楊振，王晶晶，聶亞光，代慧，王牧笛，程雷，許安,*

1. 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所，中國(guó)科學(xué)院強(qiáng)磁場(chǎng)與離子束物理生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031 2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，合肥 230026

環(huán)境污染是指人類向環(huán)境中排放某種物質(zhì)超過(guò)了環(huán)境的凈化能力從而引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題。隨著人類社會(huì)的發(fā)展越來(lái)越多的廢棄物被排放到環(huán)境中，例如工業(yè)生產(chǎn)中的“三廢”、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的農(nóng)藥以及生活污水等，這些污染物的排放會(huì)造成空氣污染、水污染和土壤污染等。世界衛(wèi)生組織對(duì)全世界200多個(gè)城市進(jìn)行大氣測(cè)定，嚴(yán)重污染城市中我國(guó)有多個(gè)城市上榜；有關(guān)數(shù)據(jù)顯示我國(guó)每年污水排放量在400億t左右，一半為工業(yè)污水；保守估計(jì)因環(huán)境污染問(wèn)題造成的經(jīng)濟(jì)損失約為2 000億元[1]。環(huán)境中的持久性有機(jī)污染物會(huì)使人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖和發(fā)育系統(tǒng)遭到破壞，甚至在一定程度上還會(huì)致癌，而重金屬會(huì)損傷動(dòng)物及人的骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)等[2]。近年來(lái)因大氣污染，每年超額死亡人數(shù)高達(dá)178 000人，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查因空氣污染導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率達(dá)30%以上[1]。

生殖系統(tǒng)是生物體產(chǎn)生生殖細(xì)胞、繁衍后代的重要系統(tǒng)，進(jìn)入環(huán)境中的化學(xué)或物理污染物會(huì)嚴(yán)重影響人類和動(dòng)物的生殖功能，造成生殖能力低下、配子活性下降等。如有機(jī)磷農(nóng)藥和鄰苯二甲酸酯類會(huì)造成睪丸發(fā)育障礙及精子數(shù)目降低[3-4]。長(zhǎng)期接觸苯系物的女工流產(chǎn)、早產(chǎn)和死產(chǎn)的概率相對(duì)于正常人群明顯提高[5]，同時(shí)苯系物還會(huì)造成雄性生殖系統(tǒng)功能障礙、精子畸形等[6]。重金屬的毒性在20世紀(jì)的痛痛病、水俁病之后已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，鉛可直接穿過(guò)胎盤屏障，增加流產(chǎn)率和早產(chǎn)率[7]；錳會(huì)減少男性睪酮的分泌，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致腎上腺及睪丸萎縮[8]。伴隨著新的化學(xué)物質(zhì)被大量生產(chǎn)，一系列的未知危險(xiǎn)也隨之而來(lái)，因此，對(duì)各種常見(jiàn)及新型污染物進(jìn)行生殖毒性評(píng)價(jià)并制定安全的使用范圍標(biāo)準(zhǔn)是必要的。

秀麗隱桿線蟲全基因組測(cè)序在1998年完成，其基因與人類存在高度同源性[9]，身體透明，可通過(guò)熒光標(biāo)記觀察線蟲體內(nèi)的相關(guān)過(guò)程[10]。秀麗隱桿線蟲的生殖系統(tǒng)已被研究得較為透徹[11]，其生殖腺呈明顯的梯度發(fā)育，可一次在單條生殖腺上觀察到減數(shù)分裂的各個(gè)階段[12]。線蟲生殖腺細(xì)胞周期停滯、生殖細(xì)胞凋亡等多個(gè)終點(diǎn)常被用來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境污染物的生殖毒性。秀麗線蟲世代時(shí)間及子代數(shù)穩(wěn)定，卵細(xì)胞數(shù)量和子代數(shù)可用于評(píng)價(jià)產(chǎn)卵器功能和繁殖能力，而世代時(shí)間可用于評(píng)價(jià)其繁殖速度[13]。利用秀麗線蟲已揭示了多種環(huán)境因素誘導(dǎo)的生殖毒性響應(yīng)機(jī)制，如氧化應(yīng)激、DNA損傷應(yīng)答通路、MAPK通路等[14]，為進(jìn)一步探究各種環(huán)境因素的生殖毒性及其機(jī)制、以及相關(guān)疾病的預(yù)防和診斷工作提供了重要的理論依據(jù)。

1 化學(xué)污染物的生殖毒性研究(Study on reproductive toxicity of chemical factors)

隨著人類社會(huì)的發(fā)展，被使用最多的應(yīng)屬化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)包括天然存在的和人工合成的，有無(wú)機(jī)物也有有機(jī)物，例如重金屬、納米材料和一些有機(jī)農(nóng)藥等。據(jù)估計(jì)，我國(guó)被重金屬污染的土地已接近20 km2，約占總耕地的20%，與澳大利亞、美國(guó)等國(guó)家相比，我國(guó)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在重金屬指標(biāo)數(shù)量上要少1/3～1/2[15]。全球70多個(gè)國(guó)家約14億人的飲用水受到砷污染，與鎘一樣砷可通過(guò)水稻富集，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)身體健康造成威脅[16]。

持久性有機(jī)污染物(POPs)是一類具有持久性、生物蓄積性和高毒性等特點(diǎn)的有機(jī)污染物，在土壤中的半衰期在1～12年左右，有的長(zhǎng)達(dá)600年，可通過(guò)食物鏈富集而進(jìn)入人體，有機(jī)氯殺蟲劑是其中比較具有代表性的一類物質(zhì)，我國(guó)歷年生產(chǎn)的滴滴涕(DDT)高達(dá)39.81萬(wàn)t，即使在禁用DDT 20年后一些地區(qū)農(nóng)業(yè)土壤中最高殘留量仍在1 mg·kg-1以上[17]。據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，妊娠期食用有機(jī)氯污染的魚會(huì)造成出生的兒童體重輕、腦袋小和認(rèn)知能力差等[2]。除了重金屬與持久性有機(jī)物以外，近年來(lái)一些新的物質(zhì)被大量投入到工業(yè)生產(chǎn)中，并進(jìn)入人們的生活之中，例如納米材料被廣泛應(yīng)用于光電器件、醫(yī)療等領(lǐng)域，因此探究這些化學(xué)物是否對(duì)生態(tài)及人體健康存在威脅就顯得至關(guān)重要。利用秀麗隱桿線蟲對(duì)重金屬、納米材料、大氣顆粒物和典型有機(jī)污染物的生殖毒性評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。

1.1 重金屬對(duì)生殖系統(tǒng)的影響

重金屬是指那些相對(duì)密度大于5的金屬，包括金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鐵(Fe)和鉛(Pb)等，而在環(huán)境污染方面主要指汞(水銀，Hg)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr)以及類金屬砷(As)等生物毒性較為顯著的重金屬元素。這些重金屬可進(jìn)入大氣、土壤以及水體，可通過(guò)食物鏈或者呼吸系統(tǒng)進(jìn)入人體，從而對(duì)人體造成傷害。

Guo等[18]在研究重金屬對(duì)秀麗線蟲的生殖毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，成蟲暴露在高濃度的Pb、Hg、Cd和Cr(100 μmol·L-1)中時(shí)會(huì)顯著降低子代數(shù)，而低濃度(2.5 μmol·L-1)并不會(huì)降低子代數(shù)；將L1～L4期的幼蟲進(jìn)行暴露時(shí)，低濃度的重金屬便會(huì)造成子代數(shù)的減少，甚至2.5 μmol·L-1的Pb、Hg會(huì)明顯影響子代數(shù)目，且這種現(xiàn)象從L4期到L1期逐漸嚴(yán)重，由此可看出重金屬對(duì)生殖能力的影響不僅與劑量有關(guān)，還和暴露的時(shí)期有關(guān)，即暴露時(shí)期越早敏感性越強(qiáng)。之后孫娜等[19]對(duì)Pb、Hg和Cd的生殖毒性進(jìn)行了研究，也觀察到了類似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些重金屬在10～50 μg·L-1的濃度下就可顯著降低子代數(shù)，同時(shí)在相同的重金屬暴露條件下，線蟲體內(nèi)的受精卵數(shù)目減少，陰門畸形率顯著升高，陰門表面由光滑逐漸表現(xiàn)為輕微凸起；50 μg·L-1Pb、Cd暴露會(huì)造成產(chǎn)卵器表面破裂，影響受精卵的排出。這與Wu等[20]在研究Hg的生殖毒性時(shí)觀察到的一致，Wu等發(fā)現(xiàn)L4期的幼蟲暴露于Hg 12 h后會(huì)造成子宮和性腺發(fā)育的異常，如引起性腺臂的縮短，由此推測(cè)子代數(shù)的減少可能是由于受精卵數(shù)量降低和性腺及子宮結(jié)構(gòu)損傷共同導(dǎo)致的。Wang等[21]在研究Ni的毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ni在2.5 μmol·L-1的濃度下即造成子代數(shù)的減少以及世代時(shí)間的增加，并且這種現(xiàn)象還會(huì)持續(xù)到子代中，且濃度越高這種毒效應(yīng)在子代中持續(xù)的時(shí)間越久。

1.2 納米材料對(duì)生殖系統(tǒng)的影響

隨著納米材料的廣泛使用，納米材料對(duì)環(huán)境造成的潛在威脅也受到越來(lái)越多的關(guān)注，通過(guò)熒光標(biāo)記的納米材料喂食線蟲，可清楚地觀察到納米材料在線蟲體內(nèi)的分布情況[22]，通常納米材料主要在咽泵和腸道中轉(zhuǎn)運(yùn)，但也發(fā)現(xiàn)可在性腺和早期胚胎的細(xì)胞質(zhì)中積累。

Yang等[23]利用線蟲對(duì)納米級(jí)零價(jià)鐵(nZVL)、氧化鐵(nFe3O4)和亞鐵離子的生殖毒性進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)3種形式的鐵都會(huì)造成子代數(shù)的嚴(yán)重減少，同時(shí)造成活性氧成分的增加，但是nZVL生殖毒性會(huì)傳遞到F1、F2代，而在F3、F4代中得到恢復(fù)，這可能是由于鐵在F0和F1代中的積累產(chǎn)生了很高的活性氧，最終導(dǎo)致多代的生殖毒性。Zhao等[24]在用氧化石墨烯(GO)對(duì)線蟲進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)0.1～1 mg·L-1的GO并不會(huì)對(duì)線蟲造成明顯的傷害，而用10～100 mg·L-1的GO處理后觀察到了相比于對(duì)照組更多的生殖細(xì)胞凋亡(吖啶橙(AO)活體染色)，子代數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)量也發(fā)生明顯減少，此結(jié)果表明GO通過(guò)生殖細(xì)胞的凋亡造成生殖腺的發(fā)育異常，使后代數(shù)目、卵母細(xì)胞數(shù)量及排卵率均發(fā)生下降，并增加胚胎致死率。研究發(fā)現(xiàn)鎳納米顆粒會(huì)造成秀麗線蟲子代數(shù)目的減少以及世代時(shí)間的增加，說(shuō)明秀麗線蟲的生殖能力和繁殖速度均受到影響[25]，孔璐等[26]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鎳納米顆粒會(huì)誘導(dǎo)線蟲的精子發(fā)生缺陷，精子的形態(tài)、活性和運(yùn)動(dòng)能力都受到很大的影響，而這些性質(zhì)是保證精子能夠順利受精的重要因素，因此納米材料不僅可以影響生殖腺的發(fā)育從而影響線蟲的生殖能力，還可以造成配子的發(fā)生缺陷從而影響線蟲的受精。

1.3 有機(jī)物對(duì)生殖系統(tǒng)的影響

久效磷作為一種有機(jī)磷殺蟲劑，具有很強(qiáng)的觸殺作用，殺蟲譜廣，殺蟲效果好。在研究久效磷的生理毒性時(shí)，將L4期的幼蟲分別暴露于濃度為0.85、1.7和3.4 μmol·L-1的久效磷4 h，發(fā)現(xiàn)久效磷能顯著降低線蟲的子代數(shù)，且呈濃度依賴性，3.4 μmol·L-1時(shí)子代數(shù)降低高達(dá)73%，且線蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶(AchE)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及谷胱甘肽(GSH)水平都顯著降低[27]。

硫丹主要用作農(nóng)用殺蟲劑，由于其劇毒性、生物蓄積性和內(nèi)分泌干擾作用，已經(jīng)在多個(gè)國(guó)家被禁止使用。雖然被禁止使用，但硫丹殘留依然廣泛存在于環(huán)境中，危害生態(tài)健康。Du等[28]利用線蟲研究現(xiàn)，L1期的幼蟲暴露于0.1～10 μmol·L-1的硫丹中即可造成線蟲的產(chǎn)卵數(shù)和孵化率的降低以及產(chǎn)卵開始時(shí)間及產(chǎn)卵高峰期的推遲，在硫丹濃度為10 μmol·L-1時(shí)產(chǎn)卵數(shù)降低了76%左右。硫丹使線蟲的生殖腺細(xì)胞死亡數(shù)顯著增加，10 μmol·L-1時(shí)凋亡數(shù)達(dá)到正常組的1.6倍。而DNA損傷響應(yīng)基因ced-3、ced-4突變品系可顯著抑制硫丹誘導(dǎo)的生殖腺細(xì)胞凋亡，說(shuō)明DNA損傷響應(yīng)通路在硫丹誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到了重要作用。通過(guò)DAPI染色可發(fā)現(xiàn)，硫丹暴露后會(huì)導(dǎo)致線蟲生殖腺有絲分裂細(xì)胞數(shù)顯著減少，即誘發(fā)了生殖腺細(xì)胞周期停滯現(xiàn)象[28]。

表1 化學(xué)因素的生殖毒性效應(yīng)Table 1 Reproductive toxicity of chemical factors

多溴二苯醚作為阻燃劑被添加到復(fù)合材料中，目前已廣泛用于電子電氣設(shè)備和建筑材料等，You等[29]對(duì)溴二苯醚(BDE-3)的毒性研究發(fā)現(xiàn)，300 μg·mL-1的BDE-3可顯著降低線蟲的生育能力，如降低線蟲的產(chǎn)卵數(shù)，延長(zhǎng)產(chǎn)卵時(shí)間，并呈濃度依賴性。BDE-3的濃度在30 μg·mL-1時(shí)會(huì)顯著誘導(dǎo)生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)目的上升，達(dá)對(duì)照組的2倍，此外，0.03 μg·mL-1的長(zhǎng)期暴露可嚴(yán)重縮短線蟲的壽命。You等推測(cè)這些有機(jī)物通過(guò)誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的凋亡造成生殖腺發(fā)育缺陷從而導(dǎo)致一系列生殖毒性。

5-氟尿嘧啶作為一種抗代謝藥物被用于癌癥的治療，同時(shí)5-氟尿嘧啶也會(huì)給機(jī)體的其他功能帶來(lái)威脅，例如心臟中毒、肝中毒等。濃度為0.6 μg·mL-1的5-氟尿嘧啶長(zhǎng)期慢性暴露會(huì)誘導(dǎo)線蟲的生殖系統(tǒng)發(fā)育障礙，出現(xiàn)產(chǎn)卵延遲、蟲袋(胚胎無(wú)法排出而在體內(nèi)孵化)等現(xiàn)象，甚至使線蟲出現(xiàn)無(wú)陰門情況，在該濃度暴露條件下還會(huì)造成線蟲生殖腺有絲分裂受阻和生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目增加[30]，推測(cè)是由于5-氟尿嘧啶造成線蟲生殖細(xì)胞凋亡而使生殖系統(tǒng)發(fā)育受阻，最后導(dǎo)致生殖能力下降。

1.4 大氣顆粒物對(duì)生殖系統(tǒng)的影響

近年來(lái)由于農(nóng)業(yè)活動(dòng)及工業(yè)生產(chǎn)對(duì)空氣質(zhì)量造成了巨大的影響，霧霾已經(jīng)成了一個(gè)急需被解決的環(huán)境問(wèn)題，造成霧霾的主要原因就是大氣顆粒物的過(guò)度排放，這些大氣顆粒物可通過(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入人體從而危害人體健康，已被證明大氣顆粒物對(duì)呼吸系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)有很大的影響，例如導(dǎo)致鼻炎、支氣管炎以及心血管病和高血壓等。此外已有文獻(xiàn)報(bào)道大氣顆粒物同樣會(huì)造成生物體生殖系統(tǒng)的損傷。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，若將L4期秀麗隱桿線蟲急性暴露于PM2.5中，100 mg·L-1的PM2.5會(huì)造成秀麗隱桿線蟲生殖能力的顯著下降。而將暴露方式改成慢性暴露時(shí)，1 mg·L-1的PM2.5就會(huì)造成秀麗隱桿線蟲生殖能力的顯著下降，而這種效應(yīng)還會(huì)傳遞到子代中[31]。這種現(xiàn)象在王云彪等[32]的研究中也同樣被發(fā)現(xiàn)，并推測(cè)這種現(xiàn)象可能是由于PM2.5誘導(dǎo)生殖系統(tǒng)功能異常導(dǎo)致的。

柴油機(jī)顆粒物是大氣污染物中的重要成分，而紫外線又是太陽(yáng)光的主要成分，在戶外人們經(jīng)常會(huì)同時(shí)暴露在這2種影響因子中，因此研究?jī)烧呤欠窬哂新?lián)合作用十分必要。研究發(fā)現(xiàn)，若將早期的成年秀麗隱桿線蟲單獨(dú)暴露于柴油顆粒物提取物(DPE)或長(zhǎng)波紫外線(UVA)中，20～50 μg·mL-1的柴油顆粒物提取物以及0.2～1.0 J·cm-2的紫外線均不會(huì)造成生殖細(xì)胞的明顯損傷，而當(dāng)將柴油顆粒物提取物和紫外線共同暴露時(shí)，20 μg·mL-1DPE+0.5 J·cm-2UVA就會(huì)導(dǎo)致生殖細(xì)胞死亡的顯著上升，而通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)通路進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，兩者導(dǎo)致的生殖細(xì)胞死亡是通過(guò)凋亡通路介導(dǎo)的[33]。

2 物理污染物的生殖毒性研究(Study on reproductive toxicity of physical factors)

物理性污染是指由物理因素引起的環(huán)境污染。相對(duì)于化學(xué)污染物，物理污染常常被大眾所忽略。利用秀麗隱桿線蟲對(duì)輻射和磁場(chǎng)的生殖毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)的結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1 輻射對(duì)生殖系統(tǒng)的影響

輻射的靶細(xì)胞常常是一些組織的前體細(xì)胞，線蟲的陰門由22個(gè)陰門細(xì)胞所構(gòu)成，而這些陰門細(xì)胞又全部來(lái)自于3個(gè)前體細(xì)胞，因此可以利用線蟲陰戶的發(fā)育來(lái)研究輻射的生物效應(yīng)及其機(jī)制[34]。研究發(fā)現(xiàn)，50 Gy的輻射量并不會(huì)使線蟲致死，但可使線蟲的陰門發(fā)育畸形甚至發(fā)生無(wú)陰的現(xiàn)象，最后導(dǎo)致線蟲不育[34]。前體細(xì)胞第一次分裂之前(大約在S期)對(duì)輻射有最大的抗性，而在之后的分裂過(guò)程中對(duì)輻射較為敏感。隨著劑量的增加正常陰門線蟲的比例越來(lái)越少，即不正常陰門線蟲的比例越來(lái)越多，而這種不正常的陰門形成是由輻射引起的細(xì)胞死亡導(dǎo)致的。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或AO染色后發(fā)現(xiàn)，這種死亡的陰門細(xì)胞沒(méi)有顯現(xiàn)凋亡的特征，而是展現(xiàn)出壞死的細(xì)胞特征(染色體擴(kuò)散或無(wú)染色)。之后通過(guò)對(duì)Caspase和ced-9突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，這些突變菌株對(duì)輻射的敏感性與野生型菌株N2并沒(méi)有顯著不同，而ced-1突變的菌株雖然對(duì)輻射的敏感性與N2無(wú)明顯區(qū)別，但ced-1突變株的體內(nèi)有更多的死亡細(xì)胞殘留且不能被清除[34]，這些間接地證明了凋亡在輻射引起的陰門細(xì)胞死亡過(guò)程中并不發(fā)揮什么作用，而與細(xì)胞壞死更為相似。

Luo等[35]發(fā)現(xiàn)ing-3基因在輻射誘導(dǎo)的線蟲生殖細(xì)胞死亡過(guò)程中起到了很重要的作用，而ing-3參與了P53通路，在細(xì)胞程序性凋亡過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。他們發(fā)現(xiàn)剔除ing-3之后輻射誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡數(shù)量相較于野生型明顯下降，證明凋亡在輻射引起的生殖細(xì)胞死亡過(guò)程中扮演著重要的角色。Gartner等[36]在研究DNA損傷誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ced-3和ced-4突變后伽馬射線引起的生殖細(xì)胞死亡現(xiàn)象消失，而在ced-9突變(功能獲得型突變)后，輻射引起的生殖細(xì)胞死亡現(xiàn)象也完全消失，egl-1突變(功能喪失型突變)后凋亡現(xiàn)象被緩解，這說(shuō)明凋亡通路在輻射引起的細(xì)胞死亡過(guò)程中起到了重要作用。以上不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明輻射可通過(guò)不同的機(jī)制引起細(xì)胞的死亡，甚至在相同的細(xì)胞中。

2.2 磁場(chǎng)對(duì)生殖系統(tǒng)的影響

磁場(chǎng)是一種客觀存在但看不見(jiàn)、摸不著的特殊物質(zhì)，在現(xiàn)代日常生活中磁場(chǎng)到處可見(jiàn)，如發(fā)電機(jī)、電動(dòng)機(jī)和電話機(jī)等都能產(chǎn)生磁場(chǎng)，自然界中存在的磁波會(huì)對(duì)人類的大腦和臟器形成刺激性影響，電磁輻射在一定程度上對(duì)生物的生長(zhǎng)存在刺激作用，但強(qiáng)大的磁場(chǎng)也會(huì)對(duì)生物活動(dòng)存在負(fù)面影響，例如造成鴿子無(wú)法辨別方向等。

平均功率1.52 W和0.75 W的高功率毫米波對(duì)線蟲暴露3～5 min會(huì)顯著降低線蟲的產(chǎn)卵數(shù)，且隨著暴露時(shí)間的增加產(chǎn)卵數(shù)量下降更加嚴(yán)重；還誘導(dǎo)生殖腺遠(yuǎn)端出現(xiàn)不同程度的凹陷、空泡等腫瘤樣形態(tài)，loop區(qū)域呈現(xiàn)擁擠、無(wú)規(guī)則排列的未分化、未成熟卵細(xì)胞，且腺體遠(yuǎn)端無(wú)成熟的卵母細(xì)胞等，表明毫米波暴露可導(dǎo)致卵細(xì)胞在分化成熟過(guò)程中出現(xiàn)障礙。通過(guò)熒光標(biāo)記ced-1基因發(fā)現(xiàn)生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)量增加[37]。研究顯示8.5 T的穩(wěn)態(tài)強(qiáng)磁場(chǎng)并不會(huì)造成線蟲子代數(shù)的減少[38]，但在該強(qiáng)度的穩(wěn)態(tài)磁場(chǎng)作用下會(huì)顯著降低卵的發(fā)育，并會(huì)輕微延遲發(fā)育時(shí)間。用AO染色后發(fā)現(xiàn)8.5 T磁場(chǎng)會(huì)增加生殖細(xì)胞凋亡數(shù)量，隨著暴露時(shí)間的增加凋亡越明顯。Bojjawar等[39]在研究脈沖電磁場(chǎng)對(duì)秀麗線蟲生殖系統(tǒng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，18 kV·m-1或62 kV·m-1的納米級(jí)脈沖電磁場(chǎng)會(huì)顯著增加線蟲卵母細(xì)胞數(shù)量，但卵母數(shù)量的增加并不意味著子代數(shù)就會(huì)增加，在卵母細(xì)胞數(shù)量增加的同時(shí)，伴隨著死卵的數(shù)量以及未受精的卵母細(xì)胞數(shù)量增加。以上研究結(jié)果表明，磁場(chǎng)對(duì)生殖系統(tǒng)的影響與磁場(chǎng)的類型有關(guān)，不同的磁場(chǎng)作用甚至相反，關(guān)于磁場(chǎng)的生殖系統(tǒng)作用仍需要進(jìn)一步的探究。

3 生物污染物的生殖毒性研究(Study on reproductive toxicity of biological factors)

乙型肝炎病毒是一種DNA病毒，可以通過(guò)血液、精液和其他液體進(jìn)行傳播，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有20億人感染過(guò)乙肝病毒，每年約60萬(wàn)人死于急性或慢性乙型肝炎[40]。Chen等[41]利用秀麗線蟲對(duì)乙肝病毒的毒性做了初步了解，通過(guò)在線蟲體內(nèi)表達(dá)3種不同的表面抗原(大乙肝病毒表面抗原LHBsAg、中等乙肝病毒表面抗原MHBsAg和小乙肝病毒表面抗原SHBsAg)，發(fā)現(xiàn)3種不同的抗原均會(huì)使線蟲的孵化率、子代數(shù)減少，且阻礙生殖腺的發(fā)育，其中SHBsAg的作用最為顯著。Geng等[42]發(fā)現(xiàn)在線蟲體內(nèi)表達(dá)乙肝病毒多功能蛋白(HBx蛋白)后線蟲的孵化率明顯降低，并伴有蟲袋現(xiàn)象，且胞內(nèi)Ca2+濃度上升，細(xì)胞死亡數(shù)量增加。當(dāng)線蟲感染肺炎克雷伯氏菌之后會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)卵率低、蟲袋等現(xiàn)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)感染肺炎克雷伯氏菌之后陰門發(fā)育相關(guān)基因(let-3)和產(chǎn)卵相關(guān)基因(lin-29)的表達(dá)均發(fā)生下調(diào)[43]，也就意味著肺炎克雷伯氏菌對(duì)線蟲的生殖毒性是由于性腺發(fā)育異常和產(chǎn)卵異常2部分原因共同造成的。利用秀麗隱桿線蟲對(duì)生物污染物的生殖毒性的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

4 生殖毒性機(jī)制(Reproductive toxicity mechanism)

秀麗線蟲與人類同源性高，高等動(dòng)物具備的基本生理過(guò)程、氧化應(yīng)激反應(yīng)和許多重要的通路在秀麗線蟲中都具有一定的保守性[44]，可直接通過(guò)熒光標(biāo)記觀察線蟲在環(huán)境改變后細(xì)胞內(nèi)的變化[12]。近年來(lái)利用秀麗線蟲進(jìn)行的環(huán)境污染物生殖毒理學(xué)研究表明，不同環(huán)境因素產(chǎn)生的生殖毒性與因素本身特點(diǎn)、劑量高低和生物時(shí)期等有較大關(guān)系，其潛在機(jī)制包括氧化應(yīng)激、DNA損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。

4.1 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是體內(nèi)自由基產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，與疾病的產(chǎn)生以及生物體的衰老都存在著一定的關(guān)系。導(dǎo)致氧化應(yīng)激的因素很多，例如活性氧自由基超氧陰離子、羥基自由基以及活性氮自由基一氧化氮、二氧化氮等都會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。文獻(xiàn)報(bào)道在多種環(huán)境物質(zhì)誘導(dǎo)生殖毒性時(shí)，氧化應(yīng)激在其中起到了一定的作用。在研究Hg對(duì)線蟲造成的生殖毒性時(shí)，發(fā)現(xiàn)線蟲體內(nèi)的Hsp-16.2表達(dá)量和活性氧物種(ROS)量顯著升高，當(dāng)用維生素E預(yù)處理后再進(jìn)行暴露，可以明顯緩解由于Hg造成的生殖損傷[45]。clk-2、isp-1基因是與氧化損傷呈正相關(guān)的基因，mev-1、gas-1是與氧化損傷呈負(fù)相關(guān)的基因，在Hg造成線蟲生殖缺陷時(shí)，clk-2、isp-1的表達(dá)量增加，而mev-1、gas-1的表達(dá)量則減少，由此推測(cè)氧化損傷在Hg造成線蟲生殖缺陷的過(guò)程中扮演著很重要的角色。在對(duì)溴二苯醚的生殖毒性研究中發(fā)現(xiàn)，線蟲體內(nèi)ROS水平顯著上升，表明氧化損傷對(duì)溴二苯醚誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的凋亡起到了關(guān)鍵作用[29]。在磷化氫(PH3)延緩線蟲發(fā)育的試驗(yàn)中，線蟲體內(nèi)GSH的含量顯著上升，推測(cè)PH3可能是引起氧化損傷而發(fā)揮延緩發(fā)育的作用，在低濃度的PH3存在時(shí)，這種作用可以被體內(nèi)增加的GSH緩解，用DEM(谷胱甘肽消耗劑)和PH3共同作用于線蟲時(shí)，發(fā)現(xiàn)低濃度的PH3就可以導(dǎo)致線蟲發(fā)育遲緩，同時(shí)線蟲體內(nèi)的GSH含量、SOD活性都發(fā)生下降，判斷這種結(jié)果是由于DEM消耗了體內(nèi)的GSH，當(dāng)PH3產(chǎn)生氧化損傷時(shí)，線蟲喪失了部分抗氧化能力，造成線蟲發(fā)育遲緩[46]。這與Mora等[47]之后的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)在線蟲的胚胎發(fā)育過(guò)程中g(shù)sr-1基因是必不可少的，而gsr-1的作用即是將氧化性谷胱甘肽(GSSH)還原為GSH而起到抗氧化作用，避免外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響。Du等[28]通過(guò)JC-1染料檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，硫丹暴露可導(dǎo)致線蟲線粒體膜電位異常，此外氧敏感型突變品系mev-1對(duì)硫丹的生殖毒性敏感性更強(qiáng)，都證明了氧化應(yīng)激是硫丹誘導(dǎo)生殖損傷的機(jī)制之一。

4.2 DNA損傷

DNA損傷可能會(huì)造成生物體基因型的突變，甚至可能會(huì)導(dǎo)致某些功能的喪失，更嚴(yán)重的則會(huì)直接使個(gè)體死亡。環(huán)境中的某些化學(xué)物質(zhì)如亞硝酸鹽、烷化劑等，以及一些物理因素如紫外線、電離輻射等都被證明會(huì)造成DNA損傷，從而導(dǎo)致生物學(xué)功能及生物體結(jié)構(gòu)的變化。同樣DNA損傷在線蟲的生殖細(xì)胞凋亡中起到了關(guān)鍵的作用，已證明在線蟲生殖細(xì)胞凋亡過(guò)程中起作用的基因有hus-1、mrt-2、clk-2、cep-1和egl/phg-1等[48]，其中DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)基因hus-1發(fā)揮著極為重要的作用。對(duì)線蟲相關(guān)基因的研究將會(huì)對(duì)人類相關(guān)疾病的探索起到推動(dòng)作用。在研究氧化石墨烯(GO)的生殖毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，其生殖損傷可能是由GO誘導(dǎo)DNA損傷進(jìn)而觸發(fā)下游一系列有關(guān)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路而引起的，并提出了hus-1/clk-2-cep-1/p53-egl-1-ced-4-ced-3信號(hào)級(jí)聯(lián)通路參與GO誘導(dǎo)的線蟲生殖細(xì)胞毒性的分子機(jī)制[24]。Weidhaas等[34]在研究輻射引起陰門細(xì)胞死亡的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，DNA損傷在其中扮演著重要的角色，但這種損傷引起的細(xì)胞死亡可能是與細(xì)胞凋亡不同的細(xì)胞壞死，通過(guò)對(duì)hus-1、clk-2和cdc-25等參與DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response, DDR)信號(hào)通路的基因突變證明DDR途徑是保護(hù)生殖細(xì)胞死亡所必需的。Du等[28]利用hus-1、egl-1等基因的突變體發(fā)現(xiàn)硫丹暴露后的生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)量相較于野生型有所下降，這同樣證明DNA損傷響應(yīng)通路在硫丹誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到了重要作用。這種機(jī)制在研究溴二苯醚的生殖毒性時(shí)也同樣被驗(yàn)證，hus-1和cep-1的突變品系可對(duì)溴二苯醚誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡起到抑制作用[29]。

4.3 其他機(jī)制

在目前的研究中氧化應(yīng)激和DNA損傷是討論較廣泛的2種生殖毒性響應(yīng)機(jī)制，除此以外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、MAPK信號(hào)通路以及神經(jīng)損傷等也有相關(guān)報(bào)道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核生物中蛋白質(zhì)合成、折疊、組裝和運(yùn)輸?shù)闹匾獔?chǎng)所，當(dāng)外界因素使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂時(shí)，未折疊及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)過(guò)度積累，此時(shí)細(xì)胞會(huì)激活相關(guān)通路引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究人員發(fā)現(xiàn)乙肝病毒LHBsAg、MHBsAg在誘導(dǎo)秀麗線蟲生殖毒性的同時(shí)能顯著上調(diào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)信號(hào)通路基因(enpl-4、hsp-4和pdi-3)表達(dá)的上調(diào)[41]。而納米二氧化硅則可能是通過(guò)線蟲神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的生殖衰老，因?yàn)榧{米二氧化硅的作用可以被鎮(zhèn)痙劑乙琥胺片所緩解[22]。MAPK信號(hào)通路是普遍存在于多種生物細(xì)胞中的重要信號(hào)通路，參與了細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和凋亡等多種生理過(guò)程。sek-1、mek-1是MAPK信號(hào)通路中重要的下游基因，在研究BDE-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，sek-1、mek-1的突變對(duì)BDE-3誘導(dǎo)的凋亡起到抑制作用[29]。此結(jié)果在研究硫丹的生殖毒性時(shí)也同樣被證明，Wang等[49]用硫丹處理JNK/MAPK中的jnk-1突變品系以及P38/MAPK途徑中的sek-1、pmk-1突變品系后，發(fā)現(xiàn)該突變品系可抑制硫丹誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡，表明jnk-1、sek-1以及pmk-1在硫丹誘導(dǎo)生殖腺細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到了重要作用。陳茜和屠偉峰的[50]研究表明，MAPK通路是與氧化應(yīng)激相關(guān)聯(lián)的，雙氧水(H2O2)能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量自由基，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，用H2O2處理細(xì)胞后，細(xì)胞生存能力下降，促進(jìn)ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化，磷酸化是MAPK信號(hào)通路激活的重要過(guò)程。

5 總結(jié)與展望(Summary and prospect)

環(huán)境問(wèn)題已成為21世紀(jì)每個(gè)國(guó)家高度關(guān)注的問(wèn)題，解決和預(yù)防各種常見(jiàn)及新的環(huán)境問(wèn)題對(duì)整個(gè)地球和人類可持續(xù)發(fā)展有著重大的意義。生殖系統(tǒng)是生物繁衍后代的重要系統(tǒng)，生殖系統(tǒng)損傷會(huì)嚴(yán)重影響到生物的繁衍，研究外源物質(zhì)對(duì)生殖系統(tǒng)的影響是評(píng)價(jià)外源物質(zhì)生物效應(yīng)的一個(gè)重要方面。模式生物秀麗隱桿線蟲遺傳背景清楚、生命周期短、行為反應(yīng)模式穩(wěn)定且易于實(shí)驗(yàn)操作，在環(huán)境污染物毒理學(xué)評(píng)價(jià)中起到了非常關(guān)鍵的作用。環(huán)境因素造成的線蟲生殖毒性主要涉及生殖細(xì)胞凋亡數(shù)的增加、生殖腺發(fā)育障礙以及繁殖能力的下降等，并且這種效應(yīng)一般會(huì)隨著暴露劑量和時(shí)間的增加而增強(qiáng)，甚至某些物質(zhì)的生殖毒性還會(huì)遺傳到子代中；在分子水平上，外源物質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平、GSH水平以及SOD活性等的改變；MAPK通路、DNA損傷響應(yīng)通路等在響應(yīng)外源污染物誘導(dǎo)的生殖毒性上也發(fā)揮著重要作用。然而不同響應(yīng)機(jī)制之間是否存在關(guān)聯(lián)性、幼蟲與成蟲之間敏感性差異的原因以及污染物的傳代效應(yīng)是否存在有效的緩解方式等問(wèn)題，都需要在將來(lái)的工作中進(jìn)一步探討。近年來(lái)腸道微生物已被證明與多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在著一定的關(guān)聯(lián)，基于秀麗線蟲展開的腸道微生物研究也取得了矚目的進(jìn)展，但腸道微生物是否在介導(dǎo)環(huán)境污染物誘導(dǎo)的生殖損傷上起到一定作用仍需探究。隨著基因編輯技術(shù)、高通量篩選技術(shù)的發(fā)展以及線蟲突變株獲取的便利性使得基于線蟲的生殖毒性研究變得越來(lái)越容易，利用秀麗線蟲來(lái)有效評(píng)價(jià)環(huán)境污染物的生殖毒性將會(huì)變得越來(lái)越成熟。