楊凱，Bazhanov Dmitry,2，李紅梅，李玲，李成云，李紀(jì)順，扈進(jìn)冬，楊合同，陳相峰

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生態(tài)研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103；2.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 272000；3.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014)

阿特拉津(2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪，Atraizne)是一種廣泛用于闊葉雜草和一些禾本科雜草防除的三嗪類(lèi)除草劑.由于玉米體內(nèi)具有相應(yīng)的解毒酶，對(duì)其具有很強(qiáng)的耐受能力，常用于玉米田雜草的防除[1].阿特拉津在土壤中半衰期較長(zhǎng)，易對(duì)小麥等后茬敏感作物產(chǎn)生藥害[2]，尤其是在小麥-夏玉米-小麥的輪作制度下，阿特拉津的應(yīng)用，殘留及其污染土壤的修復(fù)受到了人們的廣泛關(guān)注.

阿特拉津溶淋性好，遷移率高，持效期長(zhǎng)，已造成了許多國(guó)家的土壤、地表水和地下水污染[3].在我國(guó)，由于阿特拉津的廣泛使用及其水溶性強(qiáng)的特性，對(duì)于阿特拉津在水環(huán)境中的污染情況已有不少報(bào)道[4-6].土壤作為阿特拉津的重要儲(chǔ)存介質(zhì)，是將其傳輸給農(nóng)產(chǎn)品的重要媒介，土壤中阿特拉津的殘留直接影響著農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量及質(zhì)量.而阿特拉津是一種潛在的致癌物和內(nèi)分泌干擾物，且具有誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和減輕體重等慢性毒性，而有研究表明阿特拉津的脫烷基代謝產(chǎn)物的毒性與阿特拉津相當(dāng)或更大[7-8].因此，如何對(duì)阿特拉津污染土壤進(jìn)行有效修復(fù)，降低阿特拉津及其代謝產(chǎn)物在土壤中的殘留，減少阿特拉津及其代謝產(chǎn)物匯入水介質(zhì)的機(jī)會(huì)，從而減少其對(duì)人們帶來(lái)的潛在威脅，是科學(xué)研究者的目標(biāo).

目前，眾多科研人員致力于阿特拉津污染土壤的修復(fù)，嘗試了各種的生物降解方法，包括植物、真菌以及細(xì)菌等[9].本課題組前期也篩選分離了大量的阿特拉津降解菌，如假單胞菌、諾卡氏菌、土壤桿菌以及節(jié)桿菌等[10].但微生物-植物聯(lián)合對(duì)阿特拉津降解的報(bào)道較少，敏感作物小麥與微生物聯(lián)合對(duì)阿特拉津降解的研究也是鮮有報(bào)道，而關(guān)于降解菌對(duì)于阿特拉津主要降解產(chǎn)物殘留方面的研究則未見(jiàn)報(bào)道.本課題組前期研究表明，產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens)DnL1-1具有很好的阿特拉津降解能力，且能在作物根際有效定殖，并與小麥及紫花苜蓿聯(lián)合作用對(duì)阿特拉津具有很好的降解效果[11].

因此，本研究在前期基礎(chǔ)上研究考察了小麥對(duì)不同阿特拉津含量土壤中產(chǎn)脲節(jié)桿菌-DnL1-1種群分布的影響，DnL1-1-與小麥聯(lián)合對(duì)阿特拉津的降解效果以及對(duì)其降解產(chǎn)物的影響，以期為阿特拉津污染土壤的修復(fù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和植物 產(chǎn)脲節(jié)桿菌-DnL1-1菌株為本實(shí)驗(yàn)室從山東省玉米田土壤中分離并保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，登記編號(hào)為CGMCC 9667.試驗(yàn)所用植物為‘濟(jì)麥14號(hào)’，盆栽試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度晝25 ℃，夜18 ℃.

1.1.2 供試土壤 供試土壤于2017年5月17日采自山東省科學(xué)院生物中心試驗(yàn)基地，從未施用過(guò)阿特拉津，經(jīng)PCR檢測(cè)及富集培養(yǎng)，不含阿特拉津降解菌，自然風(fēng)干后，過(guò)篩(5 mm)備用.

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 試驗(yàn)使用SM及SMY培養(yǎng)基[10].SM培養(yǎng)基：0.5 g K2HPO4、0.2 g MgSO4· 7H2O、0.1 g NaCl、0.02 g CaCl2、2 g 葡萄糖、10 mL阿特拉津原液(1 mL 吐溫-80、5 g 阿特拉津原藥、100 mL蒸餾水),5 mL ZnFe-citrate 原液(0.04 g ZnSO4· 7H2O、0.4 g FeSO4· 7H2O、10 g檸檬酸鈉、100 mL蒸餾水，121°C滅菌30 min；SMY培養(yǎng):基SM培養(yǎng)基中加入0.1 g/L酵母粉；試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純；阿特拉津原藥，純度為97%，由山東省濰坊科賽基農(nóng)化工有限公司提供；5 mmol/L KH2PO4溶液(0.68 g KH2PO4、1000 mL蒸餾水)，阿特拉津原液(1 mL 吐溫-80、5 g 阿特拉津原藥、100 mL蒸餾水).

1.2 方法

1.2.1 接種液制備 將產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1菌種活化后，用接種環(huán)挑取單菌落接種于50 mL液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)24 h，之后按照不同比例稀釋制成菌懸液，備用.

1.2.2 小麥-產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1對(duì)不同濃度阿特拉津的降解影響 試驗(yàn)用容器為500 mL的塑料盆，每盆中添加供試土壤300 g，每盆加70 mL 5 mmol/L KH2PO4溶液，或阿特拉津質(zhì)量濃度為25、2、0.5 μg/mL的5 mmol/L KH2PO4溶液.將催芽后的小麥種子分別在不同稀釋倍數(shù)的菌懸液中浸種1 h，得到不同濃度的接種種子.選取長(zhǎng)勢(shì)一致、均勻飽滿(mǎn)的小麥種子種植于盆內(nèi)，非浸種的對(duì)照種子同樣處理.設(shè)置3種阿特拉津添加濃度的土壤：1 750，140，35 μg/盆.對(duì)不同濃度阿特拉津污染土壤進(jìn)行5種不同處理：①只種植小麥(小麥)；②種植小麥+接菌(小麥+DnL1-1)；③只接菌(DnL1-1)；④對(duì)照，無(wú)小麥，未接菌；⑤對(duì)照，未培養(yǎng).每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每盆種植小麥10粒.之后錫箔紙包盆，模擬土壤黑暗環(huán)境，置于托盤(pán)上，放于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間定期澆水.28 d后收集土壤，對(duì)產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1的定殖情況，以及土壤中阿特拉津及其降解產(chǎn)物的含量進(jìn)行測(cè)定.

1.2.3 接種濃度及定殖濃度檢測(cè) 浸種后，取10粒小麥種子于2 mL離心管中，分別用1 mL和2.5 mL SM鹽緩沖液洗滌，在渦旋振蕩器上最大速度震蕩10 min，懸液為0稀釋度，然后分別對(duì)懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)煌♂尪鹊木鷳乙和坎嫉絊M平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d，對(duì)平板上產(chǎn)生降解圈的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)[11-12].

28 d后收獲，取每個(gè)重復(fù)3根小麥主根系及1 g非根際土，分別用3.5 mL和10 mL SM鹽緩沖液洗滌，在渦旋振蕩器上最大速度震蕩10 min，懸液為0稀釋度，然后分別對(duì)懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)煌♂尪鹊木鷳乙和坎嫉絊M平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d，對(duì)平板上產(chǎn)生降解圈的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)[11-12].

1.2.4 樣品萃取與測(cè)定 土壤樣品的前處理使用渦旋振蕩的方法[13]；使用優(yōu)化后的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)土壤中萃取的阿特拉津及其降解產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)試分析，高效液相色譜-質(zhì)譜采用Utimate 3000 HPLC-Thermo TSQ-Vantage液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀[13]，色譜條件：柱溫28 ℃；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：A甲醇，B水(0.1%甲酸)；二元梯度分離，梯度順序：0～6 min，95%B；6～20 min，10%B；20～25 min，10%B；25～25.1 min，95%B；25.1～30 min，95%B.質(zhì)譜條件：電噴霧電離(ESI+)離子源；離子源溫度：350°C；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；脫溶劑溫度：350°C；脫溶劑氣(氮?dú)?氣壓：60 arb；輔助氣(氮?dú)?氣壓：30 arb；碰撞氣壓(氬氣)：0.2 Pa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式.ATZ及其降解產(chǎn)物的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)列于表1.阿特拉津及其降解產(chǎn)物羥基阿特拉津(HA)、脫乙基阿特拉津(DEA)、脫異丙基阿特拉津(DIA)和脫乙基脫異丙基阿特拉津(DAA)的標(biāo)準(zhǔn)品信息及測(cè)試分析方法參照文獻(xiàn)[14].

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行繪圖、分析和統(tǒng)計(jì)，并采用Duncan法(新復(fù)極差法)進(jìn)行顯著性分析.

表1 阿特拉津及其降解產(chǎn)物的質(zhì)譜優(yōu)化條件

*定量離子 Quantitative ion.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1在小麥根際的定殖效果

本試驗(yàn)對(duì)小麥與DnL1-1聯(lián)合修復(fù)阿特拉津過(guò)程中DnL1-1的定殖情況進(jìn)行了分析(表2).結(jié)果表明，不同接菌濃度處理，DnL1-1在小麥根際的定殖濃度均顯著高于在非根際土里的定殖濃度.隨著阿特拉津濃度的逐漸降低，小麥根際及非根際土中DnL1-1定殖濃度也逐漸降低，在阿特拉津濃度為5 833.3 μg/kg時(shí)定殖效果最好，而當(dāng)接菌濃度相同時(shí)，阿特拉津濃度為466.7 μg/kg的處理中DnL1-1在土壤及小麥根際的種群密度均顯著高于阿特拉津濃度為116.7 μg/kg的處理，說(shuō)明阿特拉津作為DnL1-1的唯一氮源，對(duì)DnL1-1種群密度的增長(zhǎng)影響顯著.種植小麥土壤中DnL1-1數(shù)量明顯高于未種植小麥土壤，均達(dá)到顯著水平，說(shuō)明小麥根系促進(jìn)了DnL1-1的增殖，其原因可能與小麥生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的根系分泌物有關(guān).

當(dāng)阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時(shí)，小麥并不能顯著促進(jìn)DnL1-1的種群生長(zhǎng)，但卻能在接種DnL1-1一定濃度的前提下顯著促進(jìn)阿特拉津的降解.根據(jù)前期研究[14]，在高濃度阿特拉津時(shí)，DnL1-1能快速建立種群，符合R策略的種群生長(zhǎng)規(guī)律，而在低濃度阿特拉津或無(wú)阿特拉津時(shí)，DnL1-1的種群密度不能維持增長(zhǎng)，甚至逐漸減退，說(shuō)明阿特拉津?qū)τ贒nL1-1的快速繁殖，建立優(yōu)勢(shì)種群密度是不可或缺的.因此，若要使DnL1-1形成優(yōu)勢(shì)種群，DnL1-1的接菌濃度必須足夠高，以建立不低于105CFU/g根重的根際種群密度以及不低于104CFU/g土重的土壤種群密度，如此才能更好地發(fā)揮DnL1-1優(yōu)勢(shì)菌群的作用.

2.2 小麥對(duì)產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1降解阿特拉津的影響

由圖1可知，經(jīng)HPLC-MS/MS分析，當(dāng)阿特拉津濃度為5 833.3、466.7、116.7 μg/kg時(shí)，28 d后，DnL1-1與小麥協(xié)同對(duì)阿特拉津的降解率依次為98.4%、92.0%、75.5%和84.5%，均顯著高于相應(yīng)的DnL1-1單獨(dú)使用對(duì)阿特拉津的降解率，降解率依次為93.0%、72.0%、64.3%和77.2%.隨著阿特拉津濃度的逐漸降低，DnL1-1與小麥協(xié)同對(duì)阿特拉津的降解效率隨之逐漸降低.阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時(shí)，接菌濃度5.7 lg CFU/粒時(shí)，DnL1-1與DnL1-1+小麥兩種處理對(duì)阿特拉津的降解率均顯著高于接菌濃度為4.9 lg CFU/粒的處理(圖1-C,1-D)，說(shuō)明小麥與DnL1-1協(xié)同明顯有助于阿特拉津降解率的提高，同時(shí)DnL1-1接菌濃度的高低，也直接影響著對(duì)阿特拉津的降解率.

表2 產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1在土壤及植物根際的種群密度

NA：未檢測(cè)到；大寫(xiě)字母表示每行之間的比較，小寫(xiě)字母表示每列之間的比較，字母不同表示差異顯著(P<0.05).

NA：Not analysed；The different capital letters mean significant difference in the same row (P<0.05)；The different small letters mean significant difference in the same column(P<0.05).

A～D：阿特拉津濃度依次為5 833.3、466.7、116.7、116.7 μg/kg；C、D：DnL1-1接菌濃度分別為4.9、5.7 lg CFU/粒；處理：未培養(yǎng)(C1)，未接菌，無(wú)植物(C2)，小麥(C3)，DnL1-1(I1)，DnL1-1+小麥(I2).The atrazine rate of A～D：5 833.3,466.7,116.7,116.7 μg/kg;The inoculum levels of C,D:4.9,5.7 lg CFU/seed;Treatments：not incubated pots (C1),not inoculated not planted pots (C2),wheat (C3),DnL1-1(I1),DnL1-1+wheat (I2)).圖1 產(chǎn)脲節(jié)桿菌DnL1-1對(duì)小麥根部阿特拉津的降解效果Figure 1 Root-associated degradation of atrazine by A.ureafaciens DnL1-1

2.3 小麥-DnL1-1協(xié)同對(duì)阿特拉津及其代謝產(chǎn)物殘留的影響

目前已有不少研究對(duì)土壤中阿特拉津的殘留進(jìn)行了報(bào)道[15-18]，其中于曉斌[17]對(duì)吉林省不同玉米種植區(qū)阿特拉津的殘留進(jìn)行檢測(cè)，其中阿特拉津最大殘留量變化范圍為169～295 μg/kg，該殘留量對(duì)水稻、小麥、大白菜、黃瓜、番茄等均是不安全的，對(duì)后茬作物的種植存在著較高風(fēng)險(xiǎn)[18].本實(shí)驗(yàn)室在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇阿特拉津濃度為116.7 μg/kg，DnL1-1接菌濃度為5.7 lg CFU/粒時(shí)對(duì)阿特拉津及其降解產(chǎn)物的殘留積累量進(jìn)行分析.由表3可知，未接菌、無(wú)植物的處理對(duì)阿特拉津的降解率可達(dá)67.9%.對(duì)阿特拉津降解產(chǎn)物的分析結(jié)果顯示DEA是阿特拉津的主要代謝產(chǎn)物，HA、DIA、DAA則為次要代謝產(chǎn)物(圖2).小麥與DnL1-1協(xié)同對(duì)阿特拉津的降解率可達(dá)84.5%，與未接菌、無(wú)植物的對(duì)照相比有效減少了其降解產(chǎn)物DEA、DAA、HA和DIA(61.6%、52.2%、9.7%和24.4%).與單獨(dú)接菌DnL1-1的處理相比，DEA、DAA和DIA的積累量則減少46.3%、49.2%和15%，差異顯著，而HA的積累量則變化不大.未接菌小麥處理與對(duì)照相比，阿特拉津降解產(chǎn)物DEA、DAA和DIA的殘留積累量減少50.0%、59.7%和20.0%.在未接菌+無(wú)植物及未接菌+小麥的處理中，阿特拉津及其降解產(chǎn)物的總摩爾質(zhì)量分別為0.07、0.04 μmol/kg，是空白土壤對(duì)照中總摩爾質(zhì)量的64.2%、38.9%(圖2，表3).而DnL1-1與小麥 + DnL1-1處理的總摩爾質(zhì)量分別為0.05、0.03 μmol/kg，占起始總摩爾質(zhì)量的48.6%、31.9%.以上數(shù)據(jù)表明，小麥+DnL1-1處理不僅能高效降解阿特拉津，還可以減少其降解產(chǎn)物HA、DEA、DAA等的積累，降低阿特拉津及其降解產(chǎn)物對(duì)小麥的藥害，而未接菌+小麥處理對(duì)阿特拉津降解產(chǎn)物DEA、DAA和DIA殘留積累量的降低同樣效果顯著，對(duì)HA效果不顯著，因此對(duì)于小麥對(duì)阿特拉津及其降解產(chǎn)物的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索.

表3 土壤中阿特拉津及其降解產(chǎn)物的定量檢測(cè)

LOD：檢出限；LOQ：定量限.

LOD：Limit of detection；LOQ：Limit of quantity.

3 討論

目前，關(guān)于植物對(duì)阿特拉津降解方面的研究已有相關(guān)報(bào)道.Lin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)傾草能夠降解80%以上的阿特拉津.Merini等[20]研究了多花黑麥草對(duì)阿特拉津的植物降解作用及機(jī)制.Singh等[21]研究植物對(duì)阿特拉津的降解作用，結(jié)果顯示狼尾草根際的分泌物可刺激阿特拉津的降解，同時(shí)植物的根系可幫助微生物在土壤中擴(kuò)散，因此降解菌可進(jìn)入深土層，可更好地加速阿特拉津的降解.陳建軍等[22]研究發(fā)現(xiàn)皇竹草可促進(jìn)土壤中阿特拉津的降解.王繪磚等[23]及斯華敏等[24]就轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)阿特拉津的生物降解進(jìn)行了研究，且效果顯著.但關(guān)于植物與微生物聯(lián)合修復(fù)阿特拉津污染土壤研究報(bào)道的仍屬少數(shù).

植物對(duì)阿特拉津的降解主要是通過(guò)植物的吸收、累積及根際礦化作用等途徑，而植物與微生物聯(lián)合可通過(guò)植物改變微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，增加其數(shù)量或提高其活性從而加快阿特拉津的降解[22].Kirk等[25]研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草、紫花苜蓿的根系活動(dòng)能提高根際環(huán)境中微生物的種類(lèi)、數(shù)量，促進(jìn)石油烴的降解.陳建軍等[22]發(fā)現(xiàn)皇竹草能增加土壤中的細(xì)菌、放線(xiàn)菌的數(shù)量，促進(jìn)對(duì)阿特拉津的降解.本研究中也發(fā)現(xiàn)小麥能夠促進(jìn)阿特拉津降解菌DnL1-1的種群數(shù)量，從而提高對(duì)阿特拉津的降解率，這些研究結(jié)果都說(shuō)明可能是在植物-微生物系統(tǒng)中，小麥生長(zhǎng)過(guò)程中釋放的根系分泌物為DnL1-1生長(zhǎng)提供了豐富的影響物質(zhì)，而阿特拉津的存在則為DnL1-1提供了氮源物質(zhì)，能促進(jìn)DnL1-1的活性和生物轉(zhuǎn)化作用.植物還可通過(guò)根系擴(kuò)大微生物活動(dòng)范圍來(lái)增強(qiáng)微生物活性[26].Zhang等[27]研究表明，阿特拉津降解菌DNS10與狼尾草聯(lián)合使用，30 d可降解土壤中98.1%的阿特拉津，修復(fù)效果顯著.Gaskin等[28]研究表明在外部根際菌群與宿主植物松樹(shù)共存時(shí)，對(duì)土壤中的阿特拉津其修復(fù)效率比單獨(dú)的植物修復(fù)高3倍.這些結(jié)果都相互驗(yàn)證了植物-微生物聯(lián)合可促進(jìn)對(duì)阿特拉津的降解這一結(jié)果.因此，對(duì)于阿特拉津降解菌與植物的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)提高阿特拉津的降解效果，減少阿特拉津及其降解產(chǎn)物的殘留積累，實(shí)現(xiàn)阿特拉津污染土壤的原位修復(fù)，從而降低對(duì)作物的藥害，提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義.Ibrahim等[1]曾研究發(fā)現(xiàn)，與小麥相比，玉米對(duì)阿特拉津的耐受能力要高2 024倍.因玉米體內(nèi)具有阿特拉津解毒酶，能有效地減少阿特拉津的積累，與玉米相比，小麥屬于敏感作物.多項(xiàng)研究結(jié)果表明高濃度阿特拉津?qū)π←溇哂忻黠@藥害，但在本研究結(jié)果中當(dāng)阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時(shí)，小麥本身亦能有效地促進(jìn)阿特拉津的降解，減少其降解產(chǎn)物的殘留積累，因此對(duì)于低濃度阿特拉津時(shí)，小麥本身對(duì)阿特拉津的降解修復(fù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

圖2 阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時(shí)，阿特拉津及其降解產(chǎn)物在土壤中的摩爾平衡質(zhì)量Figure 2 Molar balance of atrazine and its degradation products in soil exposed to the 116.7 μg/kg dose of the herbicide

4 結(jié)論

1) 相同接菌濃度時(shí)，阿特拉津濃度越高，DnL1-1在土壤中的定殖效果越好，隨著阿特拉津濃度的逐漸降低，DnL1-1在土壤中的定殖濃度逐漸降低；不同阿特拉津濃度處理，種植小麥土壤中DnL1-1的種群數(shù)量顯著高于未種植小麥土壤，在小麥根際的定殖濃度顯著高于非根際土.

2) 不同阿特拉津濃度處理(5 833.3、466.7、116.7μg/kg)下，小麥與DnL1-1協(xié)同對(duì)阿特拉津的降解率(98.4%、92.0%、84.5%)均顯著高于DnL1-1單獨(dú)作用(93.0%、72.0%、77.2%).

3) 阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時(shí)，小麥與DnL1-1能夠有效減少阿特拉津降解產(chǎn)物DEA、DAA、HA和DIA的殘留積累量，依次減少61.6%、52.2%、9.7%和24.4%.