馬新稱，黃燕秋，肖 雪，易法令

（1.廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院 廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥信息工程學(xué)院 廣州 510006）

高血壓是以動脈血壓持續(xù)升高為特征的“心血管綜合征”，近年來，其發(fā)病率普遍升高且發(fā)病年齡降低，嚴(yán)重患者多死于腦血管病和心腎衰竭[1-3]。目前，治療高血壓的主要措施為化學(xué)藥治療，但是化學(xué)藥在快速降壓的同時(shí)產(chǎn)生副作用，如β-受體阻斷劑類在降低血壓的同時(shí)可誘發(fā)哮喘[4]。研究表明部分中藥在發(fā)揮降壓作用的同時(shí)兼具器官保護(hù)作用[5,6]。研究中藥的降壓作用、篩選有效成分以及探討降壓作用機(jī)制，已然形成趨勢。

大薊為菊科植物薊Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分，收載于《中國藥典》（2015 年版），其味甘、苦，性涼，歸心、肝經(jīng)，有涼血止血、散瘀解毒消癰之功效[7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，大薊具有抗腫瘤、抑菌、治療糖尿病、肥胖、保肝護(hù)肝等多種藥理作用[8,9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)大薊根水劑、堿液、酸性醇浸出液等均有降壓作用[10]。臨床上，大薊根與杜仲葉、夏枯草合用可安全有效降壓，并且對高血壓易感者具有早期預(yù)防、強(qiáng)身保健的作用[11]。作用機(jī)制方面，大薊主要通過內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO發(fā)揮降壓作用[12]。但是，中藥發(fā)揮療效具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，目前對于大薊發(fā)揮降壓作用的藥效成分及作用機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)認(rèn)識。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物分子網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，從相互聯(lián)系的角度研究問題，與中藥的核心思想不謀而合，在預(yù)測中藥活性成分群及作用靶點(diǎn)、闡明作用機(jī)制、解釋中藥配伍規(guī)律、發(fā)現(xiàn)新的臨床適用癥等方面具有廣泛應(yīng)用[13,14]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法首次從整體上分析中藥大薊治療高血壓疾病的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)大薊治療高血壓疾病的潛在藥效成分、新的作用靶點(diǎn)及信號通路，促進(jìn)大薊的臨床應(yīng)用，同時(shí)為高血壓疾病的機(jī)制研究提供方向。

表1 26種大薊化學(xué)成分信息

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)收集

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集大薊的所有化學(xué)成分及相應(yīng)作用靶點(diǎn)。

1.2 成分-靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、邊等屬性。其中，節(jié)點(diǎn)分別代表成分和作用靶點(diǎn)，邊代表成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的邊、節(jié)點(diǎn)分別成分和和靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)平均度，據(jù)此提取大薊“成分-靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)[15]。其中，節(jié)點(diǎn)度是指與節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的邊的數(shù)目，代表成分與靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)程度，節(jié)點(diǎn)平均度代表成分與靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的平均程度。

1.3 疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將成分作用的核心靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為人類基因名，并與GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://www.omim.org/）和TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的與原發(fā)性高血壓相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對，采用Venn diagrams（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）提取共有靶點(diǎn)，即為原發(fā)性高血壓疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 生物學(xué)功能與通路分析

為了進(jìn)一步研究關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)功能及信號通路，利用Cytoscape3.6.1軟件中的CluGO插件對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。其中，GO功能富集和KEGG通路富集分析均設(shè)置參數(shù)為P ＜0.05。

1.5 成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了從整體上分析成分、靶點(diǎn)與信號通路之間的相互作用關(guān)系，采用Cytoscape3.6.1 軟件中的Merge 功能將“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)與上述“成分-靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，構(gòu)建大薊“成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)收集

收集TCMSP 數(shù)據(jù)庫中大薊的所有化學(xué)成分及相應(yīng)作用靶點(diǎn)，得到26 種化學(xué)成分（表1）和119 個(gè)作用靶點(diǎn)，共計(jì)289對成分-靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。

2.2 成分-靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

所構(gòu)建的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中共包含145 個(gè)節(jié)點(diǎn)和285 條邊，其中285 條邊代表成分和靶點(diǎn)的相互作用；26個(gè)節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分，節(jié)點(diǎn)平均度為10.96，大于節(jié)點(diǎn)平均度的成分有11 個(gè)；119 個(gè)節(jié)點(diǎn)代表成分作用靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)平均度為2.39，大于節(jié)點(diǎn)平均度的靶點(diǎn)有33個(gè)，據(jù)此提取大薊成分-靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)（圖1）。

2.3 疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

在GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫中共計(jì)檢索得到5193個(gè)原發(fā)性高血壓相關(guān)基因，從中提取得到29個(gè)原發(fā)性高血壓疾病靶點(diǎn)，并構(gòu)建疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖2）。

2.4 生物學(xué)功能與通路分析

在GO 功能富集分析中，共確定27 條GO 條目，其中21 條生物過程主要涉及腺苷酸環(huán)化酶抑制G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體、通過化學(xué)信號調(diào)節(jié)心臟收縮力等；6條分子功能包括兒茶酚胺結(jié)合、兒茶酚胺G 蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、腎上腺素能受體活性以及α-腎上腺素能受體活性（圖3）。

圖1 成分-靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)

圖2 疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過KEGG 通路富集分析，共得到13條相關(guān)通路（圖4）。結(jié)果顯示大薊治療高血壓機(jī)制主要涉及脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、鈣信號通路、酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、唾液分泌等信號通路。

2.5 成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為進(jìn)一步研究成分、靶點(diǎn)與信號通路之間的相互作用關(guān)系，采用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建“靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)，并采用Merge 功能將其與上述“成分-靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，構(gòu)建大薊“成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)(圖5)。結(jié)果顯示中藥大薊中的發(fā)揮抗高血壓作用的化學(xué)成分主要包括油酸、豆甾醇、紫丁香酚苷、鄰苯二甲酸二丁酯，協(xié)同作用于PTGS1、PTGS2、CHRM3、CHRM1、SLC6A2、CHRM2、ADRβ2、SLC6A3等靶點(diǎn)，參與心臟收縮力調(diào)節(jié)、鈣信號通路、氨基酸代謝等13 條信號通路(表2)。

圖4 KEGG通路富集分析條形圖

3 討論

本文構(gòu)建的“成分-靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)中，涉及大薊11種藥效成分和33個(gè)靶點(diǎn)。其中，發(fā)揮大薊抗高血壓作用的潛在藥效物質(zhì)主要為油酸、豆甾醇、紫丁香酚苷、鄰苯二甲酸二丁酯等，以上4種關(guān)鍵藥效成分共同作用于PTGS1 和PTGS2 靶點(diǎn)，而油酸、豆甾醇和鄰苯二甲酸二丁酯三種成分作用于RXRα 靶點(diǎn)，紫丁香酚苷、鄰苯二甲酸二丁酯和豆甾醇共同作用于CHRM2、ADRα1A、SLC6A2、CHRM1、SLC6A3、ADRβ2 和CHRM3，體現(xiàn)了中藥多成分協(xié)同作用的特點(diǎn)。

圖5 成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)

在“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中，共計(jì)有29個(gè)高血壓疾病靶點(diǎn)，主要為PTGS1、PTGS2、CHRM3、CHRM1、SLC6A2、CHRM2、ADRβ2、SLC6A3 等。研 究 表 明，PTGS1 和PTGS2 均為前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶，其中PTGS2 基因與女性高血壓病的發(fā)生密切相關(guān)[16]。CHRM3、CHRM1及CHRM2分別是毒蕈堿乙酰膽堿受體的不同亞型，研究發(fā)現(xiàn)CHRM3 與原發(fā)性高血壓患者染色體q43位置具有關(guān)聯(lián)[17]。作為去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體，SLC6A2在“遞質(zhì)-受體”信號傳導(dǎo)通路中具有重要的調(diào)控作用，流行病學(xué)研究表明SLC6A2 基因多態(tài)性與高血壓疾病具有相關(guān)性[18]。此外，黃昉萌等[19]研究發(fā)現(xiàn)高血壓病肝陽上亢證患者攜帶SLC6A2 啟動子2 的GC/CC 型頻率高于非肝陽上亢證患者，推測SLC6A2多態(tài)性影響交感神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，進(jìn)而表現(xiàn)出肝陽上亢證證候群。Kim 等[20]揭示了SLC6A3 與高血壓之間的遺傳關(guān)聯(lián)，并且SLC6A3的特異性VNTR等位基因可能是高血壓的危險(xiǎn)因素。ADRβ2 則是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，介導(dǎo)心臟交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對血壓的短期和長期調(diào)節(jié)均有影響[21]。以上基因功能均與高血壓相關(guān)，分析大薊可能通過這些關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮降壓作用。

對預(yù)測的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，進(jìn)一步探究大薊降低高血壓的作用機(jī)制。富集的生物學(xué)過程包括通過化學(xué)信號調(diào)節(jié)心臟收縮力、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體激活磷脂酶C、G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體抑制腺苷酸環(huán)化酶等，通路富集分析顯示其參與脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、鈣信號通路、酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、唾液分泌等信號通路。文獻(xiàn)報(bào)道，大部分藥物治療高血壓的作用機(jī)制主要涉及降低心肌收縮力以減少血容量、選擇性阻滯平滑肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流、舒張血管、改善血管內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)血脂等方面[3]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測大薊作用于ADRβ1、ADRβ2、ADRα1A、ADRα1B 等腎上腺素能受體和鈉通道蛋白亞基SCN5α，提示其降低心肌細(xì)胞收縮力和減少血容量而發(fā)揮降壓作用；而PRKACα、ADRβ1、ADRβ2、NOS2、NOS3、HTR2A、CHRM2、CHRM1、CHRM3、ADRα1A 和ADRα1B 靶點(diǎn)均涉及鈣信號通路，其可能通過選擇性阻滯鈣離子內(nèi)流呈現(xiàn)降壓作用。其中，NOS2 和NOS3 與精氨酸和脯氨酸代謝相關(guān)，推測二者亦參與調(diào)節(jié)精氨酸和脯氨酸代謝發(fā)揮降血壓作用；PTGS1和PTGS2為前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶，研究表明二者可與分布在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞上的前列環(huán)素受體G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合激

活G蛋白，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平升高，進(jìn)而抑制血小板聚集，血管平滑肌松弛[22]。此外，血脂的升高可致血液粘稠增加，PTGS2 和PTGS1 可能與PRKACα、ADRβ 1、ADRβ2、PTGS2、PTGS1等靶點(diǎn)共同參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、降低血液粘稠度從而降低血壓。

表2 關(guān)鍵疾病靶點(diǎn)及信號通路

總之，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)，從整體上分析大薊成分、靶點(diǎn)、信號通路之間的相互作用關(guān)系，推測中藥大薊通過油酸、豆甾醇、紫丁香酚苷、鄰苯二甲酸二丁酯等潛在藥效成分 協(xié) 同 作 用 于PTGS1、PTGS2、CHRM3、CHRM1、SLC6A2、CHRM2、ADRβ2、SLC6A3 等多個(gè)靶點(diǎn)，參與心臟收縮力調(diào)節(jié)、鈣信號通路、氨基酸代謝等多條信號通路發(fā)揮治療高血壓疾病的作用，為中藥大薊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與機(jī)制研究提供方向?；谝陨暇W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的預(yù)測結(jié)果，擬進(jìn)一步對大薊的潛在藥效成分和作用機(jī)制開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。