曹文銳，任靜，賀妮楠，陳靜，秦小迪，董光輝，曾曉雯

廣州市環(huán)境污染與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系， 廣州 510080

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)是近年來引起科學(xué)家們關(guān)注的一種持久性有機(jī)污染物，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和生活用品中，如潤(rùn)滑劑、織物整理劑、涂料和食品包裝材料等[1]。已有的研究表明PFOS對(duì)免疫系統(tǒng)、肝臟系統(tǒng)和腎臟系統(tǒng)等多器官均有毒性。哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的特異性疾病，其免疫學(xué)機(jī)制主要表現(xiàn)在Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡失調(diào)并以Th2型細(xì)胞免疫占優(yōu)勢(shì)的免疫反應(yīng)[2-3]。人群流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，PFOS暴露與哮喘的發(fā)生、發(fā)展之間存在一定的相關(guān)性[4-5]，如哮喘兒童體內(nèi)的PFOS濃度與哮喘的嚴(yán)重程度、血清IgE水平呈正相關(guān)[4]。但是，PFOS對(duì)哮喘發(fā)生發(fā)展的免疫毒性機(jī)制仍未明確。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PFOS暴露可引起小鼠Th1和Th2型細(xì)胞因子及多種炎性細(xì)胞因子分泌失衡，使機(jī)體免疫功能偏向于Th2型免疫應(yīng)答[6-7]，此外，PFOS暴露可加重卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏小鼠氣道高反應(yīng)性，升高血清IgE水平，表明PFOS有促進(jìn)機(jī)體發(fā)生哮喘的傾向，但不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全一致[8-9]。因此，建立哮喘小鼠模型能更有利于探討PFOS在誘導(dǎo)機(jī)體哮喘發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)理。

基于以上研究結(jié)果，本研究擬通過建立PFOS暴露的哮喘小鼠模型，從Th1/Th2炎癥反應(yīng)的角度探討PFOS暴露對(duì)哮喘發(fā)展的影響。

1 實(shí)驗(yàn)方法(Experimental methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

清潔級(jí)(SPF級(jí))6～8周成年雄性C57BL/6J小鼠36只，購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)：SCXK(粵)2011-0029)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將小鼠稱重編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表法均分為6組，每組6只。

1.2 動(dòng)物染毒及模型建立

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程分為2個(gè)階段：

(1)第一階段為PFOS染毒：將白色粉末狀PFOS鉀鹽(純度≥98%，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的Tween-80溶液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中配制成PFOS溶液。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在職業(yè)人群中PFOS的血清濃度中值為10 400 ng·mL-1(82.6～31 400 ng·mL-1)，普通人群中PFOS血清濃度中值為26.25 ng·mL-1(8.53～99.37 ng·mL-1)[10-11]，因此參考職業(yè)人群和普通人群血清中PFOS暴露情況，我們將染毒劑量設(shè)置為0.1、1、5和10 mg·kg-1·d-1，并設(shè)置對(duì)照組及OVA單獨(dú)組。給予2% Tween-80，小鼠每天經(jīng)口灌胃染毒，連續(xù)7 d，前述研究結(jié)果顯示OVA致敏模型的炎癥反應(yīng)已遠(yuǎn)高于單純PFOS染毒組的效應(yīng)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)，因此，在此次7 d的短期染毒實(shí)驗(yàn)中沒有再設(shè)置單純的PFOS染毒組。模型制作期間每日記錄小鼠體重及基本情況。

(2)第二階段為哮喘模型建立：從第8天開始使用OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠模型(圖1)，第二階段無PFOS染毒處理。對(duì)照組僅注射含5 mg Al(OH)3的100 μL PBS懸液，Al(OH)3購自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)，其余各組均在第8和14天腹腔注射OVA致敏液(50 μg OVA+5 mg Al(OH)3+100 μL PBS懸液)，第22天起進(jìn)行1% OVA霧化(30 min·d-1)，每日一次，誘發(fā)哮喘。

染毒及模型制作期間每日觀察并記錄小鼠飼養(yǎng)情況如體重、飲食飲水量、體征、精神狀態(tài)及活動(dòng)等。實(shí)驗(yàn)過程如圖1所示。

1.3 樣本收集和臟器系數(shù)計(jì)算

胸腺、腎臟、肝臟、脾臟和肺臟采集：對(duì)小鼠進(jìn)行體重稱量并記錄后，對(duì)小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，分離出完整的肝臟、脾臟、腎臟、肺臟及胸腺處理后，計(jì)算各臟器的臟器系數(shù)。

1.4 肺泡灌洗液(BALF)收集及有核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

(1)有核細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)：收集小鼠BALF，離心后分離細(xì)胞及上清液，上清液置于-80 ℃冰箱保存待用。細(xì)胞沉淀重懸于紅細(xì)胞裂解液中去除紅細(xì)胞，離心后重懸于200 μL PBS，細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下計(jì)細(xì)胞總數(shù)。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖注：PFOS表示全氟辛烷磺酸，OVA表示卵清蛋白，I.P.表示腹腔注射。Fig. 1 Experimental flow chart Note: PFOS stands for perfluorooctane sulfonate; OVA stands for ovalbumin; I.P. stands for intraperitoneal injection.

(2)嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)：將上述重懸于PBS中的細(xì)胞進(jìn)行涂片，多聚甲醛固定，吉姆薩染液染色后，鏡下計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞，每張涂片上計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞以上，并計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞所占百分比。

1.5 肺組織切片及HE和PAS染色

1.6 BALF中細(xì)胞因子IL-5、IL-4和IFN-γ測(cè)定

用Luminex技術(shù)測(cè)定BALF中Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子IFN-γ和Th2細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子IL-4、IL-5的水平。試劑盒來源于美國(guó)eBioscience公司，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組用Dunnett's法比較，并做整體的趨勢(shì)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 各組小鼠體重變化和臟器系數(shù)

各組小鼠體重變化和臟器系數(shù)如表1所示，各組間體重變化、脾臟系數(shù)、肺臟系數(shù)及胸腺系數(shù)均無明顯差異。肝臟系數(shù)在10 mg·kg-1·d-1PFOS+OVA組顯著高于OVA單獨(dú)組(P<0.05)，并且肝臟系數(shù)隨PFOS暴露濃度增加而上升，腎臟系數(shù)隨PFOS濃度增加而降低，上升及下降趨勢(shì)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠體重變化和臟器系數(shù)Table 1 Weight change and organ coefficient of mice in each group

注：*與對(duì)照組比較(P<0.05)，# 與OVA單獨(dú)組比較(P<0.05)；a不同處理組間的趨勢(shì)檢驗(yàn)。

Note: * compared with control group (P<0.05); # compared with OVA alone (P<0.05);atrend testing between different treatment groups.

2.2 各組小鼠BALF中的白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

如表2所示，10 mg·kg-1·d-1PFOS+OVA組BALF中的白細(xì)胞總數(shù)顯著高于OVA單獨(dú)組(P<0.05)，其余組與OVA單獨(dú)組相比無明顯差異。隨PFOS暴露濃度的增加，嗜酸粒細(xì)胞總數(shù)呈上升趨勢(shì)，且該趨勢(shì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組小鼠的細(xì)胞因子水平

如表3所示，10 mg·kg-1·d-1PFOS+OVA組的IL-4水平顯著高于OVA單獨(dú)組(P<0.05)；10 mg·kg-1·d-1PFOS+OVA組的IL-4/IFN-γ比值顯著高于OVA單獨(dú)組；IL-4、IL-5水平和IL-4/IFN-γ、IL-5/IFN-γ比值均隨PFOS濃度的增加而增加(P<0.05)，且趨勢(shì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IFN-γ水平隨PFOS濃度變化的趨勢(shì)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

如圖2所示，與對(duì)照組相比(圖2-A)，各哮喘組小鼠均可見支氣管管壁增厚，氣道粘膜、粘膜下和小血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂(圖2-B～F)。隨著PFOS染毒劑量的增加，小鼠支氣管壁明顯增厚。與單獨(dú)OVA組相比，10 mg·kg-1·d-1PFOS+OVA組小鼠氣道粘膜及粘膜下層厚度更厚，且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯(見圖F)；在圖2-G～L中可以看到，對(duì)照組小鼠氣道未見杯狀細(xì)胞增生、無明顯的黏液分泌(圖2-G)，而在各模型組中小鼠氣道黏液層增厚明顯、杯狀細(xì)胞顯著增生，并且與OVA單獨(dú)組相比，氣道黏液層厚度、杯狀細(xì)胞增生情況隨染毒劑量的增加而加重(圖2-H～L)。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液(BALF)中的有核細(xì)胞 總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)Table 2 The total number of nucleated cells and eosinophilic granulocytes in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of mice from each group

注：* 與對(duì)照組比較(P<0.05)，# 與OVA單獨(dú)組比較(P<0.05)；a不同處理組間的趨勢(shì)檢驗(yàn)。

Note: * compared with control group (P<0.05); # compared with OVA alone (P<0.05);atrend testing between different treatment groups.

表3 各組小鼠BALF中細(xì)胞因子水平Table 3 The level of cytokines in BALF of mice from each group

注：* 與對(duì)照組比較(P<0.05)，# 與OVA單獨(dú)組比較(P<0.05)；a不同處理組間的趨勢(shì)檢驗(yàn)。

Note: * compared with control group (P<0.05); # compared with OVA alone (P<0.05);atrend testing between different treatment groups.

圖2 小鼠肺組織病理切片HE染色(A～F) (100×)和PAS染色(G～L)(100×)注：A、G為對(duì)照組，B、H為單獨(dú)OVA組，C、I為OVA+0.1 mg·kg-1·d-1 PFOS組，D、J為OVA+1 mg·kg-1·d-1 PFOS組，E、K為OVA+ 5 mg·kg-1·d-1 PFOS組，F(xiàn)、L為OVA+10 mg·kg-1·d-1 PFOS組。* 炎癥細(xì)胞，→ 杯狀上皮細(xì)胞。Fig. 2 HE staining (A-F) (100×) and PAS staining (G-L) (100×) in lung tissue pathology sections of mice Note: A, G are control group; B, H are OVA group alone; C, I are OVA +0.1 mg·kg-1·d-1 PFOS; D, J are OVA+1 mg·kg-1·d-1 PFOS; E, K are OVA+5 mg·kg-1·d-1 PFOS; F, L are OVA+10 mg·kg-1·d-1 PFOS. * inflammatory cells; → goblet epithelial cells.

3 討論(Discussion)

雖然國(guó)際上許多國(guó)家和組織如美國(guó)、加拿大和歐盟等已限制了PFOS的生產(chǎn)和使用，但在中國(guó)目前仍未有關(guān)于限制PFOS生產(chǎn)和使用的法律條文，仍在大量生產(chǎn)和使用PFOS，是全球主要的PFOS生產(chǎn)國(guó)之一[12-13]。PFOS在人體內(nèi)半衰期長(zhǎng)達(dá)5.4年，容易在人體內(nèi)蓄積引起健康有害效應(yīng)[14]，而根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PFOS在我國(guó)人體內(nèi)的含量仍處于較高水平[15]。已有流行病學(xué)研究報(bào)道全氟化合物暴露與哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)具有關(guān)聯(lián)，但結(jié)論和機(jī)制并不完全一致[4-5]。Dong等[4]對(duì)臺(tái)灣哮喘兒童進(jìn)行病例對(duì)照研究(哮喘組n=231，對(duì)照組n=225)，結(jié)果顯示，兒童血清PFOS濃度與哮喘發(fā)生顯著正相關(guān)，血清PFOS濃度最高四分位數(shù)組的哮喘比例比最低四分位數(shù)組高163%(95%Confidence Interval (CI): 48%～369%)。哮喘兒童的哮喘相關(guān)血清生物標(biāo)志物免疫球蛋白E(IgE)和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白水平與PFOS濃度呈正相關(guān)，且隨血清PFOS濃度的增加而增高。Humblet等[5]對(duì)美國(guó)12～19歲的兒童開展了全氟化學(xué)物暴露和哮喘相關(guān)性的橫斷面研究(n=1 877)，結(jié)果顯示，血清PFOS濃度與哮喘有負(fù)關(guān)聯(lián)性(odds ratios (ORs): 0.88, 95%CI: 0.74～1.04)，而血清PFOA濃度與哮喘發(fā)生呈正相關(guān)(ORs: 1.18, 95%CI: 1.01～1.39)。

哮喘發(fā)生的重要免疫學(xué)機(jī)制之一是Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡失調(diào)，以Th2細(xì)胞免疫占優(yōu)勢(shì)的免疫反應(yīng)在哮喘發(fā)病的整個(gè)炎癥過程以及氣道重構(gòu)過程中都起著重要的作用[16]。本研究成功建立了小鼠哮喘模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PFOS可加重哮喘小鼠肺部支氣管重塑和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

細(xì)胞因子分泌水平是反映免疫細(xì)胞活化程度的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠肺泡灌洗液的IL4、IL5水平和IL5/IFN-γ、IL4/IFN-γ比值隨PFOS濃度的增加而增加，提示PFOS的暴露與機(jī)體偏向Th2型免疫應(yīng)答的程度存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。在高劑量10 mg·kg-1·d-1PFOS+OVA組，小鼠肺泡灌洗液的IL4、IL4/IFN-γ顯著高于單獨(dú)OVA組，提示短期、較高劑量的PFOS暴露加劇了Th2型細(xì)胞因子的分泌，機(jī)體免疫應(yīng)答可能更偏向以Th2型為主，即體液免疫，這與部分已有動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似[17-18]。臧珍等[17]關(guān)于全氟辛烷磺酸對(duì)4T1荷瘤小鼠免疫狀態(tài)影響的研究顯示，IFN-γ和IL4 mRNA表達(dá)水平隨PFOS濃度升高而升高，PFOS染毒可使小鼠免疫狀態(tài)向Th2型傾斜。Zhong等[18]開展了PFOS暴露影響小鼠子代內(nèi)分泌功能和Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡的研究，結(jié)果顯示，PFOS產(chǎn)前暴露顯著增加了雄性子代小鼠IL-4的水平，而這種Th1/Th2型細(xì)胞因子的變化可能與睪酮介導(dǎo)的內(nèi)分泌功能有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與一些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致[19-20]。董光輝等[19]開展PFOS暴露對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能和細(xì)胞因子分泌水平影響的體外研究，結(jié)果表明，PFOS對(duì)體外培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ、IL4細(xì)胞因子分泌水平并沒有顯著影響，可能是因?yàn)樵撗芯繛轶w外實(shí)驗(yàn)且檢測(cè)的靶部位不同，不能反映出PFOS在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的整個(gè)過程。Soloff等[20]開展PFOS暴露對(duì)寬吻海豚T細(xì)胞活化的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PFOS能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生更多IFN-γ，明顯多于IL4，這可能與物種特異性以及研究對(duì)象種群的封閉性有關(guān)。因此，PFOS對(duì)機(jī)體Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡失調(diào)的影響機(jī)制，以及在哮喘發(fā)展進(jìn)程的作用通路還需更深入的研究。

此外，本研究還觀察到PFOS暴露對(duì)小鼠肝臟的影響，發(fā)現(xiàn)肝臟系數(shù)與PFOS染毒濃度呈正相關(guān)，提示PFOS暴露可能引起肝組織結(jié)構(gòu)的異常。肝臟組織作為機(jī)體重要的免疫器官之一，有研究顯示PFOS具有肝毒性，主要通過細(xì)胞的氧化應(yīng)激、線粒體依賴的細(xì)胞凋亡通路造成肝功能損傷，引起肝腫大、肝細(xì)胞空泡變性以及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)[21]。同時(shí)，腎臟指數(shù)與PFOS濃度呈負(fù)相關(guān)，提示PFOS也存在腎臟毒性，可引起腎損傷[22-23]。

綜上所述，本研究表明PFOS能加重哮喘小鼠肺部的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)，研究結(jié)果為進(jìn)一步探討PFOS的機(jī)體免疫毒性提供初步理論依據(jù)。