張永德，林 勇，潘傳燕，馮鵬霏，陳曉漢，羅洪林

( 廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021 )

與多數(shù)脊椎動(dòng)物一樣，硬骨魚(yú)也具有先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)，以消除入侵的病原體，先天性免疫被認(rèn)為是對(duì)抗病原體的主要組成部分[1]。先天性免疫反應(yīng)是由生殖細(xì)胞編碼的模式識(shí)別受體(PRRs)通過(guò)識(shí)別外來(lái)刺激的保守病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)來(lái)啟動(dòng)宿主免疫反應(yīng)的，如細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖或肽聚糖、真菌的β-1，3-葡聚糖細(xì)胞壁、病毒的雙鏈RNA以及受損細(xì)胞釋放的內(nèi)源性分子等[2-3]。在已知的模式識(shí)別受體中，Toll樣受體(TLR)在識(shí)別微生物病原體相關(guān)分子模式中起關(guān)鍵作用，并觸發(fā)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，激活參與調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，包括促炎細(xì)胞因子[4]。Toll樣受體的細(xì)胞內(nèi)Toll/IL-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域?qū)⑼ㄟ^(guò)Toll/IL-1受體二聚化結(jié)合多個(gè)下游信號(hào)配體并激活核因子κB(NF-κB)[3]。在這些配體中，髓樣分化因子(MyD88)蛋白是除TLR3外介導(dǎo)大多數(shù)TLR活化的關(guān)鍵和保守的信號(hào)蛋白之一[5]。

MyD88蛋白是哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵因子，在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中具有共同的結(jié)構(gòu)特征，包括具有短接頭區(qū)的N-端死亡結(jié)構(gòu)域(DD)和C-端TIR結(jié)構(gòu)域[4]。其C-端TIR結(jié)構(gòu)域能夠與TLR相互作用，而N-端DD結(jié)構(gòu)域能夠與IL-1受體相關(guān)激酶4(IRAK4)相互作用，IRAK4又反過(guò)來(lái)募集IRAK1或IRAK2形成Myddosome信號(hào)復(fù)合物，激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)的傳導(dǎo)[6-7]。目前，已在許多無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中克隆鑒定了MyD88基因，包括哺乳動(dòng)物[8-9]、禽類(lèi)[10-11]、兩棲動(dòng)物[12]、爬行動(dòng)物[13]、魚(yú)類(lèi)[14-17]，以及一些無(wú)脊椎動(dòng)物[18-21]。MyD88蛋白作為配體蛋白在先天性免疫中的潛在作用已在模式動(dòng)物中得到證明。如MyD88基因敲除小鼠易受病毒和細(xì)菌感染[22-24]。MyD88基因突變體斑馬魚(yú)(Daniorerio)更容易受到遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)的感染[25]。

羅非魚(yú)(Oreochromis)是我國(guó)的主導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，然而近些年，羅非魚(yú)養(yǎng)殖時(shí)常受疾病的困擾，尤其是鏈球菌病已成為威脅羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)主要問(wèn)題[26-27]。疾病在危害羅非魚(yú)養(yǎng)殖的同時(shí)，也加重了藥物的濫用[28-29]。因此，了解宿主與病原的相互作用，以及羅非魚(yú)的免疫反應(yīng)機(jī)制等對(duì)于開(kāi)發(fā)有效治療、預(yù)防措施及減少藥物的使用至關(guān)重要。然而，羅非魚(yú)免疫相關(guān)研究仍然較薄弱，其抗細(xì)菌侵襲的免疫機(jī)制尚未完全明確。目前對(duì)于羅非魚(yú)免疫相關(guān)因子及其在免疫信號(hào)通路中的作用研究尚處起步階段。本研究對(duì)尼羅羅非魚(yú)(O.niloticus)MyD88基因進(jìn)行原核表達(dá)，通過(guò)免疫大耳兔制備抗羅非魚(yú)MyD88蛋白特異性抗體，為深入研究羅非魚(yú)MyD88蛋白的功能、TLR信號(hào)通路及先天性免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質(zhì)粒pET-B2m(由pET-28a改造而來(lái))、表達(dá)宿主B21(武漢金開(kāi)瑞生物公司)；DNA聚合酶、蛋白marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ(美國(guó)Fermentas公司)；In-Fusion? HD Cloning Kit(Clontech公司)；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(天根生物技術(shù)公司)；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Merck公司)；弗式完全佐劑、弗氏不完全佐劑(美國(guó)Sigma公司)；聚偏氟乙稀膜(PVDF)(ThermoFisher公司)；羊抗兔-HRP抗體(美國(guó)Jackson公司)；親和層析柱料(美國(guó)GE Healthcare公司)。

1.2 方法

采用DNAstar軟件對(duì)MyD88蛋白的抗原指數(shù)和細(xì)胞表位等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，采用在線分析工具ExPASy中的ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)MyD88蛋白質(zhì)疏水性，TMHMM server v.2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對(duì)MyD88蛋白序列進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增

根據(jù)尼羅羅非魚(yú)MyD88基因序列(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心登錄號(hào)：KJ130039)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)MyD88基因PCR引物，上下游引物序列分別為P1：5′-TCCACTGGGTTCTCGGACTATGGCATGTGCAGATAGC-3′，P2：5′-TAAGGCCGCACTCGAGCACCACCGGCAGGCT CAGGGCTTTT-3′。合成尼羅羅非魚(yú)MyD88基因序列，以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，100 μL反應(yīng)體系包括：TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 1.0 μL，10×Taq Buffer 10.0 μL，dNTP(10 mmol/L) 2.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各5.0 μL，模板DNA 2.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，52 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸45 s，28個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收。

1.2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將載體pET-B2m采用SalⅠ與BamHⅠ雙酶切處理，然后采用同源重組的方法將目的片段與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-B2m-MyD88，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)B21；篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。序列采用DNAstar MegAlign軟件包進(jìn)行比對(duì)分析，以確定基因正確插入載體。

1.2.4 目的基因的小量表達(dá)

將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌B21，取30 μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接入3.0 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至600 nm吸光度為0.6，其余培養(yǎng)液添加甘油置于-80 ℃，作為菌種備用。取部分菌液作為對(duì)照組，剩余菌液加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.5 mmol/L，兩組菌液繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h；然后取菌體1 mL，10 000 r/min離心30 s，收獲沉淀，用100 μL 1% SDS重懸，混勻，100 ℃處理10 min。最后10 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析。

再各稱取5 g未經(jīng)過(guò)改性處理的絲瓜絡(luò)纖維分別加入4個(gè)250 mL磨口燒瓶中，分別加入50 mL 0.5 mol/L 的 K2Cr2O7、 CoSO4、 KMnO4、 CuSO4溶液，浸泡1.5 h后，再放在轉(zhuǎn)速為200 r/min的磁力攪拌器上，攪拌0.5 h后，取出溶液，轉(zhuǎn)移到燒杯中，供比色用。

1.2.5 蛋白表達(dá)與破菌檢測(cè)

取保存的菌種20 μL轉(zhuǎn)接入20 mL液體LB培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)后取2 mL菌液加入含2000 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至600 nm吸光度約0.6，降低溫度至30 ℃；加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.5 mmol/L，30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 h。收集發(fā)酵液，7300 r/min離心10 min收集菌體。將菌體懸浮于40 mL預(yù)冷的NTA-0緩沖液中，冰浴超聲波破碎細(xì)菌，13 000 r/min、4 ℃離心30 min，收集上清液以及沉淀。取少量樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.6 包涵體蛋白的純化

將收集的沉淀加入Ni-NTA樹(shù)脂層析柱中，流速控制為0.5 mL/min，收集穿柱液體。以10倍柱床體積的NTA-0 Buffer沖洗，然后分別用10倍柱床體積的NTA-20、NTA-60、NTA-200、NTA-500緩沖液洗脫，收集各洗脫峰，取少量洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。純度達(dá)到要求的組分，置于透析袋中，4 ℃以1×PBS透析，最后4 ℃超濾濃縮透析產(chǎn)物。

1.2.7 多克隆抗體的制備和鑒定

將純化的重組蛋白與等容積弗氏完全佐劑乳化后，以500 μg/只的劑量免疫2只日本大耳兔，皮下多點(diǎn)注射。每只兔子免疫5～6次，每次免疫間隔14 d，并檢測(cè)免疫效價(jià)，待抗體表達(dá)恒定后，采血分離血清，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 免疫效價(jià)的ELISA檢測(cè)

以重組MyD88蛋白作為抗原(2 μg/mL)，按100 μL/孔加入苯丙乙烯到96孔反應(yīng)板中進(jìn)行抗原包被，4 ℃過(guò)夜；用PBST洗液洗3次，2%卵清蛋白于室溫封閉0.5 h，再洗滌3次后，將待檢血清按1∶2000、1∶4000、1∶8000作二倍梯度稀釋至1∶8 192 000，然后各取100 μL加入96孔板，以空白血清作為陰性對(duì)照。37 ℃溫育1 h后，PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5000)溶液100 μL/孔，37 ℃溫育45 min，PBST洗滌5次；每孔加入TMB顯色液100 μL顯色20 min，最后加入50 μL H2SO4終止反應(yīng)液，以酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光值。陽(yáng)性反應(yīng)的最大稀釋度為待測(cè)樣品的效價(jià)。

1.2.9 Western blot檢測(cè)

將純化的重組蛋白分別取25 ng和10 ng經(jīng)SDS-PAGE電泳后，200 mA濕法轉(zhuǎn)PVDF膜60 min，將膜用PBST洗3次，每次5 min，然后浸沒(méi)于封閉液中37 ℃封閉2 h。加入兔抗血清(稀釋度體積比為1∶1000)，于搖床37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min。然后加入羊抗兔-HRP二抗(1∶10 000倍體積稀釋)，37 ℃孵育1 h，取等體積的ECL試劑A液、B液混合滴于膜正面，于暗室反應(yīng)2 min，取出膠片立即浸入顯影液中顯色1 min，浸入定影液中定影1 min，晾干，標(biāo)定Marker后，拍照分析MyD88蛋白抗血清的特異性。

1.2.10 抗體純化

采用Protein G親和層析柱進(jìn)行抗體純化。將收集的抗血清與等體積2×PBS緩沖液混合后上樣，用10倍柱體積以上的PBS洗滌，至流出液無(wú)蛋白檢出，加入2倍柱體積0.1 mol/L檸檬酸(pH2.7)洗脫，收集洗脫產(chǎn)物，測(cè)定280 nm吸光度估算抗體濃度；采用1 mol/L Tris調(diào)節(jié)洗脫產(chǎn)物pH至中性，用10 ku超濾管將樣品濃縮至所需體積，純化濃縮后的抗體經(jīng)稀釋后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 MyD88蛋白疏水性及跨膜區(qū)分析

MyD88基因編碼蛋白由288個(gè)氨基酸組成，疏水性分析結(jié)果顯示，MyD88蛋白平均疏水性為-0.149，序列中含有較多的親水性氨基酸，親水性區(qū)段主要為：27～37、52～68、71～82、88～123、125～152、171～181、185～194、202～210、215～227、237～244、249～258、264～273(圖1)，序列親水性較好。疏水性氨基酸丙氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸分別占編碼的6.60%、4.51%、4.86%、10.76%、3.13%、3.82%和7.64%。跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示，MyD88蛋白無(wú)典型的跨膜區(qū)，MyD88蛋白的288個(gè)氨基酸均位于細(xì)胞膜表面，降低了跨膜區(qū)疏水性氨基酸對(duì)蛋白折疊的影響，易于表達(dá)和純化。

2.2 MyD88蛋白的抗原性分析

采用Protean模塊中的的Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)MyD88蛋白的抗原指數(shù)，發(fā)現(xiàn)MyD88蛋白序列具有豐富且分布均勻的抗原表位位點(diǎn)，其中抗原指數(shù)較高的區(qū)段為：3～12、52～65、71～82、88～123、125～152、170～181、185～194、202～210、215～227、237～244、249～258、264～273(圖2)。這些區(qū)段并且具有強(qiáng)的表面可及性和親水性位點(diǎn)，因此利用該蛋白制備抗體具有較強(qiáng)的可行性。

圖1 MyD88蛋白的疏水性分析

圖2 MyD88蛋白的抗原性分析

2.3 MyD88蛋白同源性分析

同源性分析結(jié)果顯示，尼羅羅非魚(yú)MyD88蛋白與兔MyD88蛋白(XP_010751574.1)序列的同源性高達(dá)81.60%。從同源性分析及抗體制備要求來(lái)看，作為多抗免疫原，MyD88蛋白應(yīng)該具有較高的免疫原性。

2.4 MyD88基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以pET-B2m-MyD88質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增MyD88基因，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1條864 bp的目的片段(圖3)，該片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)測(cè)序與序列比對(duì)分析，確定MyD88基因已正確插入載體pET-B2m中，載體構(gòu)建成功。

圖3 尼羅羅非魚(yú)MyD88基因原核表達(dá)載體的PCR檢測(cè)1.DL2000 plus DNA Marker; 2.MyD88基因擴(kuò)增產(chǎn)物.

2.5 小量誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-B2m-MyD88轉(zhuǎn)化大腸桿菌B21感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)的菌株在48.9 ku處出現(xiàn)顯著表達(dá)條帶(圖4)，與MyD88重組蛋白的預(yù)期大小一致。

圖4 MyD88蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)電泳檢測(cè)M.蛋白質(zhì)Marker; 1.未誘導(dǎo)的菌株; 2.誘導(dǎo)表達(dá)的菌株.

2.6 重組蛋白的表達(dá)與鑒定

對(duì)重組蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)菌液裂解及SDS-PAGE電泳后，上清液與沉淀均在48.9 ku處出現(xiàn)1條蛋白條帶，且沉淀中蛋白的含量顯著高于上清液中蛋白的含量(圖5)。

圖5 尼羅羅非魚(yú)MyD88蛋白的大量表達(dá)M.蛋白質(zhì)Marker; 1.上清液中的MyD88蛋白; 2.沉淀中的MyD88蛋白.

2.7 蛋白的提取與純化

大腸桿菌表達(dá)的重組MyD88蛋白主要以包涵體存在。細(xì)菌經(jīng)裂解與離心沉淀、重懸后，加入Ni-NTA樹(shù)脂層析柱中進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物10倍稀釋后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，在48.9 ku處有1條清晰的帶紋(圖6)。

圖6 MyD88重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析M.蛋白質(zhì)Marker; 1.純化的MyD88重組蛋白.

2.8 MyD88蛋白血清抗體的免疫效價(jià)

抗原采用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液分別包被，ELISA法分別檢測(cè)重組MyD88蛋白免疫的日本大耳兔抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，多克隆抗體的效價(jià)為1∶2 048 000(圖7)，該重組蛋白可以誘導(dǎo)日本大耳兔產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，且抗體效價(jià)較高。

2.9 Western blot檢測(cè)

純化的樣品蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。在泳道的48.9 ku位置，25 ng和10 ng重組蛋白均出現(xiàn)1條清晰的與陽(yáng)性血清反應(yīng)蛋白條帶，其中25 ng蛋白條帶更清晰，而免疫前陰性血清對(duì)照組在相應(yīng)位置未見(jiàn)明顯的條帶，表明MyD88抗血清具有特異的反應(yīng)特性。

圖7 尼羅羅非魚(yú)MyD88蛋白多克隆抗體效價(jià)的ELISA曲線

圖8 MyD88蛋白多克隆抗體特異性的Western blot檢測(cè)M.蛋白質(zhì)Marker; 1.25 ng純化的重組蛋白; 2.10 ng純化的重組蛋白; 3.陰性對(duì)照組.

2.10 抗體純化

將收集到的抗血清采用Protein G親和層析柱進(jìn)行兩次純化，純化的抗體經(jīng)4倍稀釋后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果在約50 ku和25 ku處各出現(xiàn)1條清晰條帶(圖9)，片段大小與抗體重鏈與輕鏈大小符合，純化效果較好。經(jīng)純化的抗體質(zhì)量濃度達(dá)10 mg/mL以上，純度約95%。

圖9 純化的MyD88抗體SDS-PAGE電泳檢測(cè)M.蛋白質(zhì)Marker; 1.純化的抗體.

3 討 論

MyD88蛋白作為T(mén)LR信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。迄今為止，MyD88基因在魚(yú)類(lèi)免疫相關(guān)的研究中仍較少，魚(yú)類(lèi)MyD88蛋白與抗體的研究則更少，Huang等[30]發(fā)現(xiàn)，MyD88與DNA疫苗acfA共同注射斑馬魚(yú)，可明顯提高M(jìn)HCⅠα、MHCⅡα、CD4、CD8α、IL-1β、TNFα等免疫相關(guān)基因的特異性抗體水平和表達(dá)水平；MyD88蛋白可增強(qiáng)acfA對(duì)溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)感染的免疫保護(hù)作用。羅非魚(yú)MyD88基因序列已被克隆，其表達(dá)情況研究已有報(bào)道[31]，但其功能尚不清楚，目前也無(wú)商業(yè)化可用的抗體用于MyD88蛋白研究，所以，筆者進(jìn)行羅非魚(yú)MyD88基因的表達(dá)及其抗體的制備研究，對(duì)該基因的功能研究具有重要意義。

3.1 原核克隆表達(dá)載體的選擇

由于在動(dòng)物先天性免疫信號(hào)通路中發(fā)揮著核心角色[32]，MyD88蛋白引起了學(xué)術(shù)界的廣泛重視。然而，組織中蛋白質(zhì)的低豐度導(dǎo)致難以從組織中獲得令人滿意的蛋白含量，限制了對(duì)其深入的研究；而作為天然提取的有效替代方法，異源表達(dá)提供了生產(chǎn)大量蛋白的簡(jiǎn)單且廉價(jià)的手段[33-36]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最早開(kāi)發(fā)和最成熟的外源蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)。由于具有清晰的遺傳背景、低成本，表達(dá)效率高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛用于基因的表達(dá)研究。目前pGE、pQE和pET系列質(zhì)粒已廣泛用于科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)，而pET系列質(zhì)粒由于其克隆和表達(dá)重組蛋白的高效性，以及具有多個(gè)候選融合標(biāo)簽，已成為目前最常用的表達(dá)載體之一。采用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白時(shí)，蛋白表達(dá)量的多少受多種因素的影響，如表達(dá)載體的選擇、宿主的選擇、外源基因中密碼子的使用，以及培養(yǎng)條件等[37]。本試驗(yàn)采用金開(kāi)瑞公司開(kāi)發(fā)的融合表達(dá)載體pET-B2m，以大腸桿菌B21作為表達(dá)宿主，在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即600 nm吸光度為0.6時(shí)，采用0.5 mmol/L IPTG作為誘導(dǎo)濃度，經(jīng)3 h的誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了MyD88重組蛋白的高效表達(dá)，也說(shuō)明pET-B2m是一種較好的表達(dá)載體，對(duì)尼羅羅非魚(yú)MyD88基因的表達(dá)具有高效性。重組蛋白的獲得不僅是制備抗體的基礎(chǔ)，也具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3.2 表達(dá)蛋白的存在形式及包涵體的形成

本試驗(yàn)采用IPTG對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)體系進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)超聲波破菌后，對(duì)上清液以及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)上清液與沉淀均在48.9 ku處出現(xiàn)1條帶紋，且沉淀中的量顯著高于上清液中的量，說(shuō)明所表達(dá)的重組蛋白以可溶性蛋白及不溶性的包涵體形式存在，但主要的存在形式為包涵體。包涵體是重組細(xì)菌中出現(xiàn)的功能性的無(wú)毒性的淀粉狀蛋白，與哺乳動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)的分泌顆粒類(lèi)似。包涵體形成是基因克隆表達(dá)中經(jīng)常出現(xiàn)的一種情況，這是重組菌作為重組“細(xì)菌工廠”的內(nèi)在的、通常不可避免的特質(zhì)[38]。在強(qiáng)啟動(dòng)子系統(tǒng)下，使用高溫、高誘導(dǎo)濃度進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，通常會(huì)導(dǎo)致目的蛋白以高翻譯率表達(dá)，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)耗竭，從而引起部分折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白分子聚集而形成包涵體[39]。蛋白表達(dá)量的多少也會(huì)影響包涵體的形成，表達(dá)量越高越容易形成包涵體，一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的表達(dá)水平超過(guò)其細(xì)胞總蛋白的2%，就會(huì)導(dǎo)致包涵體的形成[40]。而細(xì)菌胞漿環(huán)境條件的降低[41]，缺乏真核伴侶和翻譯后機(jī)制，也有助于包涵體的形成[42]。為了減少包涵體的形成，增加可溶性蛋白的量，研究人員已經(jīng)提出了許多對(duì)策，包括遺傳方法(如降低基因表達(dá)量或基因表達(dá)效率)、物理方法(如降低培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)濃度)、生理學(xué)方法(如同時(shí)生成伴侶分子和折疊調(diào)節(jié)劑)以及調(diào)整有效的養(yǎng)分(如碳源限制)[43-44]等。而最近的研究表明，包涵體中的大部分蛋白質(zhì)是有功能的，可以用于多種應(yīng)用而不用溶解和重新折疊[45]。由于本研究的目的主要是制備多克隆抗體，包涵體的形成不會(huì)對(duì)抗體的制備造成影響，因此，在進(jìn)行MyD88蛋白的表達(dá)時(shí)未考慮降低包涵體的形成。

3.3 多克隆抗體的特異性及效價(jià)

特異性抗體是研究基因功能重要的工具之一，雖然一些抗體可通過(guò)商業(yè)途徑獲得，但有時(shí)所需的抗體比較特殊，或所需抗體的量較大，商業(yè)途徑往往難以滿足要求，這時(shí)就需要自己制備。在抗體制備的幾種方法中，多克隆抗體制備通常是實(shí)驗(yàn)室的首選，因其操作簡(jiǎn)單，成本低，且不需要復(fù)雜的設(shè)備[46]。目前尚無(wú)可用的尼羅羅非魚(yú)MyD88蛋白抗體，本研究采用MyD88融合蛋白作為抗原來(lái)刺激日本大耳兔產(chǎn)生多克隆抗體，應(yīng)用制備的多克隆抗體與原核誘導(dǎo)表達(dá)的MyD88蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，在約48.9 ku處出現(xiàn)了1條明顯的目的條帶，表明多克隆抗體已成功制備，且可以特異性的識(shí)別原核表達(dá)的MyD88菌體蛋白。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，血清抗體的效價(jià)為1∶2 048 000，說(shuō)明免疫大耳兔以后，獲得了良好的免疫反應(yīng)，抗體效價(jià)較高。

本研究成功構(gòu)建了尼羅羅非魚(yú)MyD88基因原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)獲得了MyD88重組蛋白，將該重組蛋白免疫大耳兔后獲得了能特異性識(shí)別純化的MyD88蛋白的多克隆抗體，該重組蛋白及其抗體的制備，為后續(xù)MyD88蛋白的功能研究提供了有用的工具，也為進(jìn)一步深入研究MyD88蛋白在魚(yú)類(lèi)先天性免疫反應(yīng)中的作用奠定了基礎(chǔ)。