糾敏 閆鵬 閆國慶

摘要：研究了冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用機制。通過測定冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌細胞膜的通透性、呼吸代謝途徑和蛋白質合成能力的影響，探討冬凌草甲素的抑菌機制。試驗結果顯示，冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）分別為25 μg/mL和50 μg/mL;冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌后，培養(yǎng)液的電導率升高，β-D-半乳糖苷酶活性增大，核酸外泄量也增加，2 MIC藥物組處理6 h后的電導率比空白組升高了18%（P<0.01），處理12 h后的β-D-半乳糖苷酶活性比空白組增大了124%（P<0.01），胞外核酸大分子含量極顯著高于對照組（P<0.01）;冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌9h，菌體可溶性蛋白質總量比對照組減少了約50%（P<0.01）;冬凌草甲素能抑制金黃色葡萄球菌三羧酸循環(huán)中的關鍵酶活性，其中對蘋果酸脫氫酶活性抑制率為53.22%（P<0.01），對琥珀酸脫氫酶的活性抑制率為33.96%（P<0.01）。試驗結果表明，冬凌草甲素通過破壞細菌細胞膜的通透性以及抑制菌體內的蛋白質合成、代謝關鍵酶的活性發(fā)揮殺菌作用。

關鍵詞：冬凌草甲素;金黃色葡萄球菌;抑菌機制;細胞膜通透性;呼吸代謝;蛋白質合成

中圖分類號： R285.5 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0202-05

食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質基礎，而食品安全問題是關系到人體健康和國計民生的重大問題。當前，由致病微生物造成的食品安全事件已上升為我國乃至世界面臨的首要問題[1]，其中，引起食源性疾病的主要致病微生物有沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[2]。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界中，且易黏附在食品加工設備、包裝材料的表面并形成生物膜，造成設備腐蝕和食品污染，由其腸毒素引發(fā)的食品中毒事件屢屢發(fā)生[3]。

為控制食品中微生物的含量，通過添加防腐劑來抑制或殺滅微生物已成為食品加工和儲藏中使用最為普遍和有效的方法。但合成防腐劑大量使用帶來的安全性問題正不斷受到質疑[4-5]。鑒于此，尋求安全高效的天然食品防腐劑一直是食品科學、生物領域及中藥學中的重要課題。天然植物源防腐劑以其安全、高效、抗氧化效果好、抗菌譜廣等優(yōu)點，已經成為近年來人們研究的熱點，并逐步被應用于各食品領域[6-7]。

冬凌草是我國的特色中草藥，其主要活性成分為冬凌草甲素[8]。冬凌草甲素為貝殼杉烯骨架的四環(huán)二萜類化合物，無色棱柱狀結晶，味道極苦，不溶于水，溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機溶劑，具有抗炎、抗微生物和抗腫瘤等多種藥理活性[9]。冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、禽巴氏桿菌等都有較強的抑制作用。但是，目前有關冬凌草甲素的作用機制研究鮮有報道。本研究以金黃色葡萄球菌為供試菌，通過研究冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌細胞膜通透性、蛋白質合成和呼吸代謝等方面的影響，探討冬凌草甲素的抑菌作用機制，以期為冬凌草在食品行業(yè)中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC6538，中國普通微生物菌種保藏管理中心）;冬凌草甲素（上海源葉生物科技有限公司）;牛血清白蛋白、戊二醛、考馬斯亮藍G-250、碘乙酸[生工生物工程（上海）股份有限公司];琥珀酸脫氫酶試劑盒、蘋果酸脫氫酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）;牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、丙二酸、磷酸鈉、葡萄糖（分析純，天津市德恩化學試劑有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基 細菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母膏5 g，蒸餾水1 000 mL，用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH值至7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min備用。細菌平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母膏5 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH值至 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min備用。

1.1.3 主要儀器設備 UV755B紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）;SW-CJ-1G超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司）;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;BSA224S電子天平（德國賽多利斯集團）;DKB-8A電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械廠股份有限公司）;H-2050R低溫超速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）;DW-86L578J超低溫冰箱（海爾集團）;DDS-307電導率儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）;JY92-2D超聲細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）;JYD-1A溶解氧測定儀（南京科環(huán)分析儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化和標準菌懸液制備 挑取1～2環(huán)金黃色葡萄球菌接種在試管斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液。采用麥氏比濁法，用無菌生理鹽水調節(jié)細菌含量為1×108 CFU/mL。

將復蘇好的金黃色葡萄球菌菌懸液按體積比1 ∶ 50接種于新鮮細菌液體培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃，轉速為220 r/min條件下，培養(yǎng)20 h后，4 ℃、8 000 r/min，離心10 min，沉淀物用無菌生理鹽水洗滌2次，每次10 mL，然后用無菌生理鹽水調整菌懸液濃度為5×108 CFU/mL，得到標準菌懸液。

1.2.2 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）的測定[10]

1.2.2.1 最小抑菌濃度測定 二倍稀釋法：取8支試管分別加入5 mL細菌液體培養(yǎng)基（其中第一支試管加9.5 mL），加入0.5 mL冬凌草甲素溶液于第1支試管中，混勻后取出 5 mL 加入第2支試管中，然后依次取出5 mL移入下一試管，到第8支試管時棄去 5 mL，再在這8支試管中分別加入 0.1 mL 培養(yǎng)好的菌液。另取2支試管分別編號為第9和10，其中第9號試管作為空白對照1，只加5 mL液體培養(yǎng)基，不加藥液;第10號試管作為空白對照2，加5 mL液體培養(yǎng)基和溶劑甲醇。用2倍遞減稀釋法將冬凌草甲素配制成400.000、200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 μg/mL的冬凌草甲素溶液，溶劑為甲醇，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基中完全沒有菌生長（透明）的最低濃度作為冬凌草甲素的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.2.2 最小殺菌濃度測定 在最小抑菌濃度的基礎上，將一含金黃色葡萄球菌的含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿均分為6個部分，用接種環(huán)分別取編號為1～6（對應冬凌草甲素的質量濃度分別為100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 μg/mL）的試驗試管中的溶液，接種于平板上對應的編號接種區(qū)，接種完成后，把培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，平板中未見細菌生長的最低藥液濃度即為其對細菌的最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.3 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的影響 電導率的測定[11]：向生長到對數(shù)期的金黃色葡萄球菌中加入冬凌草甲素溶液，使培養(yǎng)基中冬凌草甲素的終濃度為1/4、1/2、1、2 MIC，37 ℃下120 r/min恒溫培養(yǎng)。在培養(yǎng)0、2、4、6、8 h 時取10 mL培養(yǎng)液，4 500 r/min離心 10 min，用移液槍吸取3 mL上清液到小試管中，再加2 mL無菌水混勻測定其電導率，以冬凌草甲素溶劑甲醇為對照組，平行試驗3次，取平均值。

β-D-半乳糖苷酶活性測定[12]：取制備的菌懸液與冬凌草甲素混合，使冬凌草甲素質量濃度達到1/4、1/2、1、2 MIC，置于37 ℃搖床中培養(yǎng)12 h后取1 mL菌懸液，采用鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）比色法測定其吸光度，具體做法;首先用25 mmol/L pH值為7.2的三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）（含0.5% NaCl）溶液將菌懸液稀釋至濃度為5×107 CFU/mL，取10 μL 30 mmol/L ONPG溶液加入100 μL菌液中，于37 ℃下反應2 h，以不加冬凌草甲素的菌液為對照，405 nm下測定吸光度。

胞外DNA、RNA含量的測定[13]：將培養(yǎng)至對數(shù)期的金黃色葡萄球菌，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，制成1×107 CFU/mL 的菌懸液。加入冬凌草甲素，使其終濃度為 1 MIC 和2 MIC。在藥物作用0、2、4、6、8 h時，將菌懸液于 5 000 r/min 下離心10 min，取上清，用紫外分光光度計在 260 nm 處測定上清液中DNA、RNA大分子物質的吸光值。以不加藥液為對照組，試驗重復3次，取平均值。

1.2.4 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌胞內總蛋白質合成能力的影響 將生長到對數(shù)期的金黃色葡萄球菌用pH值為 7.4 的0.1 mol/L磷酸緩沖液洗滌，并稀釋成濃度為5×107 CFU/mL 的菌液，取5 mL與等體積的1/4、1/2、1、2 MIC冬凌草甲素混合后，于37 ℃、120 r/min搖床上培養(yǎng)，分別在3、6、9 h時取樣5 mL，10 000 r/min離心5 min收集細胞。以無菌水替代冬凌草甲素作為空白對照。

取冬凌草甲素處理組和空白對照組菌體沉淀，用磷酸緩沖鹽溶液將其重懸，采用麥氏比濁法調節(jié)不同處理組細菌含量為1×108 CFU/mL。取5 mL樣品，10 000 r/min離心 5 min，棄上清。沉淀物分別加入50 μL無菌水和100 μL SDS-PAGE loading fuffer，混勻后于沸水浴中加熱5 min，12 000 r/min 離心2 min，取40 μL上清液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），采用蛋白質定量分析試劑盒測定微生物胞內蛋白質含量。濃縮膠和分離膠的濃度分別為4%和10%;電泳結束后用0.1%的考馬斯亮藍R-250進行凝膠染色，用25%的甲醇和7%的醋酸混合液脫色[14]。

1.2.5 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌呼吸代謝的影響 在反應杯中加入1.8 mL pH值為7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液，0.2 mL 1%葡萄糖溶液和0.5 mL濃度為1×107 CFU/mL 的金黃色葡萄球菌懸液，在空氣中攪拌5 min，開始測定菌懸液中的溶氧量。測定時保證整個體系處于封閉狀態(tài)。用注射器分別加入典型抑制劑碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉，使其終濃度為500 μg/mL，再加入冬凌草甲素，使其質量濃度達到1 MIC，以不加藥液為對照組。根據菌懸浮液中溶氧量的變化，求出菌體呼吸速率。按照下列公式求出3種典型抑制劑與冬凌草甲素的呼吸抑制率和疊加率[15-16]。

IR=R0-R1R0×100%;

RR=R1-R1′R1×100%。

式中：IR為抑制劑對菌體呼吸的抑制率，%;R0、R1分別為對照組和抑制劑組的菌體呼吸速率，μmol/（g·min）;RR為典型抑制劑對冬凌草甲素的疊加率，%;R1為加入冬凌草甲素后菌體的呼吸速率，μmol/（g·min）;R1′為加入典型抑制劑后菌體的呼吸速率，μmol/（g·min）。

1.2.6 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌胞內琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活性的影響 向培養(yǎng)至對數(shù)期的金黃色葡萄球菌中加入冬凌草甲素，使其質量濃度達到1 MIC，37 ℃培養(yǎng)分別培養(yǎng)4 h和8 h，取培養(yǎng)的菌液5 000 r/min離心10 min收集菌體，用pH值為7.4的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液洗滌 2～3次后，用Tris-HCl緩沖液將其重懸，采用麥氏比濁法將不同處理組細菌含量調至相同。取樣品5 mL，進行冰浴超聲破碎，時間1 min，間歇2 s，功率為200 W。細胞破碎后，10 000 r/min 低溫離心15 min，取出上清液，測定酶活性。琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）活性的測定按試劑盒的說明書操作。采用蛋白質定量分析試劑盒測定上清液蛋白質含量。以不加藥液為對照組，試驗重復3次，取平均值[17]。

SDH活性定義為1 mg蛋白質 1 min 使反應體系的吸光度值降低0.01為1個酶活性單位;MDH活性定義為1 mg蛋白質在反應體系中1 min內催化1 μmol的底物變成產物定義為1個酶活性單位[18]。

1.2.7 數(shù)據處理 試驗數(shù)據以平均值±標準差的形式表示。統(tǒng)計分析采用SPSS軟件，組間分析采用One-Way ANOVA兩兩比較得到相應的P值，P<0.05和P<0.01為顯著和極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌MIC及MBC的測定

最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）是測量抑菌物質抑菌活性大小的重要指標，試驗結果見圖1。冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌的MIC為25 μg/mL，MBC為 50 μg/mL。

2.2 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的影響

藥物可通過破壞細胞膜的通透性抑制細菌的生長，因此對冬凌草甲素處理后的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基溶液的電導率、胞外β-D-半乳糖苷酶活性和核酸含量進行測定，試驗結果見圖2、圖3、表1。由圖2可知，隨著作用時間延長，對照組的電導率基本沒有變化，藥物處理組電導率在0～6 h有明顯增大，6 h后降低。同時，在相同作用時間內，隨著藥物濃度升高電導率增大，2MIC濃度下作用6 h時電導率達到最大值為7.95，與對照組相比增加了17%（P<0.01）。

通常宿主菌β-D-半乳糖苷酶存在于胞內，當細胞內膜滲透性達到一定水平時，其胞內的β-D-半乳糖苷酶就會滲透到細胞外。而ONPG是β-D-半乳糖苷酶的底物，水解后生成半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚（ONP）。ONP在405～420 nm處有紫外吸收，因此培養(yǎng)物吸光值的變化可以反映細胞內膜通透性的改變[12]。由圖3可知，隨著冬凌草甲素質量濃度升高，吸光度不斷增大，這表明細胞內的β-D-半乳糖苷酶外泄量增多。2MIC處理下吸光度達到0.746，與對照組相比增大了124%（P<0.01）。

對冬凌草甲素作用后的金黃色葡萄球菌菌體核酸大分子物質的外泄情況進行研究，試驗結果見表1。25 μg/mL與 50 μg/mL 的冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌后，胞外核酸大分子含量極顯著高于對照組（P<0.01），且隨著冬凌草甲素質量濃度的增加，核酸外泄量增加。對藥物處理的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基溶液的電導率、胞外β-D-半乳糖苷酶活性和核酸含量分析結果說明，冬凌草甲素能破壞金黃色葡萄球菌細胞膜的通透性，導致其胞內物質大量外流，進而抑制其生長繁殖。

2.3 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌呼吸代謝作用的影響

磷酸鈉、碘乙酸和丙二酸分別是生物體內磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)的典型抑制劑[16]。冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌呼吸代謝影響見表2。1 MIC冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌呼吸抑制率為14.74%，當冬凌草甲素分別與3種抑制劑聯(lián)合使用時，結果顯示，與丙二酸作用時疊加率最小，僅有3.70%。疊加率的大小可反映冬凌草甲素與典型抑制劑間的增效作用。疊加率越小，表明藥物與典型抑制劑抑制相同代謝途徑的可能性越大[19]。因此，冬凌草甲素主要是通過抑制三羧酸循環(huán)途徑而起作用的。

2.4 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌SDH和MDH活性的影響

琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）在微生物能量代謝中起著關鍵作用，其活性降低是細胞能量代謝損傷的標志。試驗結果（表3）顯示，1 MIC冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌8 h后，與對照組相比，SDH和MDH活性都降低了，其中MDH的活性降低53.22%（P<0.01），SDH的活性降低33.96%（P<0.01）。表明冬凌草甲素能通過抑制呼吸代謝中三羧酸循環(huán)的SDH和MDH活性來抑制金黃色葡萄球菌的能量代謝，其中對MDH的抑制效果較為明顯。

2.5 冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌胞內可溶性蛋白質含量的影響

藥物可通過抑制蛋白質的合成來抑制細菌的生長繁殖。因此，對冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌的胞內可溶性蛋白質含量進行測定，試驗結果見表4。

由表4可知，金黃色葡萄球菌胞內可溶性蛋白質總量隨著冬凌草甲素質量濃度的增加，呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，與對照組相比，50 μg/mL的冬凌草甲素處理3 h時金黃色葡萄球菌胞內可溶性蛋白質總量降低了約40%（P<0.01）;且隨著冬凌草甲素作用時間的延長，菌胞內可溶性蛋白質總量呈下降趨勢，50 μg/mL 的冬凌草甲素處理9 h時比對照組降低了約50%（P<0.01）。

采用SDS-PAGE對質量濃度為12.50 μg/mL的冬凌草甲素抑制金黃色葡萄球菌胞內蛋白質合成情況進行分析，由圖4可知，隨著作用時間的的延長，有的蛋白質條帶顏色逐漸變淺，表明蛋白質的合成量變少;用藥組和對照組相比，蛋白質含量有明顯差異，對照組蛋白質譜帶多而清晰，而藥物作用后，大多蛋白質條帶變淺，有的譜帶甚至消失，但有的蛋白質條帶顏色變深（箭頭所示），這種變化隨著時間的延長，更加明顯。

3 結論與討論

天然植物中含有生物堿、揮發(fā)油、黃酮、有機酸等生物活性物質，它們具有不同程度的抗菌作用，對這些天然化合物的抑菌機制的研究結果證實，其主要通過破壞細胞膜的完整性、抑制三羧酸循環(huán)、抑制蛋白質和核酸的合成等抑制細菌正常生長代謝[20]。

冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性，其最低抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為25 μg/mL和 50 μg/mL。對冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌后培養(yǎng)液的電導率、胞外β-D-半乳糖苷酶活性和核酸含量研究結果顯示，冬凌草甲素可以使金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的電導率增加，胞內的β-D-半乳糖苷酶和核酸大分子物質明顯外漏，表明冬凌草甲素能夠破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜結構。

新陳代謝是一切生命體生命活動的基礎，是同外界不斷進行物質和能量交換的過程。呼吸作用是生物體主要的產能代謝之一，呼吸作用的抑制或終止可導致生命活動受阻甚至停止。本研究測定了冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌呼吸代謝的抑制率以及與糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)途徑典型抑制劑的疊加率。試驗結果表明，冬凌草甲素與抑制劑丙二酸聯(lián)合使用時疊加率最小，為3.70%。表明冬凌草甲素主要通過抑制三羧酸循環(huán)途徑來抑制金黃色葡萄球菌的呼吸代謝。

SDH和MDH是真核細胞和原核細胞三羧酸循環(huán)中的關鍵酶，在細胞能量代謝中起著重要的作用，其活性變化可反映細胞的能量代謝狀況[21]。冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌后的MDH、SDH活性測定結果表明，冬凌草甲素能夠抑制MDH、SDH活性，1 MIC的冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌 8 h，與對照組相比，MDH活性降低了53.22%（P<0.01），SDH活性降低了33.96%（P<0.01）。試驗結果表明冬凌草甲素通過抑制呼吸代謝中MDH、SDH活性來抑制金黃色葡萄球菌的能量代謝，其中對MDH的抑制效果較為明顯。

能量代謝障礙會進一步導致蛋白質和核酸的合成受到阻礙，進而影響細胞的生長繁殖。冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌后的胞內可溶性蛋白質含量測定結果顯示，冬凌草甲素能抑制菌體蛋白質的合成，與對照組相比，50.00 μg/mL的冬凌草甲素作用金黃色葡萄球菌9h，其胞內的可溶性蛋白質總量降低了約50%（P<0.01）。質量濃度為12.50 μg/mL的冬凌草甲素處理組的SDS-PAGE結果證實，用藥組和對照組的蛋白質表達有明顯差異，對照組蛋白質譜帶多而清晰，而藥物作用后，大多蛋白質條帶變淺，有的譜帶甚至消失，但有的蛋白質條帶顏色變深，這種變化隨著時間的延長，更加明顯。

植物殺菌劑的抑菌機制多種多樣且有差異，可能是單一機制，也可能是多種機制的協(xié)同作用[22-23]。研究表明，冬凌草甲素可通過破壞細胞膜的通透性、抑制菌體的呼吸代謝和蛋白質的合成等途徑影響金黃色葡萄球菌的生長與繁殖。由于殺菌劑抑菌機制的復雜性，本研究僅從細胞膜的通透性、蛋白質合成和呼吸代謝情況等表象進行了初步分析，而關于其深層次的抑菌機制還需要從分子水平進行進一步的揭示。

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