30? 本文編輯：孟慶卿）