張露，符珍，林瑩，尹秀華

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004）

桄榔，在植物分類學(xué)上桄榔屬于被子植物單子葉植物綱棕櫚目棕櫚科桄榔屬桄榔種植物，是一種常綠喬木[1]。桄榔粉是廣西著名的四大名粉之一，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有較多的蛋白質(zhì)，碳水化合物和多種微量元素，并且膳食纖維含量也較高[2]。食用桄榔粉對(duì)人體具有非常好的醫(yī)療保健作用，是一種純天然的綠色保健食品[3]。

桄榔粉淀粉含量較高，占總桄榔粉的88.32%[4]，并且桄榔淀粉屬于一種高直鏈淀粉。淀粉質(zhì)食品在儲(chǔ)藏過程中發(fā)生的凝膠強(qiáng)度、黏稠度、透明度、硬度、口感、黏彈性等功能特性的變化與淀粉老化的動(dòng)態(tài)有著緊密的關(guān)系，老化會(huì)對(duì)淀粉質(zhì)食品的質(zhì)構(gòu)特征產(chǎn)生明顯的影響。淀粉老化是淀粉溶液或淀粉糊在較低溫度條件下放置一段時(shí)間后，其溶液或糊液濁度增加并有沉淀析出的現(xiàn)象[5]。其實(shí)質(zhì)是糊化后的淀粉分子從無(wú)序狀態(tài)向有序狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程[6]。由直鏈淀粉形成有序結(jié)晶的過程稱為短期老化，一般發(fā)生在糊化后的較短時(shí)間內(nèi)；由支鏈淀粉外側(cè)短鏈的重結(jié)晶所引起的老化稱為長(zhǎng)期老化，是一個(gè)相對(duì)遲緩的長(zhǎng)期過程[7]。老化常常描述的是淀粉無(wú)序大分子的重組，是淀粉顆粒天然結(jié)構(gòu)的重新組合，包含淀粉顆粒天然序列重組后形成的直鏈淀粉和直鏈淀粉分散體[8]。

桄榔淀粉的糊化特性、溶解性、持水性、膨脹度、熱力學(xué)特性、流變特性、晶體結(jié)構(gòu)和相對(duì)分子量分布已有研究報(bào)道[9-17]，而桄榔淀粉的老化特性研究還沒有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以桄榔提取出來的桄榔淀粉為材料，采用示差掃描量熱儀、X-射線衍射儀、低場(chǎng)核磁共振儀、質(zhì)構(gòu)儀、流變儀和掃描電鏡對(duì)桄榔淀粉的老化特性進(jìn)行了研究，探討形成老化桄榔淀粉的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桄榔粉：廣西龍州農(nóng)業(yè)推廣中心；纖維素酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；碳酸鈉、鹽酸（分析純）：廣西南寧沁田生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水真空泵（SHZ-Ⅲ型）：上海亞榮生化儀器廠；射線衍射儀（MiniFlex600X）：湖南弘林科學(xué)儀器有限公司；掃描電鏡（Phenom）：復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司；流變儀（HAAKE MARS40）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；質(zhì)構(gòu)儀（TA-XT plus）：英國(guó)StableMicvo 公司；示差熱量分析儀（DSC200PC）：德國(guó)耐馳儀器公司；低場(chǎng)核磁共振儀（MR1510100045）：上海紐邁電子科技有限公司；超低溫冰箱（Forma 900 Series）：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桄榔淀粉的制備

稱量桄榔粉于燒杯中，加入30 倍水浸泡24 h，過120 目篩，用 0.5%的 Na2CO3按照 1∶3（質(zhì)量體積比）浸提18 h，過濾，重復(fù)4 次。濾渣為米黃色粉末，用1 mol/L 鹽酸調(diào) pH 值為 5，按照 1∶6（質(zhì)量體積比）加入纖維素酶，在50 ℃水浴鍋中酶解1 h 后，用1 mol/L鹽酸中和，再經(jīng)水洗、靜置、過濾、干燥、過篩（120 目），得到桄榔淀粉[17-18]。經(jīng)測(cè)定桄榔淀粉中直鏈淀粉含量[19]為（60.07±2.92）%，水分含量為（10.98±0.06）%，粗脂肪含量為（0.19±0.04）%，粗蛋白含量為（1.85±0.35）%，粗纖維含量為（0.90±0.14）%。

測(cè)定方法為，粗蛋白含量的測(cè)定：GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；粗脂肪含量的測(cè)定：GB 5009.6-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》；粗纖維含量的測(cè)定：GB/T 5009.10-2003《植物類食品中粗纖維的測(cè)定》；水分含量的測(cè)定：GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》。

1.3.2 老化桄榔淀粉的制備

將桄榔淀粉樣品與蒸餾水按1∶4（質(zhì)量體積比）配制成淀粉溶液，于23 ℃下在磁力攪拌器上攪拌2 h，使兩者充分混合。將混合液沸水浴糊化30 min，并不停攪拌直至完全糊化。然后分裝在大小相同的培養(yǎng)皿中，并儲(chǔ)存在 4 ℃下進(jìn)行老化。分別在 0、1、3、5、7 d 測(cè)定質(zhì)構(gòu)和核磁，之后將老化樣品放于-80 ℃超低溫冰箱中凍藏，然后真空冷凍干燥，凍干樣品粉碎后過120 目篩[20]，用于電鏡和 X-射線（X-ray diffractometer，XRD）衍射分析。

1.3.3 顆粒形貌觀察

將導(dǎo)電膠貼在掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscopy，SEM）的樣品臺(tái)上，然后用專用鑷子夾取少量真空冷凍干燥的樣品，慢慢的在雙面膠上涂抹均勻，吹掃多余的淀粉樣品，采用離子濺射法在樣品表面噴金。然后將樣品臺(tái)用鑷子取出，放入掃描電子顯微鏡中進(jìn)行仔細(xì)觀察，拍攝具有代表性的淀粉顆粒形貌[21]。

1.3.4 示差掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）測(cè)定

將粉末狀的老化不同天數(shù)的桄榔淀粉和蒸餾水按 1∶4（質(zhì)量比）置于 DSC 坩堝中，密封，放在 25 ℃平衡2 h。然后放入示差掃描量熱儀中以10 ℃/min 掃描速率從20 ℃升溫到150 ℃，以空坩堝作空白對(duì)比，以氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為50 mL/min，測(cè)定老化樣品的DSC 曲線。結(jié)果由 Proteus Analysis4.8 或者 origin9.1 軟件進(jìn)行分析、記錄和計(jì)算起始老化溫度（onset temperature，T0）、峰值老化溫度（peak temperature，Tp）、終止溫度（conclusion temperature，Tc）及老化熱焓值（retrogradation enthalpy，ΔH）[22]。每個(gè)樣品測(cè)試 3 次，取平均值。

1.3.5 X 射線衍射

采用X 射線衍射儀測(cè)定老化桄榔淀粉樣品的結(jié)晶度，樣品脫水干燥放置干燥器中1 周。衍射條件為：電壓 40 kV，電流 15 mA，掃描范圍為 2°～50°（2θ），掃描速率為2°/min。通過軟件MDI jade6 分析X 射線衍射圖譜并且計(jì)算老化桄榔淀粉的相對(duì)結(jié)晶度[23]。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

在特定的時(shí)間點(diǎn)取出凝膠狀的老化樣品，然后切割成大小相同的方塊測(cè)其質(zhì)構(gòu)。選用質(zhì)地剖析（texture profile analysis，TPA）模式（P2.5 探頭）進(jìn)行壓縮試驗(yàn)，測(cè)定前下降的速度為1.0 mm/s，測(cè)定速度為5.0 mm/s，測(cè)定后上升的速度為5.0 mm/s，觸發(fā)力為5 g，形變量比為75%。測(cè)定硬度的特征值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過質(zhì)構(gòu)分析軟件讀取[24]。

1.3.7 低場(chǎng)核磁共振

將不同時(shí)間點(diǎn)的凝膠狀老化樣品取出切割、稱量，利用核磁共振波譜分析軟件中的自由感應(yīng)衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）脈沖序列尋找中心頻率及硬脈沖脈寬，將樣品慢慢放入永磁體磁場(chǎng)中心射頻線圈位置并進(jìn)行信號(hào)采集，利用硬脈沖回波序列（carrpurcell-meiboom-gill sequence，CPMG）測(cè)定老化樣品的T2 弛豫時(shí)間，將重復(fù)5 次采集生成的自旋回波對(duì)應(yīng)的時(shí)段信號(hào)值與峰值計(jì)算平均值，并將平均值導(dǎo)入反演軟件進(jìn)行反演運(yùn)算得到反演圖譜[25]。

CPMG 脈沖序列的參數(shù)設(shè)置為：主頻SF1=12 MHz，偏移頻率 O1=215.827 kHz，90°脈沖射頻脈寬 P1=8μs，180°脈沖射頻脈寬 P2=11 μs，信號(hào)采樣點(diǎn)數(shù) TD=12 632，重復(fù)采樣等待時(shí)間TW=5 000 ms，重復(fù)采樣次數(shù)NS=2，回波個(gè)數(shù) NECH=7 000。

1.3.8 流變測(cè)定

將樣品與蒸餾水按照1∶4（質(zhì)量體積比）配制成乳液，置于磁力攪拌器上攪拌5 min，然后沸水糊化10 min[26]。在 1 000 μm 的間隙平板（60 mm）進(jìn)行流變學(xué)測(cè)量。將硅油添加到樣品的暴露表面以防止在測(cè)定過程中的水分蒸發(fā)。在測(cè)量之前，將樣品保持3 min 以平衡應(yīng)力和溫度。然后在老化期間以6.28 rad/s 的恒定頻率和3%的恒定應(yīng)力監(jiān)測(cè)儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G″）值[27]。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件和Microsoft Excel 2016 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和顯著性差異分析，利用Origin9.1 制圖軟件對(duì)數(shù)據(jù)作圖，各試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 微觀形貌分析

天然桄榔淀粉（圖1A）和桄榔淀粉凝膠老化（圖1B～圖1F）的掃描電鏡圖見圖1。

圖1 桄榔淀粉和老化桄榔淀粉掃描電鏡圖Fig.1 SEM of Arenga pinnata starch and retrograded starch

由圖1 可看出，桄榔淀粉的顆粒形狀大部分呈現(xiàn)橢圓形結(jié)構(gòu)，整個(gè)表面平整，無(wú)凹陷和棱角，顆粒完整。而糊化后的桄榔淀粉失去了原桄榔淀粉的橢圓形顆粒結(jié)構(gòu)，凍干后出現(xiàn)了許多孔洞，形成了不規(guī)則的網(wǎng)狀形狀（圖1B），這是因?yàn)樵诤^程中，淀粉顆粒膨脹破裂直鏈淀粉和支鏈淀粉分子均充分展開并相互纏繞形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；并且從圖1B、圖1C、圖1D、圖1E、圖1F 可以看出，隨著桄榔淀粉凝膠的老化，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的壁厚呈現(xiàn)逐漸變厚的趨勢(shì)，網(wǎng)狀也在逐漸變小。這是因?yàn)樵诶匣^程中，淀粉分子鏈發(fā)生重結(jié)晶，導(dǎo)致桄榔淀粉凝膠脫水縮合；同時(shí)，可能殘余的淀粉顆粒存在，在掃描電子顯微鏡圖中就呈現(xiàn)為不規(guī)則顆粒結(jié)構(gòu)的形成[28-29]。

2.2 DSC分析

桄榔淀粉凝膠在老化過程中，淀粉分子從無(wú)序轉(zhuǎn)化為有序，重排形成重結(jié)晶，因此要破壞這些新的晶體結(jié)構(gòu)，使淀粉分子再次熔融需要外加能量[30]。老化后的淀粉凝膠在DSC 分析中出現(xiàn)吸熱峰，其大小隨老化程度的增加而增大。老化焓值越大說明重結(jié)晶越多，即老化程度越嚴(yán)重[20]。因此，老化焓值可作為衡量桄榔淀粉凝膠老化程度的指標(biāo)。桄榔淀粉凝膠在4 ℃溫度條件下分別儲(chǔ)藏 0、1、3、5、7 d 后，用示差熱量分析儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，并分析其在貯藏期間的熱力學(xué)性質(zhì)的變化，結(jié)果見表1。

表1 桄榔淀粉凝膠不同老化時(shí)間的DSC 參數(shù)Table 1 DSC parameters of retrograded Arenga pinnata starch gel

從表1 可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，桄榔淀粉凝膠的起始溫度和終止溫度逐漸增加，同時(shí)其老化焓值也逐漸增加，說明桄榔淀粉凝膠的老化程度逐漸增大。從老化的第3 天開始，桄榔淀粉凝膠的熱焓值增加緩慢。因?yàn)榈矸劾匣梢苑譃閮蓚€(gè)階段：短期老化和長(zhǎng)期老化[31]。桄榔淀粉中的直鏈淀粉含量約為60.07%，因此，儲(chǔ)藏初始階段桄榔淀粉老化焓值增大可能原因是桄榔淀粉中的直鏈淀粉含量相對(duì)較高。

2.3 XRD分析

淀粉是一種天然多晶聚合物，任何淀粉顆粒物態(tài)組成都可以看成是由亞微晶、微晶和非晶態(tài)三者中的1 種、2 種或3 種結(jié)構(gòu)組合而成[32]。結(jié)晶束間區(qū)域分子排列無(wú)規(guī)律性，較雜亂為無(wú)定形區(qū)。支鏈淀粉分子很大，穿過多個(gè)結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)，在淀粉顆粒結(jié)構(gòu)中起到骨架作用[33]。因?yàn)榈矸垲w粒包括結(jié)晶結(jié)構(gòu)和非晶結(jié)構(gòu)。在淀粉受熱溶脹、機(jī)械剪切、化學(xué)改性等物理、化學(xué)或生物處理過程中，淀粉顆粒的結(jié)晶結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生輕微變化，使原淀粉的結(jié)晶度下降，甚至變?yōu)榱慵唇Y(jié)晶結(jié)構(gòu)全部轉(zhuǎn)為無(wú)定型結(jié)構(gòu)[34]。

天然桄榔淀粉在 2θ 為 5.85°、15.07°、17.27°、23.30°、26.49°有明顯的吸收峰，結(jié)晶結(jié)構(gòu)為C 型[17]。桄榔淀粉在過量水分充分糊化處理后，衍射峰特別微弱并且晶體結(jié)構(gòu)幾乎完全消失，這是由于桄榔淀粉糊化后淀粉分子流動(dòng)性增大，難以形成較大或較多的晶體結(jié)構(gòu)。糊化后的桄榔淀粉在4 ℃條件下存放，會(huì)產(chǎn)生自組織的現(xiàn)象重新形成結(jié)晶[35]。老化桄榔淀粉X 射線衍射曲線見圖2。

由圖2 可知，桄榔淀粉糊化后在4 ℃分別存放0、1、3、5、7 d 后只有在 17°左右出現(xiàn)微弱的結(jié)晶峰。這種結(jié)晶度只有微小回升，說明結(jié)晶促進(jìn)了桄榔老化淀粉的形成但并不是主要原因[35]。

圖2 老化桄榔淀粉X 射線衍射曲線Fig.2 Retrograded Arenga pinnata starch X-ray diffraction curve

2.4 質(zhì)構(gòu)分析

老化不同天數(shù)的桄榔淀粉凝膠TPA 硬度結(jié)果見表2。

表2 老化不同天數(shù)的桄榔淀粉凝膠TPA 硬度Table 2 TPA hardness values of retrograded Arenga pinnata starch gel

淀粉凝膠的性質(zhì)與淀粉的顆粒形狀可能有關(guān)系，淀粉凝膠根據(jù)糊化溫度和時(shí)間的不同形成的凝膠結(jié)構(gòu)可能也不同[24]。所以桄榔淀粉分子經(jīng)完全糊化后，桄榔直鏈淀粉和支鏈淀粉分子在冷卻過程中均充分展開并且相互纏繞形成凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。硬度是指樣品第一次加壓時(shí)所出現(xiàn)的最大峰值高度[36]。由表2可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，桄榔淀粉老化的程度增加，凝膠硬度也隨之增大。

2.5 核磁共振分析

老化不同時(shí)間的桄榔淀粉凝膠的橫向弛豫時(shí)間反演圖見圖3。

脈沖核磁共振利用液體和固體在脈沖下信號(hào)的不同可以測(cè)定體系中固形物含量。淀粉體系的老化使淀粉分子逐步排列有序，處于結(jié)晶態(tài)的質(zhì)子由于被其他分子鏈約束，因而只能在小尺寸范圍內(nèi)振動(dòng)和遷移，因此體系中固形物的含量在逐步增加[37]。從圖3 可以看出，水分流動(dòng)性隨著桄榔淀粉老化時(shí)間的延長(zhǎng)變得緩慢，其持水性降低，結(jié)合水的能力變得較強(qiáng)，回生之后，結(jié)晶凝聚暴露在外面的有效羥基比較少，就其內(nèi)部而言，老化桄榔淀粉中的水分流動(dòng)性很低[38]。

圖3 老化不同時(shí)間的桄榔淀粉凝膠的橫向弛豫時(shí)間T2 反演圖Fig.3 The transverse relaxation time T2 inversion spectrum of retrograded Arenga pinnata starch for different days

2.6 流變分析

桄榔淀粉凝膠貯能模量和損耗模量隨時(shí)間變化趨勢(shì)見圖4。

圖4 桄榔淀粉凝膠貯能模量和損耗模量隨時(shí)間變化曲線Fig.4 Curve of storage modulus and loss modulus of retrograded Arenga pinnata starch

糊凝膠體系的動(dòng)態(tài)黏彈性與其實(shí)際應(yīng)用性能有直接聯(lián)系。貯能模量（G′）代表能量貯存并且可恢復(fù)的彈性性質(zhì)。當(dāng)物料受到力作用時(shí)，其應(yīng)力能量在變形中暫時(shí)儲(chǔ)存，之后可以恢復(fù)；G′越大，物料受到力時(shí)的變形程度就越小，表明物料的彈性越大[39]。損耗模量（G″）代表能量消散的黏性性質(zhì)。它表示阻礙物料流動(dòng)的特性，是物料初始流動(dòng)所需的不可逆損耗能量，已轉(zhuǎn)變?yōu)榧羟袩幔籊″越大，表明受到力的作用時(shí)，物料越不容易流動(dòng)，表明物料的黏性越大[26]。

由圖4 可見，老化桄榔淀粉的G′遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于G″，因此tanδ 小于1，G′與G″隨時(shí)間增加而呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，表明為一種典型的弱凝膠動(dòng)態(tài)流變學(xué)譜圖。Tanδ是G″與G′的比值，tanδ 越大，表明體系的黏性比例越大，流動(dòng)性越強(qiáng)，反之則彈性比例較大。表明樣品具有溶膠（有液態(tài)的流動(dòng)性和黏性）和凝膠（固體狀態(tài)下呈現(xiàn)有彈性）之間的力學(xué)物性，且彈性性質(zhì)占主導(dǎo)地位，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，桄榔老化淀粉的彈性逐漸增加。直鏈淀粉部分鏈段和支鏈淀粉的分支點(diǎn)構(gòu)成淀粉粒的無(wú)定形區(qū)，這說明淀粉粒有彈性形變的現(xiàn)象[40]。

3 結(jié)論

桄榔淀粉糊化后，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)被破壞，桄榔淀粉凝膠在老化過程中水分流動(dòng)性降低，凝膠硬度增加，分子重排形成微弱結(jié)晶。桄榔淀粉凝膠在老化過程形成的晶體不同于原淀粉晶體，與桄榔原淀粉的相變吸熱峰相比，老化淀粉的起始溫度升高，吸熱焓增大，表明較原淀粉老化后的桄榔淀粉形成了更致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的晶體結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性增大。但是XRD結(jié)果表明桄榔淀粉凝膠僅形成微弱重結(jié)晶，說明了結(jié)晶不是桄榔淀粉老化的主要原因。低場(chǎng)核磁共振說明水分流動(dòng)性隨著淀粉老化時(shí)間的延長(zhǎng)變得緩慢，其持水性降低，老化淀粉中的水分流動(dòng)性很低。桄榔淀粉分子經(jīng)完全糊化后，直鏈淀粉和支鏈淀粉分子在冷卻過程中均充分展開并相互纏繞形成凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，桄榔淀粉老化的程度增加，凝膠硬度也隨之增大。桄榔淀粉的老化主要是因?yàn)殍胬频矸鄯肿拥哪鬯?，微弱重結(jié)晶促進(jìn)了淀粉的老化。