黃苑，蘇曉鷗，張維，齊香榮，林剛

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是一類(lèi)高溫氯化合成的氯代聯(lián)苯同系物，具有持久性、半揮發(fā)性、生物蓄積性和潛在毒性等特征，同時(shí)具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，是一類(lèi)典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disruptive chemical, EDCs)。因其良好性能曾被廣泛生產(chǎn)和使用，到20世紀(jì)80年代左右停產(chǎn)[1]，但PCBs至今仍廣泛存在于大氣、飄塵、水體和土壤中[2-4]，并在水陸生動(dòng)物包括高等哺乳動(dòng)物體內(nèi)檢出，甚至在人體脂肪組織、母乳和血清中亦有檢出[5-8]。PCBs分為類(lèi)二噁英多氯聯(lián)苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls, DL-PCBs)和非類(lèi)二噁英多氯聯(lián)苯(non-dioxin-like polychlorinated biphenyls, NDL-PCBs)兩大類(lèi)，DL-PCBs因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與二噁英相似，較NDL-PCBs具有更強(qiáng)的毒性作用。PCB118是12種DL-PCBs之一，Kerchich等[9]報(bào)道PCB118在垃圾焚燒后的灰分和煙霧中均有較高的暴露水平，占據(jù)DL-PCBs總量的67%；在我國(guó)東部電子垃圾拆解工人血清中，PCB118是檢出率很高的PCBs單體之一[10]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，PCB118暴露對(duì)代謝紊亂、行為異常、內(nèi)分泌干擾及生殖異常甚至癌癥等有關(guān)[11-14]。

針對(duì)PCBs內(nèi)分泌干擾的已有研究主要集中于甲狀腺素和雌激素干擾效應(yīng)兩大方面，對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌干擾的研究相對(duì)較少。而神經(jīng)內(nèi)分泌可通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonad, HPG)參與調(diào)控生殖內(nèi)分泌，在機(jī)體生殖和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮很大的作用。GnRH神經(jīng)元作為HPG軸的關(guān)鍵靶標(biāo)，既參與合成和分泌促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)，又是調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)的最終共同通路。已有研究表明，Aroclor 1254和PCB118等PCBs混合物或單體能夠在細(xì)胞水平上干擾GnRH的合成和分泌[15-16]，但具體的信號(hào)機(jī)制尚未深入探究。因此，本研究以小鼠下丘腦永生GnRH神經(jīng)元離體細(xì)胞系GT1-7細(xì)胞為模型，從細(xì)胞存活率、GnRH分泌水平和Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)等方面探究PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的影響和作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示PCBs發(fā)揮內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的毒性機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠下丘腦永生GnRH神經(jīng)元離體細(xì)胞系GT1-7細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院彭雙清研究員饋贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)：GT1-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%后，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2～3次，加入適量0.05%胰酶-EDTA溶液消化1 min，1 000 r·min-1離心4 min，棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1∶3比例傳代。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

PCB118標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)DR公司，純度為99.5%)，10 mg PCB118溶于612.34 μL二甲基亞砜(DMSO)，配制成50 mmol·L-1的母液，常溫保存?zhèn)溆谩MEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶液、青鏈霉素雙抗、RIPA蛋白裂解液、PMSF和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自北京中科邁晨科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠GnRH酶聯(lián)免疫標(biāo)記檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIM公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)CST公司；SurePAGETM蛋白預(yù)制膠購(gòu)自中國(guó)金斯瑞生物科技有限公司； G蛋白偶聯(lián)受體54(G-protein-coupled receptor 54，GPR54)一抗、磷脂酶C(phospholipase C, PLC)一抗和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；GnRH一抗購(gòu)自美國(guó)Lifespan公司；β-actin一抗購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

1300 SERIES A2型生物安全柜(美國(guó)Thermo Scientific公司)；Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；Mini-PROTEAN 4垂直電泳槽和Mini Trans-Blot Cell轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的GT1-7細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)預(yù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。加入含不同濃度PCB118的DMEM完全培養(yǎng)基(0、0.05、0.5、5、50、500、5 000和50 000 nmol·L-1，DMSO≤0.1%)，設(shè)置DMSO對(duì)照組(濃度為0.1%)，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24和48 h。之后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度值(A450值)，設(shè)置650 nm作為參考波長(zhǎng)，試驗(yàn)至少重復(fù)3次。計(jì)算各組平均A值和細(xì)胞相對(duì)存活率，細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=(A染毒組-A背景對(duì)照)/(A對(duì)照組-A背景對(duì)照)×100%。

1.4.2 LDH活性檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好的GT1-7細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行染毒處理，試驗(yàn)分組包括背景空白對(duì)照孔(無(wú)細(xì)胞不完全培養(yǎng)基)、樣品對(duì)照孔(未經(jīng)毒物處理的溶劑對(duì)照細(xì)胞孔)、樣品最大酶活性對(duì)照孔(未經(jīng)毒物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔)和毒物處理樣品孔(不同濃度PCB118：0、50、500、5 000、50 000 nmol·L-1)；置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1 h，在樣品最大酶活對(duì)照孔中加入20 μL乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放劑，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后400 g離心5 min；每孔取出120 μL上清液至新的96孔板相應(yīng)孔中；按照說(shuō)明書(shū)現(xiàn)配LDH檢測(cè)工作液，每孔加入60 μL工作液；室溫避光孵育30 min后測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A490值)；將測(cè)得的各組吸光度減去背景空白對(duì)照孔吸光度后計(jì)算LDH活力(%)，LDH活力(%)=(A處理樣品-A樣品對(duì)照)/(A細(xì)胞最大酶活性對(duì)照-A樣品對(duì)照)×100%。

1.4.3 GnRH分泌量檢測(cè)

將GT1-7細(xì)胞接種于6孔板中，預(yù)培養(yǎng)24 h后使用無(wú)血清的不完全培養(yǎng)基饑餓處理12 h，更換含有不同濃度PCB118的完全培養(yǎng)基(0、0.05、5、500和50 000 nmol·L-1)處理細(xì)胞6 h和24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于GnRH分泌量測(cè)定，細(xì)胞用于Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路分析。應(yīng)用小鼠GnRH酶聯(lián)免疫標(biāo)記檢測(cè)試劑盒檢測(cè)GT1-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GnRH分泌量。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的GnRH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品GnRH濃度。

1.4.4 Western Blot

細(xì)胞接板和染毒同1.4.3。吸除細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解60 min，收集細(xì)胞裂解物，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min，點(diǎn)樣并進(jìn)行凝膠電泳。電泳結(jié)束后將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃一抗孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶的灰度值(IDV值)，計(jì)算IDV目的蛋白/IDV內(nèi)參蛋白值，獲得目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞增殖的影響

不同濃度PCB118作用GT1-7細(xì)胞6、12、24和48 h后，細(xì)胞存活率的變化結(jié)果如圖1所示。從劑量效應(yīng)上看，處理6 h，PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞的存活率無(wú)顯著影響；處理12 h和48 h，隨PCB118作用濃度增加(0.05～50 000 nmol·L-1)，各濃度組與對(duì)照組相比均能顯著降低細(xì)胞存活率(P<0.05或P<0.01)；處理24 h，隨PCB118作用濃度增加(0.5～50 000 nmol·L-1)，各濃度組均能顯著降低細(xì)胞存活率(P<0.05或P<0.01)。從時(shí)間效應(yīng)上看，處理12 h，0.5～50 000 nmol·L-1劑量組中細(xì)胞存活率顯著(P<0.05或P<0.01)低于6 h；處理24 h，0.05～50 000 nmol·L-1劑量組中細(xì)胞存活率顯著(P<0.05或P<0.01)低于6 h；處理48 h，各劑量組細(xì)胞存活率與6 h時(shí)細(xì)胞存活率相比較均表現(xiàn)出顯著(P<0.01)差異性。結(jié)果表明，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，PCB118以劑量依賴(lài)性方式顯著降低GT1-7細(xì)胞存活率，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。

圖1 PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞存活率的影響注：細(xì)胞存活率表示為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)；* P<0.05、** P<0.01表示與同時(shí)間點(diǎn) 對(duì)照組相比差異顯著；^ P<0.05、^^ P<0.01表示與6 h相比差異顯著。Fig. 1 Effects of PCB118 on cell viability of GT1-7 cells Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group; ^ P<0.05, ^^ P<0.01, compared to the 6 h group.

2.2 PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞LDH釋放的影響

不同濃度PCB118(50、500、5 000和50 000 nmol·L-1)處理GT1-7細(xì)胞24 h后，各濃度組培養(yǎng)基上清液中LDH活力分別為陽(yáng)性對(duì)照組(最大酶活性對(duì)照孔)的4.23%±0.91%、3.97%±0.78%、3.77%±0.67%和15.52%±1.56%。50、500和5 000 nmol·L-1PCB118未造成細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的LDH釋放量增加，50 000 nmol·L-1PCB118能夠顯著促進(jìn)LDH的釋放(P<0.01)，結(jié)果如圖2所示。這說(shuō)明只有高濃度PCB118才會(huì)引起細(xì)胞膜通透性的增加，具有明顯的細(xì)胞毒性作用。

2.3 PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的影響

將不同濃度PCB118(0、0.05、5、500和50 000 nmol·L-1)對(duì)GT1-7細(xì)胞分別染毒6 h和24 h，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)GnRH濃度，并用細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果如圖3所示。PCB118染毒6 h后，5和500 nmol·L-12個(gè)濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中GnRH的含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，50 000 nmol·L-1濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中GnRH的含量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；PCB118染毒24 h后，0.05和5 nmol·L-1濃度組GnRH的變化無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，500和 50 000 nmol·L-1濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中GnRH的含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放的影響注：數(shù)值為處理組細(xì)胞LDH釋放量相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組的比值， 以3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=6)； 與對(duì)照組相比，*P<0.05、** P<0.01。Fig. 2 Effects of PCB118 treatment on the release of lactate dehydrogenase (LDH) from GT1-7 cells Note: Date represented the LDH leakage content of the treatment group relative to the positive control group, and were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. *P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group.

圖3 PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的影響注：用細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞培養(yǎng)液中GnRH含量，數(shù)據(jù)表示3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)；與對(duì)照組相比，*P<0.05、** P<0.01。Fig. 3 Effects of PCB118 treatment on GnRH secretion in GT1-7 cells Note: Date were described as the concentration of GnRH in cell culture medium relative to the total proteins in GT1-7 cells, and expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, **P<0.01, compared to the control group.

圖4 PCB118染毒6 h和24 h后Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況Fig. 4 The expression of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT1-7 cells treated with PCB118 for 6 h and 24 h

2.4 PCB118對(duì)Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路的影響

PCB118分別對(duì)GT1-7細(xì)胞染毒6 h和24 h，提取胞內(nèi)總蛋白并定量，用Western Blot法分析Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖4和圖5所示，PCB118染毒GT1-7細(xì)胞6 h后，0.05 nmol·L-1PCB118對(duì)蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC的表達(dá)無(wú)顯著影響；5、500和50 000 nmol·L-1PCB118均能顯著降低蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC表達(dá)水平(P<0.01或P<0.05)。染毒24 h后，500和50 000 nmol·L-1PCB118均能顯著降低蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC表達(dá)水平(P<0.01或P<0.05)。

3 討論(Discussion)

本研究主要圍繞PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞的增殖毒性作用和GnRH分泌水平的影響及其機(jī)制，分析了PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞的細(xì)胞存活率、GnRH分泌以及Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路在PCB118干擾GT1-7細(xì)胞分泌GnRH中的作用，以期闡明PCB118的神經(jīng)內(nèi)分泌干擾效應(yīng)及潛在機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞具有一定的細(xì)胞增殖毒性并能抑制GT1-7細(xì)胞分泌GnRH，下調(diào)GnRH、GPR54、PLC和PKC等關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平，表明Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路可能介導(dǎo)了PCB118干擾GT1-7細(xì)胞GnRH的分泌。

圖5 PCB118染毒6 h和24 h后Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路相關(guān)蛋白的定量分析注：數(shù)據(jù)表示3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)；與對(duì)照組相比，* P<0.05、** P<0.01。Fig. 5 Quantitative analysis of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT1-7 cells treated with PCB118 for 6 h and 24 h Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group.

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCB118具有抑制GT1-7細(xì)胞增殖的作用，隨PCB118暴露劑量(0.05～50 000 nmol·L-1)的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；隨PCB118暴露時(shí)間(6～48 h)的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并呈現(xiàn)一定的時(shí)間效應(yīng)，。Dickerson等[15]已研究發(fā)現(xiàn)PCB118(0.1～100 μmol·L-1)體外暴露GT1-7細(xì)胞24 h內(nèi)能夠抑制細(xì)胞增殖，而本研究發(fā)現(xiàn)更低濃度PCB118仍然具有抑制GT1-7細(xì)胞增殖的作用。Hashmi等[17]也發(fā)現(xiàn)PCB118(1～20 μg·mL-1)作用人胚肺成纖維細(xì)胞12～48 h后具有顯著抑制細(xì)胞增殖的作用。但Yang等[13]發(fā)現(xiàn)，低濃度PCB118(0.025～25 nmol·L-1)并未顯著抑制大鼠甲狀腺細(xì)胞增殖，只在250～25 000 nmol·L-1濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著性抑制作用。這提示PCB118具有抑制細(xì)胞增殖的作用，但不同類(lèi)型細(xì)胞對(duì)PCB118敏感度存在差異，神經(jīng)細(xì)胞可能對(duì)PCB118更加敏感。LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只有50 000 nmol·L-1PCB118對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生明顯的損傷，從而顯著促進(jìn)LDH釋放。雖然低濃度組并未與對(duì)照體現(xiàn)出顯著性差異，但CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度PCB118具有一定的細(xì)胞增殖毒性，因而其低劑量毒性效應(yīng)仍不容忽視。根據(jù)上述結(jié)果并結(jié)合PCB118在環(huán)境介質(zhì)和動(dòng)物機(jī)體中的暴露水平[9,18]，選擇0.05、5、500和50 000 nmol·L-1的低中高濃度作為研究PCB118干擾GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的濃度。

GnRH由下丘腦神經(jīng)元合成并分泌，經(jīng)垂體門(mén)脈系統(tǒng)調(diào)節(jié)腺垂體的促性腺激素分泌，進(jìn)而調(diào)控性腺激素水平和生殖功能[19]。目前，已有研究表明PCBs可以干擾神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響大鼠腦組織中GnRH表達(dá)，進(jìn)而影響機(jī)體性別分化，造成生殖功能紊亂[20]；Khan等[21]也發(fā)現(xiàn)多氯聯(lián)苯混合物Aroclor 1254(主要成分是PCB118)能損傷魚(yú)類(lèi)下丘腦前部中GnRH的合成和釋放。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度PCB118處理GT1-7細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)GnRH分泌具有不同程度的抑制作用。處理6 h，5、500和50 000 nmol·L-1PCB118能顯著抑制GT1-7細(xì)胞GnRH的分泌，這與Dickerson等[15]發(fā)現(xiàn)的PCB118(0.1～10 μmol·L-1)作用GT1-7細(xì)胞4 h促進(jìn)GnRH分泌的結(jié)果不一致，可能與實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞狀態(tài)、藥物干預(yù)濃度和GnRH脈沖分泌時(shí)間有關(guān)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GnRH由具有活性的GT1-7細(xì)胞分泌，PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞增殖的抑制作用可能是造成GnRH分泌量降低的原因之一。但作用6 h時(shí)，PCB118并未顯著抑制細(xì)胞增殖，因此短時(shí)間內(nèi)GnRH分泌量的改變可能并不是由細(xì)胞增殖的變化引起的。處理GT1-7細(xì)胞24 h，高濃度PCB118能顯著抑制GT1-7細(xì)胞分泌GnRH，這與Dickerson等[15]發(fā)現(xiàn)的PCB118(1～100 μmol·L-1)作用GT1-7細(xì)胞24 h顯著抑制GnRH分泌的結(jié)果一致。這種抑制作用一方面是由于PCB118干擾GT1-7細(xì)胞增殖，另一方面可能是PCB118間接干擾了某些調(diào)節(jié)GnRH功能的神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)通路。

GnRH的合成和分泌過(guò)程受到諸多因子調(diào)控，其中，Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路是參與GnRH脈沖式分泌的關(guān)鍵信號(hào)機(jī)制。GnRH神經(jīng)元受到其上游神經(jīng)元(kiss-1)的直接調(diào)控，kiss-1神經(jīng)元內(nèi)的kiss-1基因可以編碼Kisspeptin多肽，Kisspeptin通過(guò)與其受體GPR54[22]結(jié)合激活PLC反應(yīng)途徑，從而激活下游激酶如PKC等磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑，并活化細(xì)胞膜上非選擇性陽(yáng)離子通道以及抑制K+的外向電流，達(dá)到GnRH神經(jīng)元的去極化，從而參與調(diào)控GnRH的合成和分泌[23-25]。GPR54、PLC和PKC等均是Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。已有研究表明，在GT1-7細(xì)胞中，Kisspeptin/GPR54可通過(guò)PKC信號(hào)通路調(diào)節(jié)下游細(xì)胞內(nèi)鈣離子通量從而影響GnRH的分泌[26]。因此，本研究初步分析了PCB118對(duì)Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白的變化趨勢(shì)與PCB118影響GT1-7細(xì)胞分泌GnRH的變化趨勢(shì)基本一致，PCB118顯著下調(diào)GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。雖然類(lèi)環(huán)境劑量組中0.05 nmol·L-1PCB118對(duì)GnRH分泌量和GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著影響，但5 nmol·L-1PCB118作用6 h，在不影響細(xì)胞增殖的情況下即可抑制GT1-7細(xì)胞GnRH的合成和分泌，并顯著下調(diào)Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路上GPR54、PLC和PKC等蛋白的表達(dá)，這表明環(huán)境劑量下PCB118仍然具有一定的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。值得注意的是，5 nmol·L-1作用24 h時(shí)，PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞的GnRH分泌和相關(guān)蛋白的表達(dá)影響并不顯著，推測(cè)可能存在其他調(diào)控機(jī)制。已有研究表明，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase)ERK和cAMP/PKA信號(hào)通路參與Kisspeptin刺激GT1-7細(xì)胞GnRH受體的表達(dá)[27]，該信號(hào)通路是否參與PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的影響仍需進(jìn)一步研究。500 nmol·L-1PCB118作用6 h和24 h后，均能顯著抑制GnRH分泌和蛋白的表達(dá)，雖然該濃度稍高于正常的環(huán)境水平，但在長(zhǎng)期生活于受PCBs污染的地區(qū)或接觸電子垃圾的動(dòng)物或人體內(nèi)屬于正常水平，因而其所帶來(lái)的危害不容忽視。50 000 nmol·L-1PCB118遠(yuǎn)高于環(huán)境介質(zhì)中的水平，在設(shè)定的時(shí)間范圍內(nèi)，能穩(wěn)定地抑制GnRH分泌并下調(diào)Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。由此說(shuō)明，PCB118可通過(guò)干擾Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌干擾作用。

本研究表明，PCB118在環(huán)境劑量下，仍然對(duì)GT1-7細(xì)胞具有一定的細(xì)胞增殖毒性和GnRH分泌的干擾效應(yīng)，在抑制GnRH分泌的同時(shí)能夠下調(diào)Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，提示該信號(hào)通路可能參與了PCB118影響GT1-7細(xì)胞GnRH的分泌。Dickerson等[15]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌激素受體(estrogen receptor, ER)抑制劑可以拮抗PCB118對(duì)GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的抑制作用，提示PCB118可通過(guò)ER途徑干擾GnRH分泌。本試驗(yàn)提供了PCB118干擾GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的另一潛在分子機(jī)制，但是Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路在介導(dǎo)PCB118發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌干擾效應(yīng)中的具體作用機(jī)制，以及其他信號(hào)通路的介入情況，仍需要進(jìn)一步深入研究。