陳錦萍，何海超，蔡航，周聰聰，馮雅雯，馬寅正，何小穩(wěn)，2，*

（1.海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?71199；2.河北醫(yī)科大學(xué)，河北石家莊050017）

黃皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels]是蕓香科黃皮屬植物，廣泛分布于東半球熱帶，亞熱帶地區(qū)，在我國集中于海南、廣東、廣西等省區(qū)[1]。黃皮富含揮發(fā)油類，生物堿類，香豆素類，黃酮類等多種化學(xué)成分，具有行氣止痛，消食化痰，解毒散結(jié)等功效[2]?？紤]到近年來以假絲酵母菌（Candida，C.）為代表的臨床真菌感染的發(fā)病率和死亡率逐年上升[3-5]，且目前主要抗真菌藥物多數(shù)具有明顯的毒副作用，耐藥性日趨嚴(yán)重[6]，因此尋找安全有效的新型抗真菌藥物迫在眉睫，從天然產(chǎn)物中特別是植物揮發(fā)油中尋求抗真菌藥物成為目前研究的熱點(diǎn)[7-8]。已有研究[9-12]發(fā)現(xiàn)黃皮葉揮發(fā)油主要成分為倍半萜及其含氧衍生物，筆者未見對(duì)黃皮樹皮揮發(fā)油成分的分析報(bào)道，且黃皮的葉及樹皮均具有抗菌消炎、抗滴蟲、抗氧化等多種生物活性[13-15]，但其揮發(fā)油是否具有抗假絲酵母菌活性鮮見報(bào)道。

本研究擬采用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）對(duì)不同產(chǎn)地的黃皮葉和樹皮的揮發(fā)油進(jìn)行分析與鑒定，比較其成分及含量的差異，再通過聚類分析對(duì)揮發(fā)油分類比較，并采用紙片法對(duì)其抗假絲酵母菌活性進(jìn)行初步研究，旨在闡明黃皮葉及樹皮的揮發(fā)油抗假絲酵母菌活性與成分、含量的相關(guān)性，為抗真菌新藥的研究開發(fā)尋找高效、廣譜、低毒、價(jià)廉的生物資源提供理論及試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GC/MS-QP2010 Plus 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；Tanon-4100 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)：上海天龍科技有限公司；HC-1000YZ 高速多功能粉碎機(jī)：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；AL104 電子天平：梅特勒—托利多儀器上海有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 材料

黃皮葉及樹皮：釆自海南省海口市，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)田建平副教授鑒定為蕓香科黃皮屬植物黃皮Clausena lansium（Lour.）Skeels（產(chǎn)地及采集時(shí)間見表1），標(biāo)本保存于海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。正構(gòu)烷烴混標(biāo)C8～C40 500 mg/L 于正己烷：美國o2si，編號(hào)CDGG-115320-05-1；氟康唑：上海源葉生物科技有限公司；mueller hinton（MH）瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂粉：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖：天津市福晨化學(xué)試劑廠；正己烷（色譜純，≥98.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

表1 海南產(chǎn)黃皮葉和樹皮的樣品來源Table 1 Sources of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

1.3 菌株

質(zhì)控菌株：白假絲酵母菌（C.albicans，Ca）ATCC 10231、近平滑假絲酵母菌（C.parapsilosis，Cp）ATCC 22019：廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；克柔假絲酵母菌（C.krusei，Ck）ATCC 6258：溫州市康泰生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株：熱帶假絲酵母菌（C.tropical，Ct）CMCC（F）c2f、光滑假絲酵母菌（C.glabrata，Cg）CMCC（F）c6e：中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；臨床分離菌株：Ca27（耐藥株）、Ca53，經(jīng) ITS 基因序列測(cè)定確定。將菌株在改良沙保羅氏瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA）連續(xù)移種2 次，以保證其純度和活力。

2 方法

2.1 GC-MS條件

ZB-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫采用升溫程序：初始柱溫60 ℃保持5 min，10 ℃/min 升至 120 ℃，2 ℃/min 升至 170 ℃，10 ℃/min 升至 210 ℃，保持10 min；載氣為氦氣，柱流量1.0 mL/min；吹掃流量 3.0 mL/min；進(jìn)樣溫度 250 ℃，進(jìn)樣量 1.0 μL。EI 源，離子源溫度250 ℃；接口溫度280 ℃；溶劑延遲時(shí)間2.0 min；檢測(cè)器電壓 0.86 kv；質(zhì)量掃描時(shí)間：3.00 min ～50.00 min，掃描范圍 50 m/z～500 m/z；質(zhì)譜譜庫：NIST08和NIST08s。

2.2 RI值測(cè)定

取正構(gòu)烷烴混標(biāo)按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄各正構(gòu)烷烴保留時(shí)間，采用線性升溫公式計(jì)算各組分的RI 值：RI=100n+100（tx-tn）/（tn+1-tn），其中tx，tn和tn+1分別為被分析組分和碳原子數(shù)處于n 和n+1 之間的正烷烴（tn＜tx＜tn+1）的流出峰的保留時(shí)間。

2.3 黃皮葉及樹皮揮發(fā)油的提取與分析

黃皮葉和樹皮陰干，粉碎，過篩，稱取適量干燥粉末，物料比 1∶8（g/mL），浸泡 1 h，采用揮發(fā)油測(cè)定器提取2.5 h～3.0 h，收集頂部揮發(fā)油，觀察黃皮葉及樹皮揮發(fā)油的顏色并計(jì)算得油率。取10 μL 揮發(fā)油溶于1.0 mL色譜純正己烷中，進(jìn)樣GC-MS，NIST 譜庫檢索結(jié)合RI定性鑒定，峰面積歸一法分析含量。剩余揮發(fā)油密封于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 抑菌試驗(yàn)

采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CCLS） 制定的紙片法（M44-A2）進(jìn)行抑菌圈的測(cè)定，經(jīng)SDA 次代培養(yǎng)的新鮮菌落，挑取1 mm 大小的菌落于5.0 mL 的生理鹽水中，調(diào)節(jié)菌液濁度為0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，約1×106CFU/mL～5×106CFU/mL。調(diào)好濁度的菌懸液均勻地涂布在MH瓊脂平板上，放置3 min～5 min，不超過15 min，使用無菌鑷子放上紙片，分別加入黃皮葉，樹皮揮發(fā)油及陽性對(duì)照（2.5 mg/mL 的氟康唑溶液）各 10 μL。Ca、Ct 于35 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 24 h，Cg、Ck、Cp 培養(yǎng) 48 h，觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑，每次試驗(yàn)重復(fù)操作3 次，取其平均值，通過抑菌圈的大小來判斷揮發(fā)油對(duì)各種假絲酵母菌的敏感程度。結(jié)果判讀：以氟康唑（25 μg）為標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑≥19 mm 為敏感，15 mm～18 mm 為劑量依賴性敏感，≤14 mm 為耐藥，待測(cè)揮發(fā)油的抑菌圈直徑＞20 mm 極敏感，15 mm～20 mm 為高度敏感，10 mm～14 mm 為中度敏感，＜10 mm 表示低敏感，0 為不敏感。

3 結(jié)果

3.1 黃皮葉及樹皮揮發(fā)油的提取與分析結(jié)果

按照“2.3”的方法提取得到的黃皮葉及樹皮揮發(fā)油都具有特殊性氣味，其顏色及得油率詳見表2。

表2 海南不同產(chǎn)地黃皮葉和樹皮揮發(fā)油的提取結(jié)果Table 2 Extraction results of the essential oils of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

結(jié)果表明6 種揮發(fā)油的顏色和得油率均存在差異，這跟其采摘的部位，采摘產(chǎn)地及采摘時(shí)間有關(guān)，其成分的具體差異還需進(jìn)行GC-MS 分析，因此進(jìn)樣GC-MS 分析揮發(fā)油的成分及含量，比較其差異，GC-MS總離子流圖見圖1，成分及含量的分析結(jié)果見表3。

圖1 海南不同產(chǎn)地黃皮葉和樹皮揮發(fā)油的GC-MS 總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS chromatograms of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

表3 海南不同產(chǎn)地黃皮葉和樹皮揮發(fā)油成分及相對(duì)含量Table 3 Chemical components identified in the essential oil of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

續(xù)表3 海南不同產(chǎn)地黃皮葉和樹皮揮發(fā)油成分及相對(duì)含量Continue table 3 Chemical components identified in the essential oil of Clausena lansium leaves and barks in Hainan

由表3 數(shù)據(jù)可見，從黃皮葉L1～L4 揮發(fā)油中分別鑒定了56、49、52、54 種成分，分別占揮發(fā)油總量的97.86%、97.82%、96.42%、96.87%，樹皮 B1、B2 揮發(fā)油中分別鑒定了63、60 種成分，分別占總量的92.35%、92.54%。這些成分有單萜、倍半萜、醇、酯等，其中含量最高的為倍半萜，但成分和含量差異較大。L1 中主要成分是石竹烯（20.90%）、β-紅沒藥烯（17.07%）、β-倍半水芹烯（15.71 %）、黑蟻素（13.44 %）、氧化石竹烯（8.39%）；L2 的主要成分為檀香醇（27.47%）、氧化石竹烯（9.91%）、石竹烯（9.21%）、順式-α-檀香醇（7.81 %）；L3 的主要成分有檀香醇（29.10%）、氧化石竹烯（10.90%）、石竹烯（8.74%）、β-紅沒藥烯（8.50%）；L4 的主要成分包括石竹烯（20.3%）、檀香醇（16.9%）、氧化石竹烯（7.88 %）；B1 的主要成分包括檀香醇（31.90%）、順式-α-檀香（19.07%）、α-檀香醇（9.51%）、β-紅沒藥醇（3.41%）、α-紅沒藥醇（3.26%）；B2 的主要成分是檀香醇（29.35%）、順式-α-檀香（14.56%）、α-檀香醇（13.18%）。

3.2 聚類分析

通過GC-MS 的分析結(jié)果可以看出黃皮葉L1，L2，L3，L4 和樹皮B1，B2 的揮發(fā)油的主要成分及含量存在一定的差異性，為更好地區(qū)分不同產(chǎn)地黃皮葉及樹皮揮發(fā)油成分及含量的差異，且與之后的抑菌效果相關(guān)聯(lián)，本研究根據(jù)揮發(fā)油的主要化學(xué)成分和含量采用SPSS 17.0 對(duì)6 種揮發(fā)油進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖2。

圖2 黃皮葉和樹皮揮發(fā)油基于化學(xué)成分及含量的聚類圖Fig.2 Dendrograms based on the chemical components and contents of Clausena lansium leaves and barks

從圖2 中可以看出，首先所有揮發(fā)油被分為2 類：L2、L3、L4、B1、B2 一類，L1 一類，說明 L1 與其他揮發(fā)油差異最大，最終將其分為3 類，其中化學(xué)型Ⅰ：L2、L3、L4，為檀香醇和石竹烯型，該類中有均為黃皮葉；化學(xué)型Ⅱ：B1、B2，為檀香醇和順式-α-檀香醇型，均為黃皮樹皮，說明黃皮葉和樹皮的揮發(fā)油成分及含量具有一定的差異，推測(cè)這與其部位不同有關(guān)；化學(xué)型Ⅲ：L1，石竹烯和β-紅沒藥烯型，3 種化學(xué)型的主要成分及含量見表4。

3.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

按照“2.4”的方法所得結(jié)果見表5。

由表 5 可知，黃皮葉揮發(fā)油（L1～L4）均具有較強(qiáng)的抑菌活性，其中L1 對(duì)所有受試菌均表現(xiàn)較好的抑菌效果，抑菌圈的直徑范圍為9.3 mm～14.2 mm，為低敏感到中度敏感，且對(duì)Ca 27 耐藥菌也具有一定的抑菌作用；L2、L3、L4 則僅對(duì) Ck、Ct、Cg 3 種菌株有抑菌活性，抑菌圈的直徑范圍為8.1 mm～12.2 mm，為低敏感到中度敏感，對(duì)Ca、Cp 不敏感，而黃皮樹皮揮發(fā)油則對(duì)受試菌均無抑菌效果。

表4 3 種化學(xué)型的主要揮發(fā)性成分的差異Table 4 Variation of some important volatile components of Clausena lansium in three chemotypes

表5 黃皮葉和樹皮揮發(fā)油的抑菌試驗(yàn)結(jié)果（）Table 5 Antifungal activity of essential oil from Clausena lansium leaves and barks（）

表5 黃皮葉和樹皮揮發(fā)油的抑菌試驗(yàn)結(jié)果（）Table 5 Antifungal activity of essential oil from Clausena lansium leaves and barks（）

假絲酵母菌種類抑菌圈/mm L1 L2 L3 L4 B1 B2 氟康唑Ca ATCC 10231 9.3±0.12 0 0 0 0 0 31.7±0.06 Cp ATCC 22019 10.0±0.05 0 0 0 0 0 27.1±0.07 Ck ATCC 6258 13.9±0.03 11.8±0.05 9.9±0.11 10.0±0.04 0 0 15.4±0.06 Ct CMCC（F）c2f 9.6±0.02 8.5±0.11 8.1±0.06 8.2±0.05 0 0 31.3±0.02 Cg CMCC（F）c6e 14.2±0.08 11.8±0.10 12.2±0.12 9.7±0.09 0 0 23.6±0.06 Ca 27 9.7±0.13 0 0 0 0 0 0 Ca 53 10.4±0.09 0 0 0 0 0 30.1±0.01

4 討論與結(jié)論

4.1 不同產(chǎn)地黃皮葉及樹皮揮發(fā)油成分和含量的差異

在以往研究中，羅輝等[9]從廣東湛江產(chǎn)黃皮葉揮發(fā)油中鑒定出24 個(gè)成分，主要成分為順-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯-3 醇即橙花叔醇（16.68%）、β-石竹烯（11.78%）；Zhao J 等[10]從海南昌江產(chǎn)黃皮葉揮發(fā)油中分析鑒定了32 個(gè)成分，主要成分為β-檀香醇（35.2%）、紅沒藥醇（13.7%）；Pino J 等[11]從古巴產(chǎn)黃皮葉揮發(fā)油中鑒定70 個(gè)成分，主要成分為石竹烯氧化物（16.8%）和（Z）-α-檀香醇（11.7%）；唐冰等[12]從廣西產(chǎn)黃皮葉揮發(fā)油中共鑒定了44 個(gè)成分，主要成分為2，6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯即 α-香檸檬烯（22.25 %）、石竹烯（14.29%）、（S）-1-甲基-4-（5-甲基-1-亞甲基-4-己烯基）-環(huán)己烯即紅沒藥烯（12.35%）、β-水芹烯（9.56%）等。本研究從海南黃皮葉揮發(fā)油中鑒定出的總化學(xué)成分均為50 個(gè)左右，含量較高的成分有的和之前文獻(xiàn)報(bào)道的相似，例如石竹烯、檀香醇等，但主要成分及其含量仍存在一定的差異，這可能與黃皮所處地理位置，生長環(huán)境，采摘時(shí)間等不同有關(guān)。在以往文獻(xiàn)中筆者未見黃皮樹皮揮發(fā)油的研究報(bào)道，本研究分析鑒定了黃皮樹皮揮發(fā)油的主要成分均為檀香醇（31.90%，29.35 %）、順式-α-檀香（19.07%，14.56%）、α-檀香醇（9.51 %，13.18%），兩個(gè)產(chǎn)地差異不大。

4.2 黃皮葉及樹皮揮發(fā)油成分與抗假絲酵母菌活性的相關(guān)性研究

根據(jù)海南不同產(chǎn)地的黃皮葉及樹皮的揮發(fā)油成分及其抗假絲酵母菌活性的綜合分析，發(fā)現(xiàn)6 種揮發(fā)油的抑菌活性強(qiáng)弱與化學(xué)成分具有一定的關(guān)系，抑菌活性由強(qiáng)到弱為：化學(xué)型Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ?；瘜W(xué)型Ⅲ即L1 的抑菌作用最強(qiáng)，其中含有高含量的石竹烯、β-紅沒藥烯、β-倍半水芹烯和黑蟻素，化學(xué)型Ⅰ即 L2、L3、L4 的抑菌作用次之，其中含有高含量的檀香醇、石竹烯和氧化石竹烯，化學(xué)型Ⅱ即B1、B2 無抑菌作用，其中含有高含量的檀香醇、順式-α-檀香醇和α-檀香醇，化學(xué)型Ⅲ與其他兩種化學(xué)型主要成分的差異在于其含有高含量的β-倍半水芹烯和黑蟻素，由此推測(cè)β-倍半水芹烯和黑蟻素有可能具有較強(qiáng)的抗假絲酵母菌活性作用，而檀香醇類及石竹烯類化合物無抗假絲酵母菌作用或作用較弱，但是抗菌活性強(qiáng)弱可能并不完全取決于主要化學(xué)成分，其他含量較小的化學(xué)成分也可能具有抗菌活性或者不同成分具有協(xié)同作用，因此還需對(duì)含量較高的幾種成分單獨(dú)或者聯(lián)合進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以期進(jìn)一步闡明黃皮抗假絲酵母菌活性的作用及機(jī)制，為其開發(fā)成為新的高效、廣譜、低毒、價(jià)廉的抗真菌藥物提供依據(jù)。

總之，本研究采用GC-MS 分析檢測(cè)了海南不同產(chǎn)地的黃皮葉及樹皮的揮發(fā)油成分，并按照其成分及含量聚類分析為3 個(gè)化學(xué)型，與紙片法測(cè)得的對(duì)5 種假絲酵母菌的抑菌活性具有一定的相關(guān)性，這為進(jìn)一步研究海南產(chǎn)黃皮的抗真菌藥用價(jià)值提供了試驗(yàn)依據(jù)。