氰化物是酒類的一項(xiàng)重要食品安全指標(biāo)。白酒中氰化物來(lái)源有很多種：如果白酒在釀造過(guò)程中使用了使用木薯和薯類植物為原料，根部外表大量氫氰酸會(huì)導(dǎo)致氰化物產(chǎn)生，釀酒過(guò)程中可能使用了受污染生產(chǎn)用水、使用含氰化物基酒或調(diào)味酒[1]、使用農(nóng)藥污染的原料和釀酒過(guò)程中的變異反應(yīng)[2]都有可能帶入氰化物污染，所以白酒氰化物超標(biāo)時(shí)有發(fā)生。GB2757-2017中規(guī)定氰化物（以HCN計(jì)按100%酒精度折算）限量≤8.0mg/kg[3]。GB 5009.36-2016中第一法紫外分光光度法是白酒中氰化物檢測(cè)最常用的檢測(cè)方法，與被替代方法GB 5009.48-2003的4.7相比，新方法采用堿性條件下加熱除去高沸點(diǎn)有機(jī)物,然后在pH=7.0條件下,用氯胺T將氰化物轉(zhuǎn)變?yōu)槁然?再與異煙酸-吡唑啉酮作用,生成藍(lán)色染料,與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量的原理，主要優(yōu)化了檢測(cè)過(guò)程中部分樣品在顯色過(guò)程中由于高沸點(diǎn)有機(jī)物引起的顯色液渾濁問(wèn)題，即GB 5009.36-2016中第一法的5.2.1步驟：“吸取1.0mL試樣于50mL燒杯中,加入5mL2g/L氫氧化鈉溶液,放置10min,然后放于120℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1mL,取下放至室溫,用2g/L氫氧化鈉溶液轉(zhuǎn)移至10mL具塞比色管中,最后加2g/L氫氧化鈉至5mL”[4][5]。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)由于該步驟中對(duì)于“120℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1mL”最終剩余溶液體積沒有強(qiáng)調(diào)精確，所以在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中就會(huì)出現(xiàn)相同樣品在加熱后最終剩余溶液體積（相同加熱條件下通過(guò)加熱時(shí)長(zhǎng)反映）不同引起檢測(cè)結(jié)果不一致的情況。同時(shí)在檢測(cè)中還發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格按照該步驟操作，將溶液120℃電加熱板上加熱至溶液＜2ml時(shí)，大部分白酒樣品加標(biāo)回收率都很低且不同白酒樣回收率差異較大。為探究檢測(cè)過(guò)程中對(duì)白酒中氰化物含量檢測(cè)影響因素，針對(duì)GB 5009.36-2016中第一法的5.2.1步驟進(jìn)行相關(guān)探索實(shí)驗(yàn)。

1.實(shí)驗(yàn)方法與材料：

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：

1.1.1 試劑：蒸餾水，無(wú)水乙醇，冰醋酸，乙酸乙酯、氫氧化鈉系列溶液(18g/L，15g/L，12g/L，10g/L，5g/L，2g/L)，硼氫化鉀堿溶液（0.3g硼氫化鉀溶于100ml 2g/L氫氧化鈉溶液中），2g/L乙酸溶液(1+24)，酚酞-乙醇指示液(10g/L)，磷酸鹽緩沖溶液[(0.5mol/L)pH7.0]，異煙酸-吡唑啉酮溶液,氯胺T溶液(10g/L)，水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(50μg/mL)，氰離子標(biāo)準(zhǔn)中間液 (1μg/mL)。

1.1.2 儀器、器皿：雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU1900北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司）,電加熱板(DB-3金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠)，千分之一電子天平(JY203上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司)，50ml玻璃燒杯,10mL具塞比色管,25mL具塞比色管。

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1.1.3 樣品：

1.1.1.1 市售不同類型白酒

1.1.1.2 模擬白酒樣品：使用無(wú)水乙醇、蒸餾水、乙酸、乙酸乙酯配制的模擬白酒樣品

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：

1.2.1 檢測(cè)加熱時(shí)長(zhǎng)對(duì)加標(biāo)回收率的影響（反映最終加熱后剩余液體）

在相同的條件下，即加熱溫度、加熱板、被測(cè)樣品，全部一致的情況下，通過(guò)不同的加熱時(shí)長(zhǎng)處理(20min,30min,40min,50min,60min,70min,80min)。實(shí)驗(yàn)操作除了5.2.1步驟“于120℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1mL,”外，其余步驟按照GB 5009.36-2016中第一法操作。通過(guò)樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同三種白酒樣品在不同加熱時(shí)長(zhǎng)下樣品回收率。

1.2.2 檢測(cè)加入堿液濃度及標(biāo)品添加濃度對(duì)加標(biāo)回收率的影響

在相同的條件下，通過(guò)加入5ml不同濃度濃度氫氧化鈉溶液(2g/L,5g/L，10g/L,15g/L,18g/L)，即加熱溫度、加熱時(shí)長(zhǎng)、加熱板、被測(cè)樣品全部一致的情況下，實(shí)驗(yàn)操作除了5.2.1步驟“加入5mL2g/L 氫氧化鈉溶液”外，其余步驟按照GB 5009.36-2016中第一法操作。通過(guò)樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同三種白酒樣品在相同加熱時(shí)長(zhǎng)下樣品回收率。

在相同情況下，按照GB 5009.36-2016中第一法操作步驟，對(duì)三個(gè)白酒樣品添加不同量的標(biāo)品，檢測(cè)樣品在標(biāo)品不同添加濃度下的加標(biāo)回收率，檢測(cè)標(biāo)品添加濃度對(duì)加標(biāo)回收率的影響。

1.2.3 樣品中總酸總酯及酒精度對(duì)加標(biāo)回收率影響

在相同情況下，按照GB 5009.36-2016中第一法操作步驟，對(duì)模擬樣品1-12號(hào)進(jìn)行樣品加標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)相同酒精度樣品中總酸總酯對(duì)加標(biāo)回收率影響及相同總酸總酯條件下乙醇與水的體積比（體現(xiàn)酒精度）對(duì)加標(biāo)回收率影響。

1.2.4 對(duì)方法優(yōu)化后加標(biāo)回收率的檢測(cè)

圖表1 不同加熱時(shí)長(zhǎng)對(duì)加標(biāo)回收率影響

通過(guò)提高氫氧化鈉濃度、縮短加熱時(shí)長(zhǎng)、添加還原劑的方式對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，檢測(cè)不同樣品的加標(biāo)回收率，找到最合適的檢測(cè)方法。

2.檢測(cè)數(shù)據(jù)與結(jié)果分析：

2.1 檢測(cè)加熱時(shí)長(zhǎng)對(duì)加標(biāo)回收率的影響（反映加熱后剩余溶液體積）

通過(guò)圖表1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：除了白酒樣品3在加標(biāo)濃度4mg/L時(shí)，由于整體回收率太低，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果低看不出明顯趨勢(shì)；樣品1和樣品2回收率隨著加熱時(shí)長(zhǎng)增加，其加標(biāo)回收率呈下降趨勢(shì)。樣品3在將加標(biāo)濃度增加到10mg/L后，隨加熱時(shí)長(zhǎng)增加，其加標(biāo)回收率也呈下降趨勢(shì)。即白酒樣品的加標(biāo)回收率隨加熱剩余液體體積的減少而減少，當(dāng)加熱時(shí)長(zhǎng)達(dá)到80min時(shí)，剩余液體＜2ml才能保證達(dá)到GB 5009.36-2016中第一法的5.2.1步驟中“加熱至溶液剩余約1mL”，而此時(shí)大部分樣品加標(biāo)回收率低于60%，部分樣品低于40%，通過(guò)縮短加熱時(shí)長(zhǎng)確實(shí)可以提高樣品加標(biāo)回收率，但是像樣品3這樣的白酒樣品，加熱時(shí)間低于30min會(huì)因?yàn)椴糠指叻悬c(diǎn)有機(jī)物（主要是醛類）揮發(fā)不徹底，導(dǎo)致后續(xù)步驟顯色過(guò)程出現(xiàn)渾濁，出現(xiàn)顯色偏淺，所以僅僅縮短加熱時(shí)長(zhǎng)無(wú)法獲得滿意的加標(biāo)回收率，這種變化趨勢(shì)在氰化物陽(yáng)性樣品中也存在，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖表2。

圖表2 陽(yáng)性樣品的氰化物含量隨加熱時(shí)長(zhǎng)變化

2.2 檢測(cè)加入堿液濃度及標(biāo)品添加濃度對(duì)加標(biāo)回收率的影響

通過(guò)圖表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，確實(shí)可以通過(guò)提高加入固定氰化物的堿液濃度減少加熱過(guò)程中氰化物損失來(lái)提高添加回收率，但是加入堿液到達(dá)一定濃度后可能影響到后續(xù)顯色，且對(duì)于下一步調(diào)節(jié)pH值帶來(lái)困難，所以大部分樣品在大約10g/L的氫氧化鈉濃度下具有最高添加回收率，再增加氫氧化鈉濃度后添加回收率反而會(huì)下降，且僅提高氫氧化鈉濃度不足以達(dá)到滿意的加標(biāo)回收率。

圖表3 不同堿液濃度對(duì)加標(biāo)回收率的影響

圖表4 不同加標(biāo)濃度對(duì)加標(biāo)回收率的影響

而根據(jù)圖表4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知在檢測(cè)真實(shí)酒樣過(guò)程中，標(biāo)品添加濃度越高的情況下，回收率越高。這就解釋了在檢測(cè)過(guò)程中相同的酒樣在不同的標(biāo)品添加濃度下為何會(huì)造成添加回收率存在很大的差異，主要原因可能是不同濃度下氰化物損失速率不同造成的。

2.3 檢測(cè)樣品中酒精度及總酸總酯對(duì)加標(biāo)回收率影響

通過(guò)圖表6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，對(duì)模擬樣品的加標(biāo)回收率檢測(cè)，在相同的酒精度（乙醇水體積比體現(xiàn)）情況下，總酸、總酯含量越高，樣品加標(biāo)回收率越低?？赡茉蚴菢悠分械目偹?、總酯會(huì)消耗溶液中的氫氧化鈉，影響堿液中對(duì)氰化物的固定 。

圖表6 50%（V/V)乙醇模擬樣品在不同總酸、總酯濃度下加標(biāo)回收率影響

圖表7 不同體積比乙醇模擬樣品在相同總酸、總酯濃度下加標(biāo)回收率影響

通過(guò)圖表7實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，對(duì)模擬樣品的加標(biāo)回收率檢測(cè)，在總酸、總酯含量相同的情況下，乙醇水體積比（體現(xiàn)酒精度）越高，加標(biāo)回收率越高。

2.4 對(duì)方法優(yōu)化后加標(biāo)回收率檢測(cè)

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)確定影響白酒中氰化物檢測(cè)影響因素很多，試驗(yàn)中我們可控的因素只有兩種：即加熱時(shí)長(zhǎng)（剩余溶液體積）和調(diào)節(jié)氫氧化鈉濃度，根據(jù)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，減少加熱時(shí)長(zhǎng)和將氫氧化鈉調(diào)節(jié)到合適濃度，可以提高加標(biāo)回收率，且單獨(dú)優(yōu)化一個(gè)因子無(wú)法保證所有樣品具有較高回收率。另外在實(shí)際操作中，按照GB 5009.36-2016中第一法的5.2.1步驟操作，在減少加熱時(shí)長(zhǎng)同時(shí)，由于剩余溶液體積增加，導(dǎo)致后續(xù)步驟中最終定容體積會(huì)超過(guò)規(guī)定的10ml，所以優(yōu)化方法將步驟中各液體體積擴(kuò)大一倍，定容體積增至25ml可解決這一問(wèn)題（后通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)堿液體積為5ml對(duì)檢測(cè)結(jié)果也未有明顯影響）。另外，由于部分含醛類物質(zhì)較多的白酒，加熱時(shí)長(zhǎng)太短會(huì)造成后續(xù)顯色過(guò)程渾濁，導(dǎo)致顯色偏淺，結(jié)果偏低，加熱時(shí)長(zhǎng)太長(zhǎng)又會(huì)造成氰化物損失，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)加入一定量的硼氫化鉀還原白酒中醛類物質(zhì)可以解決在加熱時(shí)間較短時(shí)顯色渾濁問(wèn)題。最終確定如下操作步驟可以保證大多數(shù)被測(cè)樣品加標(biāo)回收率能在95%以上，所有被測(cè)樣品加標(biāo)回收率在85%以上，具體操作步驟如下：

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（1）吸取2.0mL試樣于50mL 燒杯中,加入5mL 10g/L 氫氧化鈉溶液和0.3%硼氫化鉀100μl,放置10min,然后放于120℃電加熱板上加熱30min,取下放至室溫,用水轉(zhuǎn)移至25mL具塞比色管中,加水至10mL;

（2）用移液管分別吸取0mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL氰離子標(biāo)準(zhǔn)中間液置于25mL比色管中,加水至10mL。

（3）于試樣及標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入2滴酚酞指示劑,然后加入乙酸溶液調(diào)至紅色褪去,再用2g/L氫氧化鈉溶液調(diào)至近紅色,然后加4mL磷酸鹽緩沖溶液 (如果室溫低于20 ℃即放入 25 ℃ ～30 ℃水浴中10min),再加入0.4mL氯胺T溶液,搖勻放置3min,加入4mL異煙酸-吡唑啉酮溶液,加水稀釋至刻度,加塞混合均勻,在37℃恒溫水浴鍋中放置40min,取出用1cm 比色杯以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn),于波長(zhǎng)638nm處測(cè)吸光度。

3.結(jié)論：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)，我們得出如下結(jié)論：按照GB 5009.36-2016 第一法檢測(cè)白酒氰化物過(guò)程中，之所以會(huì)出現(xiàn)樣品檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定的原因是：該方法并未精確規(guī)定加熱剩余液體的體積，而加熱后剩余溶液體積的多少會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響；之所以會(huì)出現(xiàn)加標(biāo)回收率偏低且不穩(wěn)定的問(wèn)題，主要是因?yàn)榧訜岷笫Ｓ嗳芤憾嗌?，樣品中?biāo)品添加濃度，酒樣中酒精度、總酸、總酯含量不一致都會(huì)對(duì)樣品加標(biāo)回收率造成影響。究其原因主要是因?yàn)榧尤霘溲趸c濃度過(guò)低，加熱時(shí)長(zhǎng)過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致加熱過(guò)程中出現(xiàn)氰化物損失。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，即使增加堿液濃度，也無(wú)法在加熱至溶液只剩約1ml的情況下保證有很好的加標(biāo)回收率，說(shuō)明堿液固定氰化物在長(zhǎng)時(shí)間加熱時(shí)并不穩(wěn)定。而僅僅通過(guò)提高加入的堿液濃度或縮短加熱時(shí)長(zhǎng)，也無(wú)法保證檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，但如果通過(guò)同時(shí)提高加入的氫氧化鈉濃度和縮短加熱時(shí)長(zhǎng)并加入強(qiáng)還原劑硼氫化鉀情況下，可以使絕大多數(shù)白酒樣品具有較高加標(biāo)回收率且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。