張杏麗，鄒威，周啟星

1. 河南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，黃淮水環(huán)境與污染防治教育部重點實驗室，河南省環(huán)境污染控制重點實驗室，新鄉(xiāng)453007 2. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室，天津 300071

隨著各國對溴代阻燃劑環(huán)境效應(yīng)的關(guān)注以及歐洲對五溴聯(lián)苯醚和八溴聯(lián)苯醚的禁用，有機磷阻燃劑(organophosphate flame retardants, OPFRs)作為理想替代品其使用量快速上升。OPFRs除了具有良好的阻燃效果外，兼有增塑和潤滑的功效，廣泛應(yīng)用于建材、紡織、化工、塑料及電子等行業(yè)[1]。大多數(shù)OPFRs主要以物理添加方式而非化學(xué)鍵合成方式加入到材料中，在產(chǎn)品生命周期中極易從材料中泄露或者揮發(fā)進入周圍環(huán)境。研究表明，OPFRs已廣泛分布于各種環(huán)境介質(zhì)，包括水環(huán)境、大氣環(huán)境、土壤/沉積物及生物體內(nèi)[2-6]。人體樣本如尿液、血漿、頭發(fā)、指甲和母乳中也檢測出OPFRs[7-10]。我們之前的研究表明，由于污水灌溉，湖北、重慶、四川和廣西地區(qū)采集的大米樣品中均檢測出OPFRs，其中受測的6種OPFRs總含量為0.38～287 ng·g-1，平均含量為69.9 ng·g-1[11]；另外乳制品、飲料、肉類和蔬菜中也檢測到OPFRs[11-12]。OPFRs已經(jīng)成為一類新型有機污染物在全球范圍內(nèi)普遍存在。

磷酸三苯酯(triphenyl phosphate, TPhP)是一類生產(chǎn)量和檢出頻率較高的OPFRs，廣泛應(yīng)用于聚氯乙烯材料、印刷電路板以及商業(yè)混合阻燃劑如FM550阻燃劑和AC073阻燃劑中。在我國華北地區(qū)，95%的河流水樣中檢出TPhP，最高濃度為15.7 ng·L-1[13]。松花江水體中TPhP濃度為4.5～65 ng·L-1[14]。廣州、貴嶼、哈爾濱、西安、廈門、南京、成都和北京8個城市飲用水(自來水和瓶裝水)中總OPFRs濃度為85.1～325 ng·L-1，TPhP是檢出率較高的OPFRs[15]。TPhP已經(jīng)被證實具有生殖毒性、發(fā)育毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)和神經(jīng)毒性[16-19]。例如，Li等[20]發(fā)現(xiàn)TPhP暴露影響了日本青鳉魚精巢發(fā)育進而破壞了其生殖能力。Hong等[21]發(fā)現(xiàn)TPhP穿過血腦屏障進入中國成年雄性稀有鰷魚頭部引起神經(jīng)毒性，通過破壞緊密連接復(fù)合體損壞血腦屏障的完整性，通過激活炎癥反應(yīng)因子抑制中樞神經(jīng)區(qū)細胞增殖和神經(jīng)樹突的密度，最終破壞魚的學(xué)習(xí)和記憶能力。Isales等[22]發(fā)現(xiàn)TPhP通過與視黃酸受體相互作用影響斑馬魚生長發(fā)育。TPhP在水環(huán)境中存在濃度為幾ng·L-1到幾百ng·L-1，目前，仍缺乏環(huán)境當(dāng)量濃度下TPhP的毒理數(shù)據(jù)資料及詳細的致毒機理。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白組學(xué)后新發(fā)展起來的一門學(xué)科，通過研究生物體內(nèi)源性代謝物的整體變化，靈敏地指示和確證外來干擾物在組織和器官水平的毒性效應(yīng)，某種特定代謝物的蓄積可能標(biāo)志著某通路的缺陷或某信號響應(yīng)的激活，而代謝物的動態(tài)變化可以作為毒性損傷的標(biāo)志物，因此，代謝組學(xué)技術(shù)在回答低濃度環(huán)境污染物對生物體響應(yīng)機制中具有不可替代作用[23]。我們曾利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，痕量氧化石墨烯通過抑制氨基酸代謝、降低非飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值引起斑馬魚胚胎發(fā)育畸形[24]。然而，有關(guān)環(huán)境當(dāng)量濃度TPhP對生物體代謝組學(xué)的影響研究尚未見報道。

鑒于此，本研究以斑馬魚為模式生物，采用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)的代謝組學(xué)技術(shù)，探討環(huán)境當(dāng)量濃度(0.0025～1 μg·L-1)和高于環(huán)境濃度(10、100和1 000 μg·L-1)TPhP暴露對斑馬魚整體代謝組學(xué)的擾亂程度，篩選對TPhP毒性敏感的目標(biāo)代謝物，同時將變化的代謝物與斑馬魚胚胎生長發(fā)育毒性指標(biāo)相結(jié)合，從代謝物水平闡述TPhP誘發(fā)斑馬魚發(fā)育毒性的分子機制，為今后詳細闡述TPhP生物毒性機制提供新思路和技術(shù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 斑馬魚胚胎的獲得與培養(yǎng)

6個月齡的成年野生型斑馬魚(Daniorerio)，購自國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center, CZRC)。斑馬魚養(yǎng)殖于裝有控溫裝置的魚缸中，養(yǎng)殖水為海鹽濃度為60 mg·L-1的人工海水，溫度保持(28.5±1) ℃，光周期為14 h光照/10 h黑暗，魚缸中養(yǎng)殖水在循環(huán)過程中采用過濾系統(tǒng)進行過濾以保持水體清潔。餌料為豐年蝦，每日早晚各喂1次。挑選個體大小相同雌雄斑馬魚于前一天晚上按照雌雄比例1∶1放入產(chǎn)卵盒中，用隔板隔開，將產(chǎn)卵盒放入人工氣候培養(yǎng)箱中(中國博訊SPX-300I-C)。次日早上8:00將產(chǎn)卵盒中隔板取出，使雌雄斑馬魚自然交配，1 h后，收集魚卵，得到斑馬魚胚胎。胚胎用斑馬魚胚胎培養(yǎng)液E3溶液(5 mmol·L-1NaCl，0.17 mmol·L-1KCl，0.33 mmol·L-1CaCl2，0.33 mmol·L-1MgSO4，pH=7.4)清洗干凈去除排泄物和死卵。然后將健康斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移到E3溶液中，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至2.5 hpf (hours post fertilization)，用于后續(xù)實驗研究。

1.2 TPhP暴露實驗

TPhP標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號115-86-6，純度99.5%)購自上海百靈威科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)品用二甲基亞砜(DMSO，色譜純，德國Merck)配制成濃度為10 mg·L-1的儲備液，置于4 ℃冰箱中避光保存。然后用E3溶液將上述TPhP儲備液稀釋成1 000、100、10、1、0.1和0.0025 μg·L-1梯度濃度染毒溶液，染毒體系中DMSO終濃度為0.01%(體積比)。將2.5 hpf斑馬魚胚胎暴露于E3溶液(空白對照組，CK)，0.0025、0.1、1、10、100和1 000 μg·L-1TPhP溶液中7 d。暴露實驗在96孔板中進行，每孔一枚受精卵。每隔24 h更換一次染毒溶液以保證TPhP染毒濃度恒定不變，整個胚胎染毒實驗均在人工氣候培養(yǎng)箱中進行，培養(yǎng)箱溫度為(28±1) ℃，光照周期為光暗比14 h/10 h。

1.3 斑馬魚心跳、孵化、死亡和畸形觀察

每個濃度取120尾2.5 hpf斑馬魚胚胎于96孔板中進行7 d的暴露實驗，設(shè)置3個生物重復(fù)，即每組包含40尾斑馬魚胚胎。體視鏡(日本，Olympus ZL 61)下觀察記錄72 hpf斑馬魚胚胎的孵化情況，以幼魚脫離絨毛膜作為成功孵化的標(biāo)準(zhǔn)。同時每組隨機取出發(fā)育至72 hpf的斑馬魚胚胎6尾，在倒置顯微鏡(日本，Olympus X71)下連續(xù)觀察1 min，記錄斑馬魚胚胎的心跳次數(shù)。每天在體視顯微鏡下(日本，Olympus ZL 61)觀察40尾斑馬魚幼魚的畸形和死亡情況，以不運動、無心跳和血液不流動作為胚胎死亡的標(biāo)準(zhǔn)，胚胎畸形按照心包/卵黃囊水腫、尾/脊椎彎曲和面部畸形等標(biāo)準(zhǔn)進行判斷，并對畸形的斑馬魚進行拍照，最終統(tǒng)計各組發(fā)育至7 dpf(days post fertilization)的斑馬魚幼魚的死亡率和畸形率。

1.4 斑馬魚幼魚線粒體膜電位分析

JC-1是檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，JC-1紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變顯示線粒體膜電位下降。每個濃度取36尾發(fā)育至2.5 hpf斑馬魚胚胎于96孔板中暴露7 d，設(shè)置3個生物重復(fù)，即每組包含12尾斑馬魚。暴露結(jié)束后，每組隨機取出6尾斑馬魚幼魚，E3沖洗干凈后，在含6 μmol·L-1JC-1的E3溶液中避光孵育1 h。染色結(jié)束后，用新鮮E3溶液沖洗數(shù)次，斑馬魚在0.08%三卡因(質(zhì)量比)中麻醉后，在倒置熒光顯微鏡(日本，Olympus X71)下觀察拍照，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為485 nm和535 nm。利用Image J軟件對斑馬魚體內(nèi)熒光強度進行定量分析。

1.5 斑馬魚幼魚的GC-MS代謝組學(xué)分析

斑馬魚體內(nèi)代謝物分析方法參考我們之前文獻進行[24]。具體步驟如下；每個濃度取144尾2.5 hpf斑馬魚胚胎于96孔板中進行7 d的暴露實驗，設(shè)置3個生物重復(fù)，即每組包含48尾斑馬魚胚胎。暴露結(jié)束，每組隨機取30尾斑馬魚幼魚，迅速放入液氮中冷凍合并為一個樣品，之后每個樣品均加入2 mL提前保存于-20 ℃的甲醇/氯仿/水混合提取液(體積比為2.5∶1∶1)，在研缽中冰浴研磨成勻漿。微波萃取20 min，萃取溫度40 ℃。萃取液轉(zhuǎn)移到滅菌的1.5 mL離心管中，4 ℃高速離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到10 mL離心管中，沉淀中再次加入1 mL混合提取液，同等條件下微波萃取，離心，合并2次上清液到10 mL離心管中。加入500 μL滅菌后的高純水到離心管樣品中，離心后得到分層的樣品溶液，上層是甲醇/水相提取物，下層是氯仿提取物，先氮吹，然后冷凍干燥。將干燥得到的提取物連同離心管進行封口密封，置于-80 ℃低溫冰柜中保存。

代謝物的GC-MS(美國，Agilent 6890A/5977A)測定采用兩步衍生化法。首先加入50 μL用吡啶溶解的甲氧氨基鹽酸鹽，密封，渦旋振蕩，30 ℃水浴孵育90 min，再加入80 μL硅烷化試劑N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA)，37 ℃水浴孵育30 min。轉(zhuǎn)移衍生化好的樣品到樣品瓶中。

氣相色譜參數(shù)：MDN-35毛細管色譜柱(30 m)，升溫程序為80 ℃，保留2 min，然后以15 ℃·min-1的速率升溫到325 ℃，保留6 min，傳輸線溫度為250 ℃。氣相色譜進樣參數(shù)：進樣量為1 μL，進樣口溫度設(shè)置為230 ℃，不分流進樣模式，載氣為氦氣，流速2 mL·min-1，進樣模式為自動進樣。質(zhì)譜參數(shù)：離子源溫度為250 ℃，質(zhì)量掃描范圍是m/z 70～600，采集速率每秒20個scan，溶劑延遲170 s，檢測器電壓1 700～1 850 V，質(zhì)譜虧損設(shè)置為0，燈絲偏置電流為70 V，儀器進行自動調(diào)諧。譜圖解卷積參數(shù)：力可公司自帶的商業(yè)軟件Chroma TOF，基線消除設(shè)置為1(0.5～1)，譜圖平滑(smoothing)為5數(shù)據(jù)點(3～7)，峰寬(peak width)3 s(3～4 s)，信噪比S/N(signal-tonoise ratio)為10(2～15)。數(shù)據(jù)采集以scan模式獲得總離子流色譜圖(TIC)，利用NIST 14數(shù)據(jù)庫對代謝物進行定性分析，生成包含樣本信息、化合物名稱、保留時間、峰面積和定性值等信息的文件。根據(jù)保留時間和定性值篩選代謝物，以峰面積表示代謝物的相對含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有的實驗組均設(shè)置3個生物重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。所得實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差(ANOVA)分析，當(dāng)P<0.05時，認為在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性。代謝物熱圖利用軟件MeV 4.9繪制。同時將篩選出的代謝物數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P13.0(瑞典，Umetrics AB，Umea)軟件包進行多元統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)先用無監(jiān)督統(tǒng)計模型主成分分析(principal components analysis, PCA)，得出對照組和處理組之間代謝物的離散趨勢。再進行有監(jiān)督統(tǒng)計模型的正交最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminate analysis, OPLS-DA)[25-26]，將差異代謝物與斑馬魚的畸形率建立相關(guān)性，選擇定義變量權(quán)重重要性排序(variable importance in projection, VIP)大于1的變量進行研究。最后，用MetaboAnalyst 3.0數(shù)據(jù)庫對差異倍數(shù)在1.5倍的代謝物進行通路定位，找出顯著富集的代謝通路[27]。

2 結(jié)果(Results)

2.1 斑馬魚胚胎發(fā)育分析

如圖1a所示，空白對照組斑馬魚72 hpf孵化率達96%，當(dāng)TPhP濃度為0.0025～10 μg·L-1時，斑馬魚胚胎孵化率與空白對照組無顯著差異，當(dāng)TPhP濃度為100和1 000 μg·L-1時，胚胎孵化率分別為73.3%和46.7%，顯著低于對照組(P<0.05)。當(dāng)TPhP濃度為10、100和1 000 μg·L-1時，斑馬魚72 hpf心率明顯低于空白對照組(圖1b)。TPhP濃度為100和1 000 μg·L-1，斑馬魚幼魚7 d的死亡率分別為18.2%和38.9%，畸形率分別為18.0%和31.1%，顯著高于空白對照組(圖1c和圖1d)?；晤愋桶怪鶑澢⑽舶蛷澢?、卵黃囊腫、心包囊腫，其中脊柱、尾巴彎曲和心包囊腫出現(xiàn)的頻率顯著大于其他畸形類型，TPhP濃度越大，心包囊腫出現(xiàn)頻率越大，表明TPhP顯著影響斑馬魚的心臟發(fā)育。

2.2 線粒體膜電位分析

對暴露7 d的斑馬魚幼魚進行JC-1染色，倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組紅色熒光較多(圖2a)，高濃度TPhP處理組斑馬魚體內(nèi)綠色熒光較多(圖2b)。當(dāng)TPhP濃度為100和1 000 μg·L-1時，紅色和綠色相對熒光強度比值明顯低于空白對照組(圖2c)，當(dāng)TPhP濃度為0.0025～10 μg·L-1時，差異不顯著。結(jié)果表明，當(dāng)TPhP濃度≥100 μg·L-1，斑馬魚幼魚線粒體膜電位下降，TPhP誘導(dǎo)斑馬魚線粒體損傷。

2.3 斑馬魚幼魚代謝組學(xué)分析

空白對照組和TPhP處理組斑馬魚幼魚代謝組學(xué)分析結(jié)果如表1和圖3所示。樣本經(jīng)甲醇/氯仿/水混合提取液提取，衍生化后進行GC-MS分析，共得出54種代謝物，主要包括碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、其他小分子酸和膽固醇等。代謝物的相對水平通過熱圖展示(圖3a)，從代謝輪廓可以看出，隨著TPhP濃度增高，大部分代謝物相對含量降低。層次聚類(HLC)分析發(fā)現(xiàn)，7個實驗組可以分成3組，分別是空白對照組/0.0025 μg·L-1處理組/0.1 μg·L-1處理組，1 μg·L-1處理組/10 μg·L-1處理組/100 μg·L-1和1 000 μg·L-1處理組，表明當(dāng)TPhP濃度≥1 μg·L-1時，影響斑馬魚幼魚的代謝過程。通過SIMCA-P 13.0對代謝物進行PCA分析發(fā)現(xiàn)，空白對照組、0.0025與0.1 μg·L-1處理組聚集在一起，沒有明顯分開，而1、10、100和1 000 μg·L-14個處理組與空白對照組明顯分開(圖3b)，表明這4個處理組中斑馬魚幼魚代謝狀況與空白對照組存在明顯的差異，PCA分析進一步證實TPhP濃度在≥1 μg·L-1時干擾了斑馬魚幼魚的代謝過程。

圖1 磷酸三苯酯(TPhP)暴露對斑馬魚胚胎孵化率(a)、心率(b)、致死率(c)和畸形率(d)的影響注：* 表示處理組斑馬魚胚胎考察指標(biāo)與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Effects of triphenyl phosphate (TPhP) on the hatching (a), heart rate (b), mortality (c) and malformation (d) of zebrafish during embryogenesis Note: *denotes P<0.05, compared to the control.

圖2 TPhP對斑馬魚幼魚線粒體膜電位的影響注：a，空白對照組；b， 1 000 μg·L-1 TPhP處理組； *表示處理組考察指標(biāo)與對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 2 Effects of TPhP on mitochondrial membrane potential in zebrafish larvae Note: a, zebrafish larvae in control; b, zebrafish larvae in 1 000 μg·L-1 TPhP group; *denotes P<0.05 compared to the control.

通過SPSS 2.0對TPhP處理組總代謝物、碳水化合物、氨基酸和脂肪酸含量與空白對照組含量進行顯著性分析，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)TPhP濃度為0.0025 μg·L-1時，總代謝物和各單類代謝物與空白對照組的差異水平P值接近1，表明0.0025 μg·L-1TPhP對斑馬魚代謝過程無顯著影響。但是隨著TPhP濃度增加，P值呈降低趨勢，TPhP濃度越高，對斑馬魚幼魚代謝過程影響越明顯。當(dāng)TPhP濃度為0.1～1 000 μg·L-1時，P碳水化合物

圖3 代謝物層次聚類分析(a)和主成分分析(b)Fig. 3 Hierarchical clustering analysis (a) and principal component analysis (b) of metabolites

表1 不同處理組斑馬魚幼魚體內(nèi)代謝物的相對含量(a.u)Table 1 Metabolites of zebrafish larvae in different treatment groups (a.u)

2.4 斑馬魚代謝成分的改變與發(fā)育毒性相關(guān)性分析

為進一步確認與斑馬魚生長發(fā)育相關(guān)的代謝物的變化，本實驗利用OPLS-DA進行差異代謝產(chǎn)物與畸形率相關(guān)性分析，Y變量是發(fā)育畸形率，X變量是代謝物，分析結(jié)果如圖5。在54種代謝物中，12種代謝物與畸形率呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系；其余42種代謝物與畸形率呈負相關(guān)關(guān)系。另外對代謝物進行了變量重要性投影，得到VIP>1的23種代謝物，在圖5中用星號標(biāo)出，OPLS-DA分析表明，TPhP脅迫下，此23種代謝物的變化與斑馬魚畸形相伴發(fā)生，代謝物的變化可能是TPhP引起斑馬魚胚胎畸形的分子機制。其中，與畸形率正相關(guān)且VIP>1的代謝物有3種，分別是甘油-硬脂酸酯(monostearin)、葡萄糖(d-glucose)和草酸(oxalic acid)，表示這3種代謝物對畸形發(fā)生有顯著的促進作用。與畸形率呈負相關(guān)且VIP>1的代謝物有18種，如膽固醇(cholesterol)、甘氨酸(glycine)、絲氨酸(L-serine)、亮氨酸(leucine)、異亮氨酸(isoleucine)、蘇氨酸(L-threonine)、硬脂酸(octadecanoic acid)、辛酸(octanoic acid)和乳酸(lactic acid)，表示這18種代謝物對畸形發(fā)生有顯著的抑制作用。

進一步將差異代謝數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst 3.0進行代謝路徑富集分析，結(jié)果如表2所示。TPhP顯著影響斑馬魚胚胎發(fā)育過程的路徑中，4條是與氨基酸相關(guān)的代謝通路，2條是與碳水化合物相關(guān)的代謝通路，其中對氨酰-tRNA生物合成通路，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路影響最顯著，由表1可知，以上代謝通路中氨基酸水平在TPhP≥10 μg·L-1處理組均顯著降低，表明TPhP抑制斑馬魚氨基酸代謝。

3 討論(Discussion)

本實驗將斑馬魚胚胎暴露于0.0025～1 000 μg·L-1的TPhP溶液7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TPhP濃度低于10 μg·L-1時，斑馬魚胚胎孵化率、心率、死亡率和畸形率與空白對照組相比無明顯差異，表明低濃度TPhP對斑馬魚胚胎無顯著毒性。當(dāng)TPhP≥100 μg·L-1時，明顯抑制了斑馬魚心跳速率和孵化率，增大斑馬魚胚胎的畸形率和死亡率。TPhP濃度為1 000 μg·L-1時，斑馬魚幼魚死亡率為38.9%，這與之前報道的TPhP對斑馬魚胚胎的96 h半數(shù)致死濃度為1.53 mg·L-1大略一致[28]。中國科學(xué)院水生生物研究所周炳升教授團隊研究發(fā)現(xiàn)，100 μg·L-1TPhP顯著抑制斑馬魚心跳速率和游泳速度，引起斑馬魚胚胎發(fā)生明顯的畸形[29]。

圖4 TPhP處理組代謝物相對于空白對照組的顯著性水平注：P值通過ANOVA方差分析中的Tukey’s檢驗獲得。Fig. 4 Significance differences of comparing metabolites from TPhP exposed groups with the control Note: The significant level P at vertical axis is obtained by ANOVA with Tukey’s test.

圖5 斑馬魚差異代謝物與畸形率的相關(guān)性分布圖注：與斑馬魚畸形率成負相關(guān)且VIP值大于1的代謝物用黑色星號標(biāo)出，與斑馬魚畸形率成正相關(guān)且VIP值大于1的代謝物用紅色星號標(biāo)出。Fig. 5 Relationships between differential metabolites and malformation rate of zebrafish Note: The metabolites labeled with red and black asterisks represent the metabolites with a VIP greater than one that positively and negatively contribute to the malformation rate, respectively.

表2 TPhP顯著干擾的代謝通路Table 2 The metabolite pathways significantly disordered by TPhP

代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TPhP濃度為0.1和1 μg·L-1時，輕微干擾斑馬魚代謝過程，此濃度對斑馬魚胚胎生長發(fā)育無影響，表明代謝物變化是污染物生物毒性研究中更加敏感的指標(biāo)。當(dāng)TPhP濃度為10、100和1 000 μg·L-1時顯著干擾斑馬魚代謝過程，主要影響斑馬魚氨基酸代謝和碳水化合物代謝。KEGG通路分析表明，TPhP顯著干擾斑馬魚氨酰-tRNA生物合成過程，該過程是將氨基酸合成為蛋白質(zhì)的關(guān)鍵步驟，斑馬魚氨酰-tRNA生物合成過程受到干擾，會出現(xiàn)明顯的脊柱彎曲和身體短小畸形[30]，這2種畸形類型在TPhP≥100 μg·L-1的暴露組中出現(xiàn)頻率均顯著高于空白對照組。支鏈氨基酸(BCAAs)在生物體的骨骼肌肉發(fā)育和合成代謝過程中起關(guān)鍵作用，BCAA代謝受到影響將會對生物體身體產(chǎn)生危害[31-32]。本實驗中，TPhP暴露組中斑馬魚體內(nèi)3個重要BCAAs，纈氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)和異亮氨酸(isoleucine)下調(diào)倍數(shù)為2～45倍(表1)，OPLS-DA分析也表明，大多數(shù)下調(diào)的氨基酸與畸形發(fā)生有關(guān)(圖5)，因此，氨基酸代謝水平下調(diào)可能是TPhP引起斑馬魚畸形和死亡率升高的原因。葡萄糖是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中主要能量來源，通過糖酵解生成乳酸來提供能量，本研究中TPhP暴露使斑馬魚體內(nèi)葡萄糖含量升高和乳酸含量降低，表明TPhP引起斑馬魚體內(nèi)糖酵解途徑的紊亂。體內(nèi)高含量葡萄糖會引起斑馬魚卵黃囊和頭部畸形[33]，由此可知，心包囊腫和卵黃囊腫畸形發(fā)生可能與體內(nèi)糖代謝紊亂有關(guān)。同時，三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物蘋果酸(malic acid)、琥珀酸(butanedioic acid)和烏頭酸(aconitic acid)含量在TPhP≥10 μg·L-1的3個處理組中均明顯降低，表明三羧酸循環(huán)代謝通路發(fā)生障礙。斑馬魚線粒體膜電位分析表明，100和1 000 μg·L-1TPhP處理組斑馬魚幼魚線粒體膜電位明顯降低(圖2)，線粒體是斑馬魚進行三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量的場所，因此三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙，可能與線粒體功能紊亂有關(guān)。

綜上所述，環(huán)境當(dāng)量濃度TPhP(<10 μg·L-1)對斑馬魚胚胎心跳、孵化、畸形和死亡無顯著影響，但是輕微干擾了斑馬魚代謝過程，濃度大于10 μg·L-1TPhP顯著引起斑馬魚胚胎心率、孵化率和線粒體膜電位的下降，引起胚胎死亡率和畸形率增加，同時顯著干擾了斑馬魚的氨基酸代謝和糖代謝，降低支鏈氨基酸的含量，引起葡萄糖糖酵解過程和三羧酸循環(huán)代謝過程紊亂。代謝物的變化與生長發(fā)育毒性指標(biāo)表現(xiàn)出很好的相關(guān)性，本文從內(nèi)源代謝物角度闡述了TPhP引起斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的分子機制，為今后深入開展TPhP水生生物毒性機制的研究提供新思路和技術(shù)支撐。