陳立杰， 宋 玉， 陳通政， 劉 穎， 王 勇

(貴州大學(xué)， 貴陽 550025)

擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)按照最新的分類系統(tǒng)屬于子囊菌門，盤菌亞門，糞殼菌綱，炭角菌亞綱，黑盤孢目，被毛孢科。該真菌類群地球上普遍存在，尤其在熱帶和亞熱帶生物多樣性特別豐富[1]，此外，該真菌類群不具有很高的專一性宿主，因此往往能引起許多植物的不同病害癥狀，造成不同程度的減產(chǎn)[2-10]。根據(jù)前人研究[4]，Pestalotiopsis分類的主要形態(tài)學(xué)指標(biāo)涵蓋：第一，分生孢子中間有色孢的顏色特點(diǎn)(包括同色，異色，橄欖綠色及褐色)；第二，孢子大小范圍，形狀特點(diǎn)及分隔數(shù)目；第三，孢子附屬絲(頂端)的特點(diǎn)、基部附屬絲的有無及數(shù)目；第四，產(chǎn)孢器(分生孢子盤)、分生孢子梗及產(chǎn)孢細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)等[4]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在真菌類群的分類學(xué)研究中，分子系統(tǒng)學(xué)技術(shù)(基于DNA序列的堿基差異的分析)發(fā)揮著越來越重要的作用且優(yōu)勢(shì)明顯。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的方法對(duì)分離自貴州茶葉上的擬盤多毛孢真菌進(jìn)行分類學(xué)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 采集標(biāo)本

采集地：花溪區(qū)黔陶鄉(xiāng)趙司村茶場(chǎng)；品種：福鼎大白茶；采集時(shí)間：2011年11月28日；標(biāo)本及所獲菌株均保存于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室標(biāo)本室。

1.2 分離純化及保存菌種

菌種的分離純化及保存方法參照宋玉[11]的方法。

1.3 形態(tài)學(xué)描述

所分離獲得的菌株在25 ℃條件下培養(yǎng)7～10 d，等到肉眼觀察有大量油滴狀黑色或深褐色顆粒(分生孢子盤及分生孢子)出現(xiàn)后在體視鏡下觀察菌落形態(tài)并挑取分生孢子及分生孢子梗等制作玻片，顯微鏡(奧林帕斯BX 53)在不同放大倍數(shù)下(20×，40×，100×)觀察真菌的典型結(jié)構(gòu)特征并拍攝分生孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子盤的高清圖片，采用PhotoShop軟件選擇典型的照片組成合格的圖版，Image Frame Work軟件測(cè)量擬盤多毛孢菌不同繁殖結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)并完成相應(yīng)的形態(tài)學(xué)描述。

1.4 DNA的提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

1.4.1基因組DNA的提取

采用DNA快速提取試劑盒提取擬盤多毛孢菌的基因組DNA，具體步驟參考宋玉[11]的方法。

1.4.2PCR反應(yīng)體系，引物及擴(kuò)增程序

1) 反應(yīng)體系。

PCR總反應(yīng)體系為25μL：不同基因正反向引物分別1μL，Template DNA 1μL，雙蒸水 9.5μL，2倍的PCR Master Mix(2×Taq DNA聚合酶，2×PCR 緩沖液以及2×dNTP)共計(jì)12.5μL[11]。

2) 不同基因引物序列及PCR程序。

注：模式標(biāo)本為HGUP 4086,其中A～H為分生孢子；I～J為分生孢子梗和產(chǎn)孢細(xì)胞。標(biāo)尺：A～J=20 μm。圖1 中國茶擬盤多毛孢

ITS 基因DNA片段：

通用引物(ITS 4和ITS 5)，引物序列見參考文獻(xiàn)[12]。

反應(yīng)程序：95 ℃下總預(yù)變性0.5 min，然后95 ℃變性反應(yīng)0.5 min，52 ℃退火反應(yīng)45 s，72 ℃延伸1.5 min，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后72 ℃總延伸10 min[11]，反應(yīng)完成后4 ℃下保存或及時(shí)取出。

β-tubulin(β-微管蛋白)基因DNA片段：

特異引物Bt2a和Bt2B，引物序列見參考文獻(xiàn)[13-14]。

反應(yīng)程序：93 ℃總預(yù)變性3 min，然后95 ℃變性1 min，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后72 ℃總延伸10 min[14-15]，反應(yīng)完成后4 ℃下保存或及時(shí)取出。

tef1(延伸因子)基因DNA片段：

特異引物EF 1-526F和EF 1-1567 R，引物序列見參考文獻(xiàn)[16]。

反應(yīng)程序：94 ℃總預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性0.5 min，63到53 ℃或66到56 ℃(每循環(huán)降低1 ℃)退火50 s，共10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性0.5 min，63或66 ℃退火55 s, 72 ℃延伸1.5 min，反應(yīng)進(jìn)行36個(gè)循環(huán)后72 ℃總延伸7 min[16]，反應(yīng)完成后4 ℃下保存或及時(shí)取出。

1.5 不同基因的DNA序列分析

將編輯好的三個(gè)基因(ITS+β-tubulin+tef1)序列加合文件在PAUP* 4.0 b 10[17]中運(yùn)行，算法設(shè)定為最大簡(jiǎn)約法(Maximum Parsimony，MP)。采用啟發(fā)式搜索(heuristic search)算法并應(yīng)用樹二等分再連接選項(xiàng)(Tree Bisection-reconnection，TBR)來進(jìn)行分枝交換，自舉法(Bootstrap)檢測(cè)設(shè)置為1000次。程序運(yùn)行完成后所生成的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在Treeview軟件中顯示，選擇最優(yōu)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在Figtree軟件中進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征描述

中國茶擬盤多毛孢(Pestalotiopsiscamellia-sinensisYong Wang bis, Y. Song, & K.D. Hyde, sp. nov.)擬盤多毛孢屬真菌子實(shí)體球形，黑色，未成熟前往往寄生于植物組織表皮下方，直到成熟后方外露，呈現(xiàn)凸起(黑色的小顆粒)。分生孢子梗很短至不明顯，產(chǎn)孢細(xì)胞呈現(xiàn)安培瓶狀。分生孢子梭形或近梭形，偶有彎曲，具4個(gè)橫隔膜(5個(gè)細(xì)胞)，大小范圍是27～35 × 7～10μm (平均值為31.5 × 8.5μm)； 其中中間的3個(gè)深色胞均為淺褐色，長度為17～23μm (平均值為20μm)，分隔處稍縊縮，橫膈膜顏色有加深，分生孢子的壁不光滑具點(diǎn)突；中間深色3細(xì)胞自下而上第一個(gè)其長度是5～8μm (平均值為6.5μm)，第二個(gè)細(xì)胞的長度為6～8μm (平均值為7.4μm)，第三個(gè)細(xì)胞的長度為5～8μm (平均值為7μm)；中間3細(xì)胞兩端的細(xì)胞近透明，亞圓錐形，長度為5～8μm (平均值為6.5μm)；其中頂端細(xì)胞具4～6根管狀的附屬絲，附屬絲往往具有分枝，長度為20～40μm (平均值為30μm)；分生孢子的基細(xì)胞略鈍圓，附屬絲往往缺失。

圖2 中國茶擬盤多毛孢的DNA序列分析

模式標(biāo)本：貴州省貴陽市花溪區(qū)黔陶鄉(xiāng)趙司村，茶樹(福鼎大白茶)葉片，模式標(biāo)本編號(hào)HGUP 4086，采集人：宋玉，采集時(shí)間：2011-11-28。

其他標(biāo)本：貴州省貴陽市花溪區(qū)黔陶鄉(xiāng)趙司村，茶樹(福鼎大白茶)葉片，標(biāo)本編號(hào)HGUP 4076，采集人：宋玉，采集時(shí)間：2011-11-28。

2.2 不同基因的DNA序列分析

通過ITS，β-微管蛋白以及延伸因子DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，我們發(fā)現(xiàn)中國茶擬盤多毛孢與山茶擬盤多毛孢(PestalotiopsiscamelliaeY.M. Zhang, Maharachch. & K.D. Hyde)和頂生分枝擬盤多毛孢(PestalotiopsisfurcataMaharachch. & K.D. Hyde)保持了比較近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)又保持了相對(duì)獨(dú)立的分類地位(形成3個(gè)進(jìn)化分枝)，分別獲得100%及97%的自舉支持率。就形態(tài)學(xué)而言，三者也存在較明顯的差別。中國茶擬盤多毛孢的分生孢子大小比頂生分枝擬盤多毛孢的小，但比山茶擬盤多毛孢的大。此外，中國茶擬盤多毛孢頂端附屬絲的數(shù)目也與其它2個(gè)種的也不相同，并且頂端附屬絲普遍會(huì)分枝，但近似種沒有表現(xiàn)出這些形態(tài)特征特征[6,17]。因此，結(jié)合以上DNA序列分析和形態(tài)學(xué)特征的研究，我們將中國茶擬盤多毛孢確定為擬盤多毛孢屬的一個(gè)新種。

3 討 論

中國茶擬盤多毛孢，山茶擬盤多毛孢和頂生分枝擬盤多毛孢這三個(gè)種均分離自茶樹上，其中山茶擬盤多毛孢分離自云南，頂生分枝擬盤多毛孢分離自泰國，而本研究中的新種來自貴州省[6,17]。此外，山茶擬盤多毛孢和頂生分枝擬盤多毛孢均可以引起茶樹的灰斑病，而我們這個(gè)種還沒有引起病害的直接證據(jù)。盡管形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的結(jié)論已經(jīng)證明我們所發(fā)現(xiàn)的新種與山茶擬盤多毛孢和頂生分枝擬盤多毛孢不同，然而我們不能掉以輕心，貴州省作為茶葉之鄉(xiāng)且種植面積全國第一[18]，應(yīng)該時(shí)刻關(guān)注病害的發(fā)生動(dòng)態(tài)，因此我們?cè)诤罄m(xù)研究中會(huì)探究引起病害的可能性及危害性。