卓 瑪，趙燕娟，王 剛，索朗斯珠，扎西次仁

（1.西藏農(nóng)牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏那曲市班戈縣農(nóng)牧科學技術服務站，西藏 那曲 852500）

大腸桿菌(Escherichia coil,E.coil)是埃希菌屬中最為主要的細菌，屬于革蘭氏陰性兼性厭氧短桿菌，是人和牛等溫血動物腸道內的一種正常菌群，對人和動物都有致病性，是目前危害并影響西藏地區(qū)牦牛生產(chǎn)的主要疾病之一?，F(xiàn)將其分為6類，即腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHEC)、腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸集聚性大腸埃希菌(EAEC)、腸產(chǎn)志賀樣毒素且具有侵襲力的大腸埃希菌(ESIES)[1-3],其中ETEC是一類引起人和幼畜（犢牛、羔羊、初生仔豬）腹瀉的重要病原菌[4]，出生幼畜被ETEC感染后常因嚴重腹瀉、脫水而導致死亡，致死率很高，給西藏地區(qū)牦牛生產(chǎn)的工作帶來極大的不便[1]。目前，國際上有不少關于ETEC毒素及分型的相關研究報道，但對西藏地區(qū)牦牛源大腸桿菌的毒力基因方面報道較少見。隨著科技的日益發(fā)展、人們的經(jīng)濟來源的增多以及生活水平的提高，人們對食物的要求也迅速提高，從以前量的需求到現(xiàn)在發(fā)展為不僅要量也追求質的要求，因此，牦牛肉就成為人們極為喜歡的食物，但大腸桿菌病已成為牛群最重要的疾病之一，其感染率越來越高、發(fā)病率越來越高，導致死亡率也就越來越高，給牦牛業(yè)以及相應養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了極為嚴重的危害，嚴重影響了養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益。因此，本試驗選取西藏班戈縣高寒生態(tài)奶牛廠的幼畜和成年牦牛的腹瀉糞樣及肛門拭子進行研究，主要是了解西藏牦牛源大腸桿菌毒力及毒力基因的分布情況，為西藏牦牛源大腸桿菌病的預防以及用藥提供相應科學依據(jù)，以便參考。

1 材料

1.1 試驗病料

本試驗于2018年8月份從西藏班戈縣無菌采集了90份腹瀉糞樣和肛門拭子。

1.2 檢測試劑

氯霉素、諾氟沙星、萬古霉素、頭孢唑啉、鏈霉素、青霉素、丁胺卡那、四環(huán)素、阿奇霉素、復方諾明、紅霉素等14種藥敏片及普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6021型真空干燥箱均購自北京市六一儀器廠；AB204-N型電子分析天平購自上海醫(yī)用核子有限公司；SW-CJ-JC超凈工作臺，購自蘇州凈化設備公司；4S Red plus、PCR試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2 方法

2.1 細菌的分離與培養(yǎng)

將采集的90份樣品加入適量的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分離培養(yǎng)時在無菌超凈工作臺中用接種環(huán)采用劃線法劃線接種在相應的普通瓊脂培養(yǎng)基、普通麥康凱瓊脂和伊紅美蘭瓊脂的平板上，接種時因注意接種環(huán)的溫度不宜過高，以免殺死病原菌，接種完后，將其培養(yǎng)基倒置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行過夜培養(yǎng)[5]。

2.2 引物設計

參考基因庫所錄的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌毒力基因序列，用DNA 序列軟件找出保守序列，采用Primer 5設計引物[6-7]（表1），由上海生物工程有限公司合成。

2.3 PCR檢測

反應條件及相應的反應體系參照文獻[8]，反應結束后5μl PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2.4 生化試驗

按參照文獻[9]，進行15項生化試驗。將試驗菌株分別接種于各個生化管中，37℃、24～48 h培養(yǎng)，觀察并記錄結果。

2.5 藥物敏感性試驗

將試驗菌株用移液槍各吸取1 000μl置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，并用涂菌棒涂抹均勻，標號。將購買的14種抗生素藥敏片按區(qū)域分別貼于培養(yǎng)基中，倒置放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察。 藥敏試驗按照CLS推薦的K-B法進行。抑菌結果可根據(jù)NCCLS(2013)公布的標準以敏感、中 介、耐 藥 3 種形式對抑菌圈的大小作出標準的判定[10]（表2）。

3 結果

3.1 細菌的分離培養(yǎng)與鑒定

本試驗菌株在麥康凱培養(yǎng)基上生長出粉紅色的單一菌落；在普通培養(yǎng)基上長出無色單一的菌落，邊緣整齊、稍凸起、光滑并兼濕潤；在伊紅美蘭培養(yǎng)基上長出黑色帶金屬光澤的單一菌落；染色鏡檢為粉紅色、短桿狀、兩端鈍圓，結果見圖1、圖2。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 部分菌株染色鏡檢圖

3.2 生化試驗

生化試驗結果顯示：6株疑似腸產(chǎn)毒性大腸桿菌均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖均能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；吲哚、硫化氫、硝酸鹽、明膠、M-R試驗均為陽性；肌醇、山梨醇、V-P、檸檬酸、尿素試驗均為陰性，結果詳見表5，由表可知本試驗分離菌株的生化特性與相關文獻報道基本保持一致[11]。結果見表3。

表1 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌毒力基因PCR擴增及測序所用引物

表2 藥敏試驗判定標準

表3 生化試驗結果

3.3 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的毒力分型鑒定

對疑似牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌22對毒力基因進行引物檢測時，只檢出兩對（STP和CS8）毒力基因，共檢測出6株腸腸毒素性大腸桿菌，其檢出率均為33.33% ，檢測結果見圖3。

圖3 CS8基因及stp基因重組質粒鑒定的電泳圖

3.4 藥物敏感性試驗結果

藥敏試驗結果顯示：6株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌除了對青霉素和紅霉素不敏感外，其余藥物均為高度敏感[12]，見表4、表5。

4 討論與分析

本研究對西藏班戈縣散養(yǎng)牦牛牛群的病料進行了細菌的分離鑒定，通過麥康凱瓊脂培養(yǎng)基跟伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)特性與大腸桿菌特性基本相同的情況下做出初步確定。且本菌通過革蘭氏染色觀察得陰性菌，中等大小的桿菌，菌體兩端鈍圓，散在或單個存在；通過生化試驗再次證明本試驗菌株符合大腸桿菌的生化特性。因此，本試驗6株病原菌的培養(yǎng)鑒定、革蘭氏染色特點、生化特性的結果均符合大腸桿菌的分離培養(yǎng)特性，與相關文獻報道相符。

PCR檢測結果顯示：對疑似牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌22對毒力基因進行引物檢測時，檢測出兩對（STP和CS8）毒力基因，共檢測出6株腸腸毒素性大腸桿菌，檢出率均為33.33% 。此檢測結果與相應的文獻報道相符。

表4 常用的14種抗生素的藥敏片法抑菌結果

表5 6株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌對14種抗生素的藥敏試驗結果

藥物敏感性分析試驗表明：在14種常用的抗菌藥物（氯霉素、諾氟沙星、萬古霉素、頭孢唑、鏈霉素、青霉素、丁胺卡那、四黃素、阿奇霉素、復方諾明、紅霉素、呋喃妥因、慶大霉素、頭孢西?。┲?，病原菌對青霉素和紅霉素不敏感，造成這樣的主要原因可能是因為青霉素和紅霉素在臨床上廣泛應用使細菌產(chǎn)生了耐藥性。除了對青霉素不敏感外，其余藥物均為高度敏感。由此表明，西藏班戈縣應加大對大腸桿菌病的重視，臨床診斷及治療時，一定要根據(jù)具體條件并結合藥敏試驗合理選藥，尤其是腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌菌株的毒力相當強，一旦引發(fā)此病必定會造成重大的經(jīng)濟以及各方面的損失。通過藥敏試驗為保護班戈縣牦牛生態(tài)廠牦牛大腸桿菌病的防治提供了有利的依據(jù)，更重要的是為西藏牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的預防及防治措施提供了相應的科學依據(jù)[13]。

當動物機體抵抗力下降的情況下方可引起犢牛及成年牦牛的發(fā)病。因此，除了定期注射疫苗外，還要加強對牦牛的飼養(yǎng)管理、加強檢疫，其最主要的是維護動物并提供自身所需的營養(yǎng)物質，使機體各項指標處于平衡狀態(tài)，此法對預防和控制大腸桿菌病的發(fā)生有一定的科學意義[10-15]。

本次試驗從嚴重腹瀉的牦牛糞便及肝門試子中分離到了產(chǎn)毒素性大腸桿菌，對其進行藥敏試驗,因此發(fā)生該病時，應該選擇對此菌敏感的藥物進行治療。臨床用藥時應有針對性，應該根據(jù)藥物敏感性試驗結果選擇對此菌敏感的藥物進行治療，亂用或濫用抗生素藥物，會造成一些不良反應，如過敏反應，不僅容易導致臨床耐藥菌株的增多，會造成治療的不完善及失敗，而且隨之大腸桿菌耐藥菌株的增多，給臨床用藥帶來了極大的困難。曾有學者提出牦牛中帶耐藥菌株的大腸桿菌可以通過動物的飼料和牦牛肉食品的加工逐漸感染到人的體內，獸醫(yī)臨床耐藥菌株的不斷增多可能是就是造成人醫(yī)潛在的威脅。牦牛綠色食品正受到臨床濫用抗生素的威脅，所以通過藥敏試驗結果合理選用藥是當務之急[16]。