陳燕華 王亞梁朱德峰 石慶華 陳惠哲 向鏡 張義凱 張玉屏,*

外源油菜素內(nèi)酯緩解水稻穗分化期高溫傷害的機(jī)理研究

陳燕華1,3王亞梁1, 2, *朱德峰1石慶華2陳惠哲1向鏡1張義凱1張玉屏1,*

(1中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310006;2江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 南昌 330045;3湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 長(zhǎng)沙410218;*通訊聯(lián)系人, E-mail: wangyl0103@126.com; cnrrizyp@163.com)

明確水稻穗分化期高溫下噴施2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-epibrassinolide, EBR)對(duì)穗生長(zhǎng)及穎花形成的影響，并探究其生理機(jī)制。以熱敏感型水稻IR36為材料，在幼穗分化期設(shè)置40℃高溫和32℃適溫兩個(gè)處理，并噴施EBR，研究幼穗碳水化合物供應(yīng)、蔗糖代謝、細(xì)胞分裂素代謝及抗氧化能力的變化。1)高溫和適溫噴施EBR，水稻每穗粒數(shù)分別比不噴施的對(duì)照增加13.7% 和45.7%，其中以噴施0.15 mg/L效果最好，緩解了高溫對(duì)水稻幼穗生長(zhǎng)的抑制，增加穎花分化數(shù)和降低穎花退化率。2)噴施EBR對(duì)葉片凈光合速率無顯著影響，但促進(jìn)幼穗中干物質(zhì)和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物積累。EBR噴施增加高溫下幼穗中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因、和的表達(dá)，并顯著提高蔗糖代謝相關(guān)酶活性，EBR對(duì)高溫下碳水化合物利用的促進(jìn)作用大于適溫處理。3)噴施EBR降低高溫下細(xì)胞分裂素氧化酶基因和的表達(dá)量，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞分裂素合成和信號(hào)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，并在適溫下也表現(xiàn)出類似的效應(yīng)。4)噴施EBR降低高溫下超氧陰離子含量，增強(qiáng)了超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性。高溫下，噴施適宜濃度的EBR促進(jìn)碳水化合物向幼穗的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制細(xì)胞分裂素分解，同時(shí)降低高溫引起的過氧化傷害，進(jìn)而緩解了高溫對(duì)穎花形成的傷害。適溫條件噴施EBR也對(duì)穎花形成具有一定的促進(jìn)作用。

水稻；高溫；穎花形成；2,4-表油菜素內(nèi)酯；生理機(jī)制

穗發(fā)育期是水稻最重要的生長(zhǎng)時(shí)期，此期的氣象條件對(duì)水稻產(chǎn)量形成有重要影響。秈稻穗發(fā)育最適溫度為33.1℃左右，而粳稻是26℃~27℃[1]。近年來，我國長(zhǎng)江中下游單季稻時(shí)常出現(xiàn)花期熱害，導(dǎo)致穎花敗育而造成水稻產(chǎn)量損失，為此，一些地區(qū)通過推遲水稻播期避開抽穗期高溫天氣。然而，播期推遲卻使高溫與水稻穗分化期相遇，導(dǎo)致水稻穗發(fā)育和穎花形成受阻而影響每穗粒數(shù)[2,3]。

碳水化合物是水稻幼穗發(fā)育和穎花形成的基本物質(zhì)，干物質(zhì)積累與穎花分化呈顯著正相關(guān)[4]。碳水化合物來源于葉片光合作用，其轉(zhuǎn)運(yùn)是幼穗碳水化合物積累的基礎(chǔ)。前人研究發(fā)現(xiàn)，灌漿結(jié)實(shí)期高溫導(dǎo)致同化物積累不足和碳水化合物運(yùn)輸受阻，從而抑制籽粒充實(shí)[5-6]。水稻碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)以蔗糖為主，灌漿結(jié)實(shí)期高溫抑制蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、、等的表達(dá)，同化物向籽粒供應(yīng)減弱[7,8]。另一方面，幼穗發(fā)育也受激素的調(diào)控，特別是與細(xì)胞分裂素的代謝密切相關(guān)[9]。Wu等[2,10]研究表明高溫下幼穗中激素代謝紊亂，特別是細(xì)胞分裂素含量顯著降低，從而抑制穎花形成。

油菜素內(nèi)酯是重要的植物內(nèi)源激素之一，與穗發(fā)育及籽粒充實(shí)都有密切的關(guān)系，且在抵抗逆境脅迫上有較好效果[11]。研究表明，噴施2,4-表油菜素內(nèi)酯可以提高植物葉片凈光合速率，并增加可溶性糖的積累[12-13]，同時(shí)影響其他內(nèi)源激素代謝[14]。目前，隨著氣候變化的加劇，單季稻幼穗發(fā)育受高溫脅迫影響的幾率增加，施用2,4-油菜素內(nèi)酯是否可以緩解高溫對(duì)穗發(fā)育的影響并不清楚。為此，本研究利用人工氣候箱模擬高溫處理，通過外源噴施 2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-epibrassinolide, EBR)，明確噴施EBR對(duì)穗發(fā)育的影響，并從碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)利用、細(xì)胞分裂素代謝及抗氧化能力三個(gè)方面研究其機(jī)理，為緩解水稻幼穗生長(zhǎng)發(fā)育的高溫傷害提供理論與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試品種及其種植方法

在2017年的預(yù)備試驗(yàn)基礎(chǔ)上，試驗(yàn)于2018年在中國水稻研究所人工氣候箱群試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。選擇熱敏感型常規(guī)秈稻品種IR36為試驗(yàn)材料。于5月20日播種，大棚基質(zhì)育秧，6月10日選生長(zhǎng)一致的秧苗移栽到塑料盆(24 cm×22.5 cm×21.5 cm，每盆裝過篩土10 kg)，每盆4穴，每穴兩苗。每盆施復(fù)合肥(氮磷鉀比例為1∶1∶1)4.0 g作基肥，移栽活棵后施尿素0.5 g作為分蘗肥，穗分化始期施復(fù)合肥2.25 g作為穗肥。其余管理措施同高產(chǎn)栽培法。

1.2 高溫處理

試驗(yàn)分高溫(HT, 40℃)和適溫(32℃, NT)兩個(gè)溫度處理。高溫處理和適溫處理均利用人工氣候箱進(jìn)行，所用人工氣候箱四周采用超白鋼化玻璃，光照不足時(shí)利用人工光源補(bǔ)光，維持人工氣候箱光照輻射強(qiáng)度在50 000 lx左右。人工氣候箱溫度根據(jù)夏季高溫天氣溫度變化規(guī)律設(shè)置，高溫處理6:30?9:30為35℃，9:31?17:30為40℃，17:31?22:30為35.0℃，22:31?次日6:30為33.0℃，日平均溫度為36.0℃。適溫處理6:30?9:30為27℃，9:31?17:30為32℃，17:31?22:30為27.0℃，22:31?次日6:29為25.0℃，日平均溫度為25.9℃。處理期間，人工氣候濕度維持在70%~80%。

剝穗觀察水稻植株穗分化情況，在幼穗0.2~0.5 cm時(shí)進(jìn)行處理，處理期間保持盆栽有2~3 cm的水層，處理時(shí)間為15 d。在高溫和適溫處理前1天和處理第7天每盆均勻噴施不同濃度的2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-epibrassinolide, EBR)進(jìn)行處理(濃度分別為0 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.30 mg/L、0.50 mg/L)。除0.15 mg/L處理外， 5盆為一個(gè)處理，3次重復(fù)。處理結(jié)束后，將盆缽移出人工氣候箱，放回自然條件下生長(zhǎng)。2017年的預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.15 mg/L EBR處理對(duì)穎花形成的促進(jìn)效應(yīng)最好，為此根據(jù)濃度進(jìn)行機(jī)理研究，試驗(yàn)每處理設(shè)置30盆，3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 單株產(chǎn)量及產(chǎn)量結(jié)構(gòu)

在水稻成熟期，每重復(fù)取5盆植株進(jìn)行考種，考查單株穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株產(chǎn)量。

1.3.2 主莖穎花分化與退化

預(yù)備試驗(yàn)明確EBR噴施濃度為0.15 mg/L時(shí)效果最好。為保持溫度影響的一致性，選取NT、NT+0.15 mg/LEBR、HT、HT+0.15 mg/LEBR 4個(gè)處理的水稻新鮮主莖，采用松島省三痕跡法[15]，考查穎花分化與退化情況，穗抽出1/2時(shí)取樣，每重復(fù)考查10個(gè)主莖。

1.3.3 葉片凈光合速率

選取NT，NT+0.15 mg/LEBR，HT，HT+0.15 mg/LEBR 4個(gè)處理的水稻新鮮主莖，在處理的第7天和第15天利用Li-6400便攜式光合作用儀(LI-COR，Lincoln，NE，美國)測(cè)量葉片凈光合速率，光合儀參數(shù)設(shè)置如下：光量子通量為1000 μmol/(m2·s), CO2濃度為450 μmol/mol，葉面積為6 cm2，流速500 μmol/s, 溫度設(shè)置適溫處理32℃，高溫處理40℃。每重復(fù)測(cè)定10個(gè)主莖。

1.3.4 幼穗干質(zhì)量

選取NT，NT+0.15 mg/LEBR，HT，HT+0.15 mg/LEBR 4個(gè)處理的水稻新鮮主莖，在高溫處理第7天和第15天剝穗觀察幼穗大小，150℃下殺青后80℃下烘72 h，稱量。

1.3.5 非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測(cè)定

在高溫處理第7天和第15天，選取NT，NT+0.15 mg/LEBR，HT，HT+0.15 mg/LEBR 4個(gè)處理的水稻新鮮主莖幼穗，每重復(fù)取10個(gè)主莖，用液氮速凍，置于?80℃冰箱中保存，用于生理指標(biāo)測(cè)定。

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量是可溶性糖和淀粉含量的總和。可溶性糖含量和淀粉含量測(cè)定采用Hansen等[16]的方法。將0.1 g冷凍的幼穗研磨成細(xì)粉并在100℃的蒸餾水中提取，然后將混合物在10 000×下離心10 min。沉淀物干燥后用于測(cè)定淀粉含量。0.1 mL上清液與0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯溶液(1 g蒽酮溶于50 mL乙酸乙酯)和5 mL H2SO4混合。煮沸1 min后，監(jiān)測(cè)反應(yīng)混合物在630 nm處的吸光度變化。制備標(biāo)準(zhǔn)蔗糖溶液測(cè)定可溶性糖含量。上述離心后的沉淀，加入80％乙醇，80℃恒溫水浴20 min，期間不斷攪拌，冷卻后加入2 mL 9.2 mol/L高氯酸，震蕩10 min，加6 mL蒸餾水，10 000×下離心20 min，收集上清液的同時(shí)將殘?jiān)鼉?nèi)加入2 mL 4.6mol/L高氯酸并震蕩10 min，加入6 mL蒸餾水后10 000×下離心10 min，收集上清液，棄去殘?jiān)?，上清液合并定容后測(cè)定淀粉含量。淀粉含量測(cè)定同樣參考Hansen等[16]的方法。

1.3.6 可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合酶、蔗糖酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定

每個(gè)指標(biāo)測(cè)定選取0.1 g冷凍的幼穗，利用可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合酶、蔗糖酶、己糖激酶、丙酮酸激酶及丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定試劑盒(蘇州科銘有限公司提供)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 玉米素核苷含量測(cè)定

玉米素核苷(ZR)含量測(cè)定利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，委托中國農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 超氧陰離子含量、超氧化物歧化酶、氧化氫酶及過氧化物酶活性測(cè)定

每個(gè)指標(biāo)測(cè)定選取0.1 g冷凍的幼穗，利用超氧陰離子含量、超氧化物歧化酶、氧化氫酶及過氧化物酶活性測(cè)定測(cè)定試劑盒(蘇州科銘有限公司)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 幼穗RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量

取冷凍保存的幼穗樣品0.1 g，用于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因、、和細(xì)胞分裂素代謝相關(guān)基因、、、、、、和等的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定?？俁NA提取采用Trizol法[17]樣品從?80℃冰箱取出后在冰上快速裝入放置在液氮中的1.5 mL無NA離心管中，加1 mL TRIZOL(Aidlab Biotechnologies, 北京)，混勻，室溫放置5 min。然后加入200 μL氯仿，搖勻室溫放置3 min后4℃、10 000×下離心10 min，吸上清到1.5 mL 無RNA離心管中，加入500 μL異丙醇，搖勻后冰上放置10 min，4℃、10 000×下離心10 min可出現(xiàn)RNA沉淀，小心倒掉上清，加1 mL 70%乙醇(DEPC水配制) 4℃、10 000×下離心10 min，小心倒掉上清后風(fēng)干，加40 μL DEPC水溶解RNA沉淀。RNA反轉(zhuǎn)錄用試劑盒[ReverTra Ace quantitative PCR RT Master Mix(Toyobo, Osaka, Japan)]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。向反轉(zhuǎn)錄完的20 μL產(chǎn)物中加入140 μL的雙蒸水稀釋，實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用7500實(shí)時(shí) PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems System)進(jìn)行?；虮磉_(dá)分析所用引物序列如表1所示。以為內(nèi)參基因，用2–ΔΔCT方法[18]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；用SAS 9.4軟件進(jìn)行方差分析；采用鄧肯新復(fù)極差法檢驗(yàn)處理間差異(=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成

外源噴施EBR對(duì)水稻單株產(chǎn)量及其構(gòu)成有顯著的影響。由表2可知，適溫及高溫條件下噴施EBR處理的單株平均產(chǎn)量比噴施清水對(duì)照處理分別提高11.1%和68.1%，其中以0.15 mg/L EBR噴施處理的增幅最大，適溫條件下增加 20.9%，高溫條件下增加114.8%。從產(chǎn)量結(jié)構(gòu)上看，不同濃度下單株穗數(shù)和千粒重變化幅度不大，結(jié)實(shí)率雖然有顯著變化，但沒有呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律。EBR噴施對(duì)每穗粒數(shù)的影響最為明顯，隨著噴施濃度的增加，每穗粒數(shù)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在適溫條件和高溫條件下均在0.15 mg/L濃度噴施時(shí)有最大值，分別比清水噴施增加20.2%和65.5%。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

表2 高溫下不同濃度EBR噴施對(duì)水稻單株產(chǎn)量及其構(gòu)成的影響

NT表示適溫人工氣候箱處理；HT表示高溫人工氣候箱處理；數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；同列中不同小寫字母表示處理間差異顯著(<0.05，=3)。

NT, Normal temperature phytotron; HT, High temperature phytotron; Values are Mean±SD; Values followed by different lowercase letters within the same column are significantly different at 0.05 level among treatments.

由圖1可知，0.15 mg/L EBR促進(jìn)了高溫下主莖幼穗生長(zhǎng)(圖1-A)。高溫處理15 d顯著減少了主莖每穗穎花數(shù)，噴施0.15 mg/LEBR緩解了高溫對(duì)穎花形成的傷害(圖1-B)，從穎花分化與退化上看，適溫下噴施0.15 mg/LEBR對(duì)主莖穎花分化數(shù)和穎花退化率的影響不大，高溫下不噴施EBR處理的主莖穎花分化數(shù)比適溫下降低29.3%，主莖穎花退化率增加57.5%。高溫下0.15 mg/LEBR噴施使主莖每穗穎花分化數(shù)比不噴施增加24.0%，主莖穎花退化率比不噴施降低18.6%。以上說明，噴施EBR對(duì)高溫下穗發(fā)育抑制有緩解作用。

2.2 幼穗碳水化合物積累及蔗糖利用

碳水化合物積累是水稻幼穗發(fā)育的基礎(chǔ)。由圖2可知，高溫下水稻上部全展葉凈光合率并沒有受到影響，噴施0.15 mg/LEBR，葉片凈光合速率有輕微的增加，但效果并不顯著(圖2-A)，說明幼穗分化期高溫處理對(duì)水稻單株干物質(zhì)積累不會(huì)造成影響。然而，高溫處理抑制幼穗干物質(zhì)積累，與適溫處理相比，高溫處理15 d幼穗干物質(zhì)積累顯著下降55.3%，高溫下噴施0.15 mg/LEBR比不噴施EBR干物質(zhì)積累增加63.9%，并且適溫下噴施外源EBR對(duì)水稻幼穗干物質(zhì)積累也有一定的促進(jìn)作用(圖2-B)。幼穗非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量變化趨勢(shì)與干物質(zhì)積累量一致(圖2-C)。蔗糖是碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)的主要介質(zhì)，與適溫對(duì)照相比，高溫下蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因、和相對(duì)表達(dá)量顯著降低，外源噴施0.15 mg/LEBR可促進(jìn)高溫下、和的表達(dá)，特別是在高溫處理7 d，外源噴施0.15 mg/LEBR顯著促進(jìn)了3個(gè)基因的表達(dá)，且在適溫下噴施0.15 mg/LEBR對(duì)3個(gè)基因的表達(dá)也有一定的促進(jìn)作用。

A－高溫及適溫處理7 d和15 d的幼穗表型，標(biāo)尺分別為0.5 cm和1 cm; B－高溫和適溫處理15 d水稻抽穗期穗部表型, 標(biāo)尺為2.5 cm; C－0.15 mg/L EBR噴施對(duì)高溫及適溫下水稻穎花分化數(shù)的影響；D－0.15 mg/L EBR噴施對(duì)高溫及適溫下水稻穎花退化率的影響。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Fig. 1. Effect of exogenous 2, 4-epibrassinolide (EBR) application(0.15 mg/L) on young panicle development and spikelet formation under high temperature.

A－頂部全展葉凈光合速率; B－幼穗干物質(zhì)積累; C－非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量; D－OsSUT1相對(duì)表達(dá)量; E－OsSUT2相對(duì)表達(dá)量; F－OsSUT4相對(duì)表達(dá)量。

Fig. 2. Effect of 0.15 mg/L exogenous 2, 4-epibrassinolide (EBR) application on carbohydrate distribution and transportation of young panicles under high temperature.

圖3 高溫下噴施EBR (0.15 mg/L)噴施對(duì)幼穗中蔗糖利用相關(guān)酶活性的影響

Fig. 3. Effect of 0.15 mg/L exogenous 2, 4-epibrassinalide (EBR) application on enzymes activities related to sucrose utilization under high temperature.

對(duì)蔗糖代謝進(jìn)行分析，高溫抑制了水稻幼穗中可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶，蔗糖合成酶活性及蔗糖酶活性，0.15 mg/LEBR噴施增加了高溫對(duì)3個(gè)酶的活性，高溫下噴施0.15 mg/LEBR 3個(gè)酶活性與適溫下相比無顯著差異(圖3-A~C)。蔗糖一方面為幼穗發(fā)育的干物質(zhì)積累提供原料，另一方面為幼穗發(fā)育提供能量。與適溫相比，高溫抑制糖酵解過程中己糖激酶、丙酮酸激酶及丙酮酸脫氫酶活性，噴施0.15 mg/LEBR增加了酶的活性，適溫處理15 d噴施EBR 3個(gè)酶活性分別增加17.2%、15.6%和52.6%，高溫下分別增加18.8%、22.0%和89.3%，高溫下酶活性增幅要大于適溫處理，然而高溫處理下0.15 mg/LEBR噴施15 d丙酮酸脫氫酶活性高于適溫之外，高溫下0.15 mg/LEBR噴施3個(gè)酶活性仍然小于適溫下噴施EBR(圖3-D~E)。以上說明，外源噴施0.15 mg/L EBR促進(jìn)碳水化合物向幼穗的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，進(jìn)而緩解高溫傷害。

2.3 玉米素核苷含量及細(xì)胞分裂素相關(guān)代謝基因表達(dá)

細(xì)胞分裂素是幼穗發(fā)育中最重要的激素，玉米素核苷是細(xì)胞分裂素的主要活性物質(zhì)。由圖4可知，與適溫處理相比，高溫處理7 d和15 d使玉米素核苷含量降低17.1% 和16.4%。噴施0.15 mg/LEBR使高溫處理7 d和15 d玉米素核苷含量比不噴施EBR增加了17.2% 和10.9%，適溫下增加10.5% 和22.3%。并且適溫條件下噴施0.15 mg/LEBR也顯著增加玉米素核苷的含量，說明噴施EBR利于提高玉米素核苷含量。

內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平由合成和降解速度共同決定，高溫下細(xì)胞分裂素合成有關(guān)基因和表達(dá)降低，噴施0.15 mg/LEBR同時(shí)促進(jìn)了高溫和適溫條件下和的表達(dá)(圖5-A~B)。蛋白質(zhì)OsCKX能夠催化細(xì)胞分裂素降解，高溫下和基因表達(dá)顯著提高，噴施0.15 mg/LEBR抑制了和的表達(dá)，在適溫條件下噴施EBR對(duì)兩個(gè)基因表達(dá)影響不大(圖5-C~D)。噴施0.15 mg/LEBR對(duì)細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也造成了一定的影響，A型響應(yīng)調(diào)節(jié)因子()和B型響應(yīng)調(diào)節(jié)因子()均受到了0.15 mg/LEBR的調(diào)節(jié)。與適溫相比，高溫抑制了、、和的表達(dá)，噴施0.15 mg/LEBR顯著提高了4個(gè)基因在高溫下的表達(dá)量，并且高于適溫下的表達(dá)量，適溫下噴施0.15 mg/LEBR也增加了、、和的表達(dá)量。以上說明，噴施0.15 mg/LEBR能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂的合成，抑制高溫下細(xì)胞分裂素的分解作用，并促進(jìn)細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖4 高溫下噴施EBR對(duì)幼穗玉米素核苷含量的影響

Fig. 4. Effect of 2, 4-epibrassinolide (EBR) application on zeatin riboside content in young panicles under high temperature.

2.4 幼穗抗氧化能力

圖5 高溫下噴施EBR (0.15 mg/L)對(duì)幼穗中細(xì)胞分裂素相關(guān)代謝基因表達(dá)的影響

Fig. 5. Effect of 0.15 mg/L EBR application on relative expression of cytokinin metabolism genes under high temperature.

圖6 高溫下噴施EBR (0.15 mg/L) 對(duì)幼穗抗氧化能力的影響

Fig. 6. Effect of 0.15 mg/L exogenous 2, 4-epibrassinolide (EBR) application on antioxidant capacity of young panicles.

與適溫相比，高溫處理7 d和15 d，超氧陰離子含量分別增加12.7%和7.1%。噴施EBR降低了高溫下超氧陰離子含量(圖6-A)。隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，高溫下超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性和過氧化物酶活性顯著下降，噴施EBR增加了高溫下3種酶的活性，高溫處理15 d，噴施EBR處理的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性分別比高溫對(duì)照增加106.0%、43.7%和45.8%，但始終低于適溫下的酶活性。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)適溫下噴施0.15 mg/LEBR對(duì)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性也有一定的提高作用，適溫處理15 d，噴施EBR超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性增加13.9%、18.1%和23.2%(圖6-B~D)。

3 討論

Wu 等[19]研究表明油菜素內(nèi)酯含量提高能夠增加水稻分蘗數(shù)，每穗粒數(shù)及干物質(zhì)積累，從而增加水稻產(chǎn)量。本研究結(jié)果表明，噴施外源2,4-表油菜素內(nèi)酯能夠增加水稻每穗粒數(shù)，且噴施0.15 mg/L EBR效果最為明顯，隨著濃度增加，每穗粒數(shù)增幅下降，在適溫條件下，噴施0.15 mg/L EBR對(duì)每穗粒數(shù)也有顯著的增加效應(yīng)，因此適宜濃度的EBR不僅可以緩解高溫，且在正常條件下對(duì)水稻生產(chǎn)也有促進(jìn)作用。有研究表明2,4-表油菜素內(nèi)酯可以緩解水稻生產(chǎn)中的多種脅迫[20-21]，高濃度的EBR噴施對(duì)穎花形成有不利的影響，這可能由于與高濃度噴施引起植株體內(nèi)代謝紊亂有關(guān)。

穎花分化數(shù)和干物質(zhì)積累量顯著正相關(guān)，干物質(zhì)的主要來源是葉片光合作用，前人研究表明外源噴施EBR能夠提高植物葉片的凈光合能力[12,22]，這是由于噴施EBR延緩了葉片衰老。然而本研究中，適宜濃度的EBR噴施并沒有對(duì)葉片凈光合速率造成明顯的影響, 這可能與油菜素內(nèi)酯噴施的時(shí)期有關(guān)，本研究中的干物質(zhì)同化的葉片主要是穗分化期上部全展葉，這個(gè)時(shí)期，全展葉在高溫和適溫下都表現(xiàn)出較高的光合速率，特別在高溫條件下，由于強(qiáng)蒸騰作用的存在，水稻凈光合速率甚至可以出現(xiàn)輕微的增加趨勢(shì)[23]，因而噴施EBR對(duì)這個(gè)時(shí)期全展葉的光合速率影響不大。高溫抑制了蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，說明碳水化合物分配受阻，而EBR噴施緩解了這種抑制效果，說明EBR能夠調(diào)控基因的表達(dá)，促進(jìn)同化物從葉片到幼穗的運(yùn)輸，進(jìn)而促進(jìn)穎花分化。結(jié)果明確幼穗干物質(zhì)積累受阻是由于水稻碳水化合物分配改變而不是同化物積累不足，然而，碳水化合物代謝也對(duì)物質(zhì)積累造成影響，蔗糖代謝是幼穗發(fā)育中同化物供應(yīng)的基礎(chǔ)。李贊堂等[22]指出，EBR噴施可以提高蔗糖代謝相關(guān)酶的活性，促進(jìn)籽粒灌漿。本研究表明高溫抑制了蔗糖代謝相關(guān)酶的表達(dá)，并且同時(shí)抑制了糖酵解過程中的限速酶活性，楊洪建等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)高溫影響了蔗糖的卸載和利用，蔗糖代謝紊亂也是穎花退化加劇的重要原因，EBR噴施提高蔗糖代謝相關(guān)酶活性，本研究明確了EBR噴施促進(jìn)了高溫下碳水化合物利用，但這種效應(yīng)在適溫下也體現(xiàn)出來，也是適溫下EBR噴施提高穎花數(shù)的原因之一。

穗發(fā)育和激素代謝密切相關(guān)，細(xì)胞分裂素是影響水稻穗發(fā)育的重要的激素[25-26]。玉米素核苷是細(xì)胞分裂素的主要類型。本研究表明，高溫下玉米素核苷含量顯著降低，而細(xì)胞分裂素合成相關(guān)基因和表達(dá)量并沒有發(fā)生顯著的變化，然而高溫顯著增加了細(xì)胞分裂素氧化酶基因和的表達(dá)量，說明高溫使水稻細(xì)胞分裂素含量降低的主要原因是高溫導(dǎo)致了細(xì)胞分裂素的分解。這與Wu等[10]研究結(jié)果是一致的。在高溫條件下，EBR噴施抑制細(xì)胞分裂素氧化酶基因和的表達(dá)，并同時(shí)促進(jìn)2和的表達(dá), EBR噴施可以抑制細(xì)胞分裂素氧化分解[27]。在適溫條件下，EBR噴施通過促進(jìn)細(xì)胞分裂素合成而提高了幼穗中玉米素核苷的含量。本研究也發(fā)現(xiàn)，EBR噴施對(duì)細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)導(dǎo)也有促進(jìn)作用，細(xì)胞分裂素A型調(diào)節(jié)因子和B型調(diào)節(jié)因子的基因表達(dá)說明，高溫抑制了幼穗中的細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)導(dǎo)，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，EBR不僅緩解了這種抑制作用，而且促進(jìn)了細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)導(dǎo)，說明EBR和細(xì)胞分裂素對(duì)水稻的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)之間有交互作用[28]。

本研究結(jié)果表明，EBR噴施導(dǎo)致水稻幼穗中抗氧化能力增強(qiáng)，降低了高溫引起的超氧陰離子含量積累，可以減輕高溫下超氧化物積累對(duì)細(xì)胞膜的破壞[29-30]。Xia等[31]研究發(fā)現(xiàn)，BR通過增強(qiáng)、和的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而增加冷脅迫下番茄的抗氧化能力，熱害條件下，油菜素內(nèi)酯怎樣調(diào)控細(xì)胞抗氧化能力的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。研究中另外發(fā)現(xiàn)，外源表油菜素內(nèi)酯的噴施也可以促進(jìn)水稻花藥開裂，對(duì)緩解水稻花期高溫?zé)岷σ灿幸欢ǖ淖饔谩Ｈ欢?，由于表油菜素?nèi)酯成本相對(duì)較高，在實(shí)際生產(chǎn)中可以在穗分化期結(jié)合水稻病蟲害的防治，在緩解高溫?zé)岷Φ耐瑫r(shí)做到一噴多防，進(jìn)而提高生產(chǎn)效率。

[1] Sanchez B, Rasmussen A, Porter J R. Temperatures and the growth and development of maize and rice: A review., 2014, 20: 408-417.

[2] Wu C, Cui K, Wang W, Li Q, Fahad S, Hu Q, Huang J, Nie L, Peng S. Heat-induced phytohormone changes are associated with disrupted early reproductive development and reduced yield in rice., 2016: 6.

[3] Wang Y, Wang L, Zhou J, Hu S, Chen H, Xiang J, Zhang Y, Zeng Y, Shi Q, Zhu D, Zhang Y. Research progress on heat stress of rice at flowering., 2019, 26: 1-10.

[4] 柳新偉, 孟亞利, 周治國, 曹衛(wèi)星. 水稻穎花分化與退化的動(dòng)態(tài)特征. 作物學(xué)報(bào), 2005, 31: 451-455.

Liu X W, Meng Y L, Zhou Z G, Gao W X. Dynamic characteristics of floret differentiation and degeneration in rice., 2005, 31: 451-455. (in Chinese with English abstract)

[5] Zhang C, Feng B, Chen T, Fu W, Li H, Li G, Jin Q, Tao L, Fu G. Heat stress-reduced kernel weight in rice at anthesis is associated with impaired source-sink relationship and sugars allocation., 2018, 155: 718-733.

[6] Perdomo J A, Capo-Bauca S, Carmo-Silva E, Galmes J. Rubisco and rubisco activase play an important role in the biochemical limitations of photosynthesis in rice, Wheat, and maize under high temperature and water deficit., 2017: 8.

[7] Takehara K, Murata K, Yamaguchi T, Yamaguchi K, Chaya G, Kido S, Iwasaki Y, Ogiwara H, Ebitani T, Miura K. Thermo-responsive allele of sucrose synthase3 () provides high-temperature tolerance during the ripening stage in rice (L.)., 2018, 63: 336-342.

[8] Miyazaki M, Araki M, Okamura K, Iwaya-Inoue M. Assimilate translocation and expression of sucrose transporter,, contribute to high-performance ripening under heat stress in the heat-tolerant rice cultivar Genkitsukushi., 2013, 170: 1579-1584.

[9] 丁承強(qiáng). 氮素穗肥調(diào)控水稻每穗穎花數(shù)的分子機(jī)制. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

Ding C Q. Molecular mechanism of nitrogen fertilization in increasing the spikelet number per panicle of rice. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012.

[10] Wu C, Cui K, Wang W, Li Q, Fahad S, Hu Q, Huang J, Nie L, Mohapatra P K, Peng S. Heat-induced cytokinin transportation and degradation are associated with reduced panicle cytokinin expression and fewer spikelets per panicle in rice., 2017:8.

[11] Vriet C, Russinova E, Reuzeau C. Boosting crop yields with plant steroids., 2012, 24: 842-857.

[12] Yu J Q, Huang L F, Hu W H, Zhou Y H, Mao W H, Ye S F, Nogues S. A role for brassinosteroids in the regulation of photosynthesis in., 2004, 55: 1135-1143.

[13] Zhang M, Zhai Z, Tian X, Duan L, Li Z. Brassinolide alleviated the adverse effect of water deficits on photosynthesis and the antioxidant of soybean (L.)., 2008, 56: 257-264.

[14] Ryu H, Cho Y. Plant hormones in salt stress tolerance., 2015, 58: 147-155.

[15] 松島省三. 稻作的理論與技術(shù). 龐城譯, 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1966: 121-133.

Matsushima S. Theory and Technology of Rice Cultivation. Pang C Trans. Beijing: Agriculture Press, 1966: 121-133. (in Chinese)

[16] Hansen J, M?ller I. Percolation of starch and soluble carbohydrates from plant tissue for quantitative determination with anthrone., 1975, 68 (1): 87-94.

[17] 王杰, 王全, 田娜, 王瑜, 王愛香, 張克中, 崔金騰. 不同植物組織RNA提取方法的比較分析. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 30(1): 76-80.

Wang J, Wang Q, Tian N, Wang Y, Wang A X, Zhang K Z, Cui J T. Comparison and analysis of RNA extracting method from different plant tissues., 2015, 30(1): 76-80.

[18] Czechowski T, Bari R P, Stitt M, Scheible W R, Udvardi M K. Real-time RT-PCR profiling of over 1400transcription factors: Unprecedented sensitivity reveals novel root- and shoot-specific genes., 2004, 38: 366-379.

[19] Wu C Y, Trieu A, Radhakrishnan P, Kwok S F, Harris S, Zhang K, Wang J, Wan J, Zhai H, Fujioka S, Feldmann K A, Pennell R I. Brassinosteroids regulate grain filling in rice., 2008, 20: 2130-2145.

[20] Wang F, Zhang Y, Guo Q, Tan H, Han J, Lin H, Wei H, Xu G, Zhu C. Effects of exogenous 5-aminolevulinic acid and 2,4-epibrassinolide on Cd accumulation in rice from Cd-contaminated soil., 2018, 25: 320-329.

[21] Clouse S D. Brassinosteroid/abscisic acid Antagonism in balancing growth and stress., 2016, 38: 118-120.

[22] 李贊堂, 王士銀, 姜雯宇, 張帥, 張少斌, 徐江. 穗分化期外施24-表油菜素內(nèi)酯（EBR）促進(jìn)水稻源、庫及籽粒灌漿的生理機(jī)制. 作物學(xué)報(bào), 2018, 44(4): 581-590.

Li Z, Wang S, Jiang W, Zhang S, Zhang S, Xu J. Physiological mechanisms of promoting source, sink, and grain filling by 24-epibrassinolide (EBR) applied at panicle initiation stage of rice., 2018, 44(4): 581-590. (in Chinese with English abstract)

[23] Zhang C, Fu G, Yang X, Yang Y, Zhao X, Chen T, Jin Q, Tao L X. Heat stress effects are stronger on spikelets than on flag leaves in rice due to differences in dissipation capacity., 2016, 202: 394-408.

[24] 楊洪建, 楊連新, 黃建曄, 劉紅江, 董桂春, 顏士敏, 朱建國, 王余龍. FACE對(duì)武香粳14穎花分化與退化的影響. 作物學(xué)報(bào), 2006, 32: 1076-1082.

Yang H, Yang L, Huang J, Liu H, Dong G, Yan S, Zhu J, Wang Y. Effect of free-air CO2enrichment on spikelet differentiation and degeneration ofrice Wuxiangjing 14., 2006, 32: 1076-1082. (in Chinese with English abstract)

[25] Wang Z, Zhang W, Yang J. Physiological mechanism underlying spikelet degeneration in rice., 2018, 17: 1475-1481.

[26] Ashikari M, Sakakibara H, Lin S, Yamamoto T, Takashi T, Nishimura A, Angeles E R, Qian Q, Kitano H, Matsuoka M. Cytokinin oxidase regulates rice grain production., 2005, 309: 741-745.

[27] Yuldashev R, Avalbaev A, Bezrukova M, Khripach V, Shakirova F. Cytokinin oxidase is involved in the regulation of cytokinin content by 24-epibrassinolide in wheat seedlings., 2012, 55: 1-6.

[28] Hu Y, Bao F, Li J. Promotive effect of brassinosteroids on cell division involves a distinct CycD3-induction pathway in., 2010, 24: 693-701.

[29] Ahmad P, Jaleel C A, Salem M A, Nabi G, Sharma S. Roles of enzymatic and nonenzymatic antioxidants in plants during abiotic stress., 2010, 30: 161-175.

[30] 曹云英, 趙華. 高溫脅迫下油菜素內(nèi)酯對(duì)水稻幼苗的保護(hù)作用. 中國水稻科學(xué), 2007, 21(5): 525-529.

Cao Y Y, Zhao H. Protective roles of brassinolide in rice seedling under heat stress., 2007, 21(5): 525-529. (in Chinese with English abstract)

[31] Xia X, Fang P, Guo X, Qian X, Zhou J, Shi K, Zhou Y, Yu J. Brassinosteroid-mediated apophatic H2O2-glutare doxin 12/14 cascade regulates antioxidant capacity in response to chilling in tomato., 2017, 41: 1052-1064.

Mechanism of Exogenous Brassinolide in Alleviating High Temperature Injury at Panicle Initiation Stage in Rice

CHEN Yanhua1, 3, WANG Yaliang1, 2, *, ZHU Defeng1, SHI Qinghua2, CHEN Huizhe1, XIANG Jing1,ZHANG Yikai1, ZHANG Yuping1, *

(China National Rice Research Institute,,,;College of Agronomy,,,;College of Agronomy,,,;Corresponding author,:;)

【】The purpose of the study is to ascertain the effects of 2,4-epibrassinolide(EBR) application on rice panicle development and spikelet formation under high temperature, and to explore the physiological mechanism. 【】Heat-sensitive inbred rice cultivar IR36 was subjected to high temperature (HT, 40℃) and normal temperature (NT, 32℃) in climate chambers with EBR application, and the carbohydrate supplement, sucrose metabolism, cytokinin metabolism, and antioxidant capacity of young panicle were investigated. 【】1) EBR application increased the number of spikelets per panicle by 13.7% and 45.7% on average under HT and NT, respectively, in comparison to the control. And 0.15 mg/L EBR application level performed the highest efficiency in increasing the number of spikelet number, EBR application prompted panicle development and spikelet differentiation, and inhibited spikelet degeneration. 2) EBR application did not influence leaf net photosynthesis, meanwhile increased the dry matter and nonstructural carbohydrate accumulation in young panicles. Under high temperature, EBR application significantly upregulated the expression levels of sucrose transport genes,, and, and EBR enhanced the related enzymes activities of sucrose metabolism especially in HT than in NT. 3) EBR application reduced the expression levels of cytokinin oxidase genes,and, under HT. Meanwhile, EBR application promoted the genes expression involved in cytokinin biosynthesis and signal transduction both under HT and NT treatments. 4) EBR application increased the activities of superoxide dismutase, catalase and peroxidase, reduced the content of superoxide under HT. 【】Under HT conditions, EBR application at appropriate concentration could alleviate heat damage to spikelet formation by promoting carbohydrates transportation to young panicles, inhibiting cytokinin oxidation, and reducing peroxidation injures. Meanwhile, EBR application could promote spikelet formation under normal temperature.

rice (L.); high temperature; spikelet formation; 2,4-epibrassinolide; physiological mechanism

S482.8; S511.01

A

1001-7216(2019)05-0457-10

10.16819/j.1001-7216.2019.9036

2019-03-29；

2019-04-15。

國家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)(2017YFD0300409)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-01-07B)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目。