楊曉燕，李艷苓，魏環(huán)宇，朱昌雄，李 峰，耿 兵

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

阿特拉津（Atrazine）是一種被世界各地廣泛應(yīng)用的三嗪類除草劑，可防除農(nóng)業(yè)和森林中的闊葉雜草及一些禾本科雜草[1-2]。雖然阿特拉津的雜草防除效果很好，但是由于其具有淋溶性好、易擴(kuò)散、遷移率高等特點(diǎn)，導(dǎo)致其可以隨排灌水和降水流失，進(jìn)而對(duì)土壤[3-5]、地表水和地下水[3，6-9]造成嚴(yán)重污染。此外，還有研究表明阿特拉津是一種內(nèi)分泌干擾物和致癌物，能夠干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)，阻斷正常的激素功能，導(dǎo)致先天缺陷、生殖腫瘤、兩棲類和人類體重減輕等，進(jìn)而影響生態(tài)平衡[10-11]。因此用生物法修復(fù)阿特拉津污染的環(huán)境受到廣大研究工作者的密切關(guān)注并逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

目前，已經(jīng)報(bào)道的能夠降解阿特拉津的細(xì)菌包括Pseudomonas sp.[12-13]、Arthrobacter sp.[14-15]、Acinetobacter sp.[16]、Rhodococcus sp.[17-18]、Pseudaminobacter sp.[19]、Nocardioides sp.[6]、Bacillus sp.[20]、Agrobacterium sp.[21-22]等許多屬。其中革蘭氏陰性菌Pseudomonas sp.ADP和革蘭氏陽(yáng)性菌Arthrobacter sp.TC1是目前研究的比較透徹的代表性菌株，前者對(duì)阿特拉津的降解是通過(guò)降解基因 atzA、atzB、atzC、atzD、atzE 和 atzF編碼的6個(gè)酶來(lái)完成，最終可以將阿特拉津完全礦化[23-24]；后者則是由trzN、atzB、atzC這3個(gè)基因編碼的酶催化完成，最終只能將阿特拉津降解為氰尿酸[15]。

盡管目前對(duì)阿特拉津生物降解的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，但鑒于阿特拉津的應(yīng)用范圍及其毒性，仍需要分離更多有效的降解菌以適應(yīng)不同環(huán)境需要。如Ye等[25]在2016年從中國(guó)東北的寒黑土壤中分離到Shewanella sp.菌株YJY4，為寒冷地區(qū)的阿特拉津污染修復(fù)提供新的候選菌株。本研究從河北省某農(nóng)藥廠排污廢水中分離出一株阿特拉津降解菌Arthrobacter ureafaciens CS3，并對(duì)其生長(zhǎng)降解特性和相關(guān)基因等進(jìn)行了分析。本研究分離的菌株CS3具有較好的耐堿性，豐富了阿特拉津降解的菌種資源并為未來(lái)偏堿環(huán)境中阿特拉津污染修復(fù)提供了優(yōu)良候選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣來(lái)源

阿特拉津污染水樣采集自河北省某農(nóng)藥廠排污河中的廢水。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

阿特拉津標(biāo)準(zhǔn)樣品和純度97%的阿特拉津原藥，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。將阿特拉津原藥溶解在甲醇中配制成10000 mg·L-1的母液備用。氰尿酸（純度98%）購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；用于高效液相色譜分析的試劑均為色譜純，其余試劑均為分析純。

無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MM）：NaCl 1.0 g、K2HPO41.5 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.2 g，蒸餾水定容至 1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃條件下滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121℃條件下滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集與分離

在無(wú)菌條件下取10 mL阿特拉津污染廢水水樣加入到含有50 mg·L-1阿特拉津的100 mL MM中馴化培養(yǎng)，每個(gè)樣品6次重復(fù)，30℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。然后取10 mL培養(yǎng)液接種到100 mL新鮮的培養(yǎng)基中，并逐漸增加培養(yǎng)基中阿特拉津濃度。按相同的富集培養(yǎng)方式培養(yǎng)，直至阿特拉津濃度增加到1000 mg·L-1，馴化結(jié)束。同時(shí)將所有濃度的富集培養(yǎng)物分別稀釋 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍，各取0.1 mL稀釋液分別涂布于含有相應(yīng)阿特拉津濃度的LB固體平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，挑取LB固體平板上不同形態(tài)特征的單菌落，在LB平板上連續(xù)劃線純化培養(yǎng)，得到純化菌株。

1.2.2 高效降解菌株的篩選

將得到的純化菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中30℃過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)液以5000 r·min-1離心3 min收集菌體，并用無(wú)菌水洗滌兩次。接種1 mL菌懸液到含有50 mg·L-1阿特拉津的50 mL MM中，30℃、150 r·min-1培養(yǎng)7 d。用高效液相色譜法定量測(cè)定各樣品中阿特拉津的殘留濃度，并計(jì)算降解率，從中篩選出高效阿特拉津降解菌。

1.2.3 高效降解菌株的鑒定

根據(jù)常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)對(duì)菌株的形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行鑒定[26]。菌株16S rRNA基因的克隆及序列分析參照如下步驟進(jìn)行：（1）基因組DNA的提取按照北京全式金生物技術(shù)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；（2）采用16S rRNA基因通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 2 min，然后 95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物大小并用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物由生工生物（上海）工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將菌株 16S rRNA基因序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，得出相似性。使用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法對(duì)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行聚類分析[27]，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用Bootstrap值進(jìn)行檢驗(yàn)，并重復(fù)1000次。

1.2.4 外加碳氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解阿特拉津效果的影響

為了探究外加碳氮源對(duì)菌株CS3生長(zhǎng)和降解阿特拉津的影響，本研究設(shè)立了四個(gè)不同處理，即在MM中分別加入50 mg·L-1阿特拉津作為唯一氮源，1 g·L-1蔗糖作為外加碳源（AT+C）；50 mg·L-1阿特拉津作為唯一碳源，1 g·L-1的NH4NO3作為外加氮源（AT+N）；50 mg·L-1阿特拉津和 1 g·L-1的 NH4NO3作為氮源，1 g·L-1蔗糖作為外加碳源（AT+CN）；只加入 50 mg·L-1阿特拉津作為唯一碳氮源（AT）。然后將1 mL濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液接種到100 mL上述四種培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)立不接種菌液的樣品為空白對(duì)照。每個(gè)處理組設(shè)三個(gè)重復(fù)。將所有樣品在30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h，每隔12 h取樣測(cè)定樣品中的菌濃度和阿特拉津的殘留濃度，并計(jì)算阿特拉津的降解率。

另外，為了研究不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解阿特拉津效果的影響，本研究分別在MM中添加1 g·L-1葡萄糖、蔗糖、乳糖、檸檬酸鈉作為外加碳源，然后將pH調(diào)節(jié)至7.0，121℃條件下滅菌30 min。將1 mL濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液接種到上述100 mL含有不同外加碳源的培養(yǎng)基中，并加入0.5 mL濃度為10 000 mg·L-1的阿特拉津甲醇母液，使阿特拉津的終濃度為50 mg·L-1。同時(shí)設(shè)立沒(méi)有添加外加碳源的樣品為空白對(duì)照。每個(gè)處理組設(shè)三個(gè)重復(fù)。將所有樣品在30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)取樣測(cè)定樣品中的菌濃度和阿特拉津的殘留濃度，并計(jì)算阿特拉津的降解率。

菌濃度測(cè)定方法：通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品在600 nm處的吸光值（OD600）來(lái)表示，阿特拉津降解率的計(jì)算參照方法1.2.8進(jìn)行。

1.2.5 環(huán)境因素對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解阿特拉津效果的影響

為了研究不同的環(huán)境因素如pH、溫度、阿特拉津濃度等對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解阿特拉津的影響，本研究分別設(shè)置不同溫度（4、10、20、30、37、45 ℃）、不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0） 和不同阿特拉津濃度（5、25、50、75、100、200 mg·L-1）處理組。分別將1 mL濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液接種到100 mL含1 g·L-1蔗糖的MM中，并加入0.5 mL濃度為10 000 mg·L-1的阿特拉津甲醇母液，使阿特拉津的終濃度為50 mg·L-1。同時(shí)設(shè)立不接種菌液的樣品為空白對(duì)照，每個(gè)處理組設(shè)三個(gè)重復(fù)。將所有樣品在30℃（不同溫度實(shí)驗(yàn)除外）、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)取樣測(cè)定樣品中的菌濃度和阿特拉津的殘留濃度，并計(jì)算阿特拉津的降解率。

1.2.6 阿特拉津降解基因的檢測(cè)

參考前人報(bào)道的 atzA、atzB、atzC、atzD、atzE、atzF、trzD和trzN基因引物序列[23，28-30]，以菌株CS3的基因組DNA為模板對(duì)上述8種降解基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性1 min，最佳退火溫度退火60 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并由生工生物（上海）工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI網(wǎng)站上的BLAST 程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.7 菌株的生長(zhǎng)及降解曲線

將1 mL濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液接種到100 mL含1 g·L-1蔗糖的MM中，然后加入0.5 mL濃度為10 000 mg·L-1的阿特拉津甲醇母液，使阿特拉津的終濃度為50 mg·L-1。將樣品分別在30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)。每隔6 h取樣并測(cè)定樣品中的菌濃度、阿特拉津的殘留濃度和氰尿酸濃度。每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.8 阿特拉津和氰尿酸的測(cè)定

將培養(yǎng)液與二氯甲烷以1∶2的比例混合萃取3次，合并有機(jī)相。將合并的有機(jī)萃取液放入圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將液體濃縮并蒸發(fā)至干，最后用色譜純的甲醇溶液調(diào)節(jié)體積。之后將樣品通過(guò)0.22 μm尼龍膜過(guò)濾，并裝進(jìn)樣瓶中備用。

采用HP1050型高效液相色譜（HPLC）儀檢測(cè)阿特拉津和氰尿酸的濃度。阿特拉津檢測(cè)的液相條件為：反相 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相配比為甲醇∶水=70∶30（V/V），流速為 0.8 mL·min-1，可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：10 μL。氰尿酸檢測(cè)的液相條件為：Thermo氨基色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相配比為甲醇∶0.1%NH3·H2O=70∶30（V/V），流速：1.0 mL·min-1，可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL。

根據(jù)HPLC測(cè)定的結(jié)果，計(jì)算阿特拉津的降解率，計(jì)算公式如下：

式中：X為阿特拉津的降解率，%；CX為阿特拉津的終濃度，mg·L-1；CCK為阿特拉津的初始濃度，mg·L-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。采用軟件SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和相關(guān)性分析以確定所有處理組之間的差異。設(shè)定P＜0.05為顯著性差異。利用Origin 9.0軟件進(jìn)行作圖。

圖1 菌株CS3的掃描電鏡圖（×20 000倍）Figure1 Scanning electron micrograph of strain CS3（×20 000 times）

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株CS3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain CS3

2 結(jié)果與分析

2.1 高效阿特拉津降解菌的分離及鑒定

經(jīng)分離純化，最終篩選出1株高效阿特拉津降解菌，命名為菌株CS3。菌株CS3為革蘭氏陽(yáng)性菌，在LB平板上的菌落形態(tài)特征為菌落邊緣整齊，表面凸起，呈金黃色，不透明，粘稠，光滑的圓形菌落。菌株CS3的菌體形態(tài)特征如圖1所示，在培養(yǎng)過(guò)程中有明顯的桿、球變化特征，培養(yǎng)2 d的幼齡菌體呈長(zhǎng)桿狀，培養(yǎng)6 d后的老齡菌體則呈球狀或短桿狀。菌株CS3不水解淀粉，不產(chǎn)H2S和吲哚，氧化酶陰性，甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陰性；接觸酶陽(yáng)性，能夠產(chǎn)氨。

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到菌株CS3的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1394 bp（GenBank登錄號(hào)為MF612193）。通過(guò)NCBI的BLAST程序與已知序列比對(duì)可知，菌株 CS3與產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Arthrobacter ureafaciens）的16S rRNA基因序列同源，相似性在99%以上；與其余多株節(jié)桿菌屬細(xì)菌的16S rRNA基因序列亦同源，相似性都在97%以上。菌株CS3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）遺傳距離顯示菌株CS3與Arthrobacter ureafaciens的親緣關(guān)系最近，并與其聚集在同一個(gè)分支上。結(jié)合其形態(tài)特征及生理生化特征，將菌株CS3初步鑒定為產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Arthrobacter ureafaciens）。

2.2 外加碳氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解阿特拉津效果的影響

圖3顯示了外加碳氮源對(duì)菌株CS3生長(zhǎng)的影響和菌株CS3降解阿特拉津的影響。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，處理組（AT+CN）和（AT+C）中菌株 CS3的菌濃度都顯著高于（AT+N）和（AT）處理組（P＜0.05）。處理組（AT+N）和（AT）中的菌株CS3的菌濃度增長(zhǎng)微弱，且這兩個(gè)處理組之間無(wú)顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明外加碳源能夠明顯促進(jìn)菌株CS3的生長(zhǎng)，外加氮源對(duì)其生長(zhǎng)影響不大，并且菌株CS3能夠利用阿特拉津作為唯一氮源生長(zhǎng)，不能利用其作為唯一碳源生長(zhǎng)。培養(yǎng)36 h之前，處理組（AT+CN）和（AT+C）中的阿特拉津降解率均顯著高于處理組（AT+N）和（AT）。36 h之后所有處理組中的阿特拉津基本都被完全降解，各處理組之間無(wú)顯著性差異，表明外加碳源或氮源對(duì)阿特拉津降解率的影響并不大。

外加不同碳源對(duì)菌株CS3生長(zhǎng)的影響如圖4所示。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，在含有外加蔗糖的處理組中菌株CS3的菌濃度都明顯高于其他處理組；其次為乳糖。葡萄糖處理組中的菌株生長(zhǎng)最慢，與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果表明外加蔗糖、乳糖和檸檬酸鈉均會(huì)明顯促進(jìn)菌株CS3的生長(zhǎng)，其中最佳外加碳源為蔗糖。葡萄糖對(duì)菌株CS3的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。圖4還顯示了外加不同碳源對(duì)菌株CS3降解阿特拉津的影響。在培養(yǎng)24 h時(shí)，在含有外加蔗糖的處理組中菌株CS3對(duì)阿特拉津的降解效果最好且顯著高于其他處理組，其次為乳糖。培養(yǎng)48 h之后，外加蔗糖、乳糖和檸檬酸鈉的3個(gè)處理組中阿特拉津降解率均達(dá)到95%以上，無(wú)顯著性差異。此時(shí)葡萄糖處理組中菌株CS3對(duì)阿特拉津的降解率最低，僅為29.53%，甚至遠(yuǎn)低于對(duì)照組的83.04%。綜上可知，外加葡萄糖會(huì)抑制菌株CS3對(duì)阿特拉津的降解，外加蔗糖、乳糖和檸檬酸鈉則均會(huì)促進(jìn)菌株CS3對(duì)阿特拉津的降解。

圖3 外加碳氮源對(duì)菌株CS3生長(zhǎng)及阿特拉津降解的影響Figure3 Growth and atrazine degradation of strain CS3 with exogenous carbon or nitrogen sources

圖4外加不同碳源對(duì)菌株CS3生長(zhǎng)及阿特拉津降解的影響Figure4 Growth and atrazine degradation of strain CS3 with different carbon sources

2.3 環(huán)境因素對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解阿特拉津效果的影響

圖5 顯示了不同pH值、不同溫度和不同阿特拉津濃度對(duì)菌株CS3生長(zhǎng)及降解阿特拉津效果的影響。當(dāng)pH值為7時(shí)菌株CS3的生長(zhǎng)最好，對(duì)阿特拉津的降解率也最高。當(dāng)pH為6時(shí)，菌株生長(zhǎng)及對(duì)阿特拉津的降解都受到較大影響，48 h后的阿特拉津降解率下降為58.90%。當(dāng)pH低于4時(shí)，菌株幾乎不能生長(zhǎng)，48 h后對(duì)阿特拉津的降解率低于20%，表明該菌株不適宜在酸性環(huán)境降解阿特拉津。當(dāng)pH為11時(shí)，菌株仍能較好地生長(zhǎng)，48 h后對(duì)阿特拉津的降解率依然保持在90%以上。當(dāng)pH為12時(shí)，菌株生長(zhǎng)及對(duì)阿特拉津的降解則會(huì)受到較大影響，48 h后對(duì)阿特拉津的降解率為31.40%。由此可知菌株CS3能夠生長(zhǎng)和降解阿特拉津的pH范圍在5～11之間，范圍很寬且具有較好的耐堿性，偏堿性環(huán)境對(duì)阿特拉津的降解效果影響不大。因此該菌株可以作為未來(lái)偏堿環(huán)境中修復(fù)阿特拉津污染的優(yōu)良候選菌株。

溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)抑制阿特拉津降解菌的生長(zhǎng)，同時(shí)影響阿特拉津降解菌代謝和降解酶活性[31]。由圖5可知，菌株CS3生長(zhǎng)和降解阿特拉津的最佳溫度為30℃，在溫度范圍為10～37℃之間，具有一定的生長(zhǎng)和降解能力。當(dāng)溫度低于4℃或高于45℃時(shí)，菌株CS3幾乎不能生長(zhǎng)。顯著性分析表明在實(shí)驗(yàn)溫度條件下菌株CS3的生長(zhǎng)與對(duì)阿特拉津的降解率之間存在極顯著相關(guān)性（R=0.959**）。

由圖5可知，當(dāng)阿特拉津濃度為5 mg·L-1時(shí)，菌株CS3的濃度基本保持不變，OD600的值沒(méi)有明顯增加，原因可能是低濃度阿特拉津不能夠?yàn)榫晟L(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)。阿特拉津濃度在5～50 mg·L-1之間時(shí)，OD600的值隨著阿特拉津濃度的增高而逐漸增加。當(dāng)阿特拉津濃度超過(guò)50 mg·L-1后，OD600值開(kāi)始下降，推測(cè)可能是因?yàn)楦邼舛鹊陌⑻乩驎?huì)對(duì)菌株CS3的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)阿特拉津濃度高于75 mg·L-1時(shí)，由于其低水溶性（33 mg·L-1）而不能完全溶解在培養(yǎng)基中，因此之后未測(cè)定OD600的值。培養(yǎng)24 h時(shí)，隨著阿特拉津濃度的升高，降解率逐漸降低。培養(yǎng)48 h后，只有阿特拉津濃度為200 mg·L-1處理組的阿特拉津降解率為96.15%，其余處理組阿特拉津降解率都達(dá)到98.81%以上，且與其余處理組之間都存在顯著性差異。但在試驗(yàn)最高濃度（200 mg·L-1）以內(nèi)，阿特拉津的降解率最終不會(huì)受到太大影響。另經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，菌株CS3能在6 d內(nèi)將500 mg·L-1的阿特拉津降解完全（數(shù)據(jù)未顯示）。綜上可知，菌株CS3對(duì)低濃度和高濃度的阿特拉津都具有較好的降解能力。

圖5 不同環(huán)境條件對(duì)菌株CS3生長(zhǎng)及阿特拉津降解的影響Figure5 Growth and atrazine degradation by strain CS3 under different culture conditions

圖6 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌株CS3的阿特拉津降解基因Figure6 Agarose gel electrophoresis（1%）detection of atrazinedegrading genes of strain CS3

2.4 阿特拉津降解基因的檢測(cè)

通過(guò)PCR擴(kuò)增，分別獲得444 bp的trzN基因、537 bp的atzB基因和630 bp的atzC基因。盡管本研究還嘗試了用不同的擴(kuò)增條件和引物去擴(kuò)增其他5種降解基因，但是最終都未成功（圖6）。將序列測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)，結(jié)果顯示本研究獲得的基因trzN（GenBank登錄號(hào)MF774327）分別與 Arthrobacter sp.SD41（KP994319）[32]和 Arthrobacter sp.C3（KR263873）[33]的 trzN 基因同源性分別為100%、99%?；?atzB（GenBank登錄號(hào) MF774328）和atzC（GenBank登錄號(hào)MF774329）分別與Arthro-bacter aurescens TC1（AY456696）[34]的 atzB 和 atzC 基因的同源性分別為98%和99%。

2.5 菌株的生長(zhǎng)及降解曲線

從圖7可以看出，12 h內(nèi)OD600的值增加緩慢，對(duì)阿特拉津的降解效果也不明顯，可能因?yàn)榍?2 h菌株CS3處于延滯期，對(duì)于環(huán)境需要一個(gè)適應(yīng)的過(guò)程。從12 h開(kāi)始菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600的值增長(zhǎng)迅速，其對(duì)阿特拉津的降解速度也相應(yīng)加快。到48 h時(shí)菌株CS3進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，OD600的值基本保持不變，此時(shí)阿特拉津也被降解完全。在整個(gè)降解過(guò)程中，氰尿酸的濃度變化與阿特拉津濃度變化趨勢(shì)完全相反，從12 h至36 h之間濃度急劇增加，到48 h后保持在30 mg·L-1左右不再增加。相關(guān)性分析也表明，菌株的生長(zhǎng)與阿特拉津的降解之間具有極顯著正相關(guān)性（R=0.991**），而氰尿酸濃度與阿特拉津濃度之間具有極顯著負(fù)相關(guān)性（R=-0.989**）。此外，阿特拉津的初始平均摩爾濃度等于累積的氰尿酸的平均摩爾濃度。以上結(jié)果表明，阿特拉津的降解和菌株的生長(zhǎng)基本同步。結(jié)合菌株CS3降解基因的檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)菌株CS3可能只能降解阿特拉津?yàn)闊o(wú)毒的氰尿酸，而不能進(jìn)一步代謝氰尿酸為CO2和NH3。

圖7 菌株CS3的生長(zhǎng)曲線及阿特拉津降解曲線Figure7 Growth curve of strain CS3 and atrazine degradation curve by strain CS3

3 討論

目前已經(jīng)報(bào)道了許多從不同地方分離到的屬于節(jié)桿菌屬的阿特拉津降解菌，如菌株HIM[35]、GZK-1[1]、KU001[36]、TC1[34]、ADH-2[37]、AD26[38]、MCM B-436[39]、AG1[40]、FM326[41]等。另有許多報(bào)道指出，該屬細(xì)菌能夠降解許多其他有機(jī)污染物，如苯胺、苯酚、石油、有機(jī)磷農(nóng)藥等[15，39]。這些工作顯示出節(jié)桿菌屬菌株在污染位點(diǎn)生物修復(fù)方面具有巨大潛力。

研究報(bào)道多數(shù)阿特拉津降解菌能夠以阿特拉津?yàn)榈催M(jìn)行生長(zhǎng)并將它降解[14，38，42-44]，因此外加氮源會(huì)抑制多數(shù)菌株對(duì)阿特拉津的利用和降解[45]，對(duì)外源氮源不敏感的阿特拉津降解菌的報(bào)道很少。本研究中菌株CS3也能夠利用阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏矗峭饧拥磳?duì)其生長(zhǎng)和降解阿特拉津沒(méi)有太大影響，具體原因還在進(jìn)一步研究中。

本研究中，外加蔗糖、乳糖和檸檬酸鈉能夠促進(jìn)菌株CS3的生長(zhǎng)及對(duì)阿特拉津的降解，外加葡萄糖則會(huì)抑制其對(duì)阿特拉津的降解。不同外加碳源對(duì)不同阿特拉津降解菌的影響不同。在某些情況下，外加碳源甚至可以抑制阿特拉津的降解。前人研究報(bào)道，外加蔗糖和葡萄糖能顯著促進(jìn)菌株ADH-2的生長(zhǎng)，但對(duì)阿特拉津的降解表現(xiàn)出顯著的抑制，而淀粉對(duì)其生長(zhǎng)和阿特拉津降解均表現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)[37]。Wang等[43]研究表明加入蔗糖、檸檬酸鈉或半乳糖可顯著促進(jìn)菌株DAT1的生長(zhǎng)，蔗糖是其生長(zhǎng)最適合的碳源。然而，Wang等[46]2011年發(fā)現(xiàn)加入蔗糖并沒(méi)有加速菌株HB-5對(duì)阿特拉津的降解。李紹峰等[47]研究發(fā)現(xiàn)降解菌株L-6可以利用葡萄糖、果糖和檸檬酸鈉生長(zhǎng)，不能利用蔗糖、乳糖和淀粉。因此，不同阿特拉津降解菌的生長(zhǎng)及對(duì)阿特拉津的降解依賴于有機(jī)物質(zhì)的類型[42]。

與許多菌株，如菌株 HB-5[46]、DNS10[42]、T3AB1[48]、X-4[49]、FM326[41]等相比，菌株CS3能夠生長(zhǎng)并降解阿特拉津的pH范圍更寬。菌株CS3降解阿特拉津的pH范圍不僅很寬，且具有一定的嗜堿性，在pH值為11的條件下，也具有很高的降解特性，這對(duì)于未來(lái)偏堿環(huán)境中修復(fù)阿特拉津提供了更好的選擇。

已經(jīng)分離到的節(jié)桿菌屬阿特拉津降解菌株中，除AD1[14]、MCMB436[39]、C3[33]外，許多其他 Arthrobacter sp.菌株都含有trzN、atzB、atzC基因。菌株CS3中包含的阿特拉津降解基因組合與許多已經(jīng)報(bào)道的節(jié)桿菌菌株如 SD41[32]、TC1[34]、ADH-2[37]、AD26[38]、X-4[49]、KU001[36]、DNS10[42]、DAT1[43]等含有相同的基因組合（trzN-atzBC）。結(jié)合前人報(bào)道的阿特拉津降解基因及降解途徑的研究報(bào)道[23-24]，初步推測(cè)其只能將阿特拉津降解為無(wú)毒的氰尿酸，而不能完全將阿特拉津礦化。菌株CS3降解阿特拉津的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，當(dāng)阿特拉津被降解時(shí)會(huì)積累氰尿酸，且阿特拉津的初始平均摩爾濃度等于累積的氰尿酸的平均摩爾濃度。因此可以推測(cè)菌株CS3通過(guò)trzN-atzB-atzC代謝途徑，經(jīng)水解脫氯和脫烷基化，將阿特拉津轉(zhuǎn)化為氰尿酸，但不能進(jìn)一步催化三嗪環(huán)的裂解，使氰尿酸進(jìn)一步降解為 CO2和 NH3[1，50-51]。

菌株CS3具有較好的降解性，對(duì)低濃度和高濃度阿特拉津都具有較好的降解能力。其降解速率遠(yuǎn)高于Zhang等[31]篩選的菌株N1以及Vaishampayan等[39]報(bào)道的菌株MCM B-436，前者96 h將20 mg·L-1阿特拉津降解66.4%，后者30 h將25 mg·L-1阿特拉津完全降解。

目前本研究只是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，下一步將重點(diǎn)研究其在生態(tài)環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用效果及特性，為進(jìn)一步提高其實(shí)際應(yīng)用效果提供基礎(chǔ)。此外，關(guān)于菌株CS3與其他降解菌之間是否存在共存互作以及相互之間的互作機(jī)制也在進(jìn)一步研究當(dāng)中。

4 結(jié)論

（1）從河北某農(nóng)藥廠排污河中的廢水中分離出一株以阿特拉津?yàn)槲ㄒ坏瓷L(zhǎng)的高效降解阿特拉津降解菌CS3。經(jīng)生理生化鑒定和16S rRNA基因序列分析，將其鑒定為產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Arthrobacter ureafaciens）。

（2）菌株 CS3 含有降解基因 trzN、atzB、atzC，能夠?qū)⑻乩蚪到鉃闊o(wú)毒的氰尿酸。

（3）在最適條件（30℃，pH 為 7）下，菌株 CS3能在48 h內(nèi)完全降解50 mg·L-1的阿特拉津。甚至能夠在6 d內(nèi)將500 mg·L-1的阿特拉津完全降解，表明該菌株具有很好的降解能力。

（4）菌株CS3生長(zhǎng)和降解阿特拉津的溫度和pH范圍較寬，分別為10～37℃和5～11，顯示出較好的環(huán)境生存能力及較好的生物修復(fù)潛力。此外，菌株CS3生長(zhǎng)和降解阿特拉津的pH范圍表明該菌株具有較好的耐堿性，為未來(lái)偏堿環(huán)境中阿特拉津污染修復(fù)提供了良好的候選菌株。

[1]Getenga Z,D?rfler U,Iwobi A,et al.Atrazine and terbuthylazine mineralization by an Arthrobacter sp.isolated from a sugarcane-cultivated soil in Kenya[J].Chemosphere,2009,77（4）：534-539.

[2]Lima D,Viana P,André S,et al.Evaluating a bioremediation tool for atrazine contaminated soils in open soil microcosms：The effectiveness of bioaugmentation and biostimulation approaches[J].Chemosphere,2009,74（2）：187-192.

[3]Houot S,Topp E,Yassir A,et al.Dependence of accelerated degradation of atrazine on soil pH in French and Canadian soils[J].Soil Biology&Biochemistry,2000,32（5）：615-625.

[4]Bastos A C,Magan N.Trametes versicolor：Potential for atrazine bioremediation in calcareous clay soil,under low water availability conditions[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2009,63（4）：389-394.

[5]Rousseaux S,Hartmann A,Soulas G.Isolation and characterisation of new Gram-negative and Gram-positive atrazine degrading bacteria from different French soils[J].Fems Microbiology Ecology,2001,36（2/3）：211-222.

[6]Omotayo A E,Ilori M O,Radosevich M,et al.Metabolism of atrazine in liquid cultures and soil microcosms by Nocardioides strains isolated from a contaminated nigerian agricultural soil[J].Soil&Sediment Contamination An International Journal,2013,22（4）：365-375.

[7]Singh S N,Jauhari N.Degradation of atrazine by plants and microbes[M]//Microbe-Induced Degradation of Pesticides.Springer International Publishing,2017.

[8]Fan X,Song F.Bioremediation of atrazine：recent advances and promises[J].Journal of Soils&Sediments,2014,14（10）：1727-1737.

[9]Solomon K,Carr J P L,Giesy J,et al.Effects of atrazine on fish,amphibians,and aquatic reptiles：A critical review[J].Critical Reviews in Toxicology,2008,38（9）：721-772.

[10]Shenoy K.Environmentally realistic exposure to the herbicide atrazine alters some sexually selected traits in male guppies[J].PloS One,2012,7（2）：e30611.

[11]Hayes T B,Case P,Chui S,et al.Pesticide mixtures,endocrine disruption,and amphibian declines：Are we underestimating the impact?[J].Environmental Health Perspectives,2006,114（Suppl 1）：40-50.

[12]Fernandes A F,Da S M,Martins V V,et al.Isolation and characterization of a Pseudomonas aeruginosa from a virgin Brazilian Amazon region with potential to degrade atrazine[J].Environmental Science&Pollution Research International,2014,21（24）：13974-13978.

[13]Mandelbaum R T,Allan D L,Wackett L P.Isolation and characterization of a Pseudomonas sp.that mineralizes the s-triazine herbicide atrazine[J].Applied&Environmental Microbiology,1995,61（4）：1451-1457.

[14]Cai B,Han Y,Liu B,et al.Isolation and characterization of an atrazine-degrading bacterium from industrial wastewater in China[J].Letters in Applied Microbiology,2003,36（5）：272-276.

[15]Strong L C,Rosendahl C,Johnson G,et al.Arthrobacter aurescens TC1 metabolizes diverse s-triazine ring compounds[J].Applied&Environmental Microbiology,2002,68（12）：5973-5980.

[16]Singh P,Suri C R,Cameotra S S.Isolation of a member of Acinetobacter species involved in atrazine degradation[J].Biochemical&Biophysical Research Communications,2004,317（3）：697-702.

[17]Kolekar P D,Phugare S S,Jadhav J P.Biodegradation of atrazine by Rhodococcus sp.BCH2 to N-isopropylammelide with subsequent assessment of toxicity of biodegraded metabolites[J].Environmental Science&Pollution Research International,2014,21（3）：2334-2345.

[18]Fazlurrahman, Batra M, Pandey J, et al. Isolation and characterizationof an atrazine-degrading Rhodococcus sp. strain MB-P1 from contaminatedsoil[J]. Letters in Applied Microbiology, 2009, 49（6）：721-729.

[19]Topp E, Zhu H, Nour S M, et al. Characterization of an atrazine-degradingPseudaminobacter sp. isolated from Canadian and French agri-cultural soils[J]. Applied&Environmental Microbiology, 2000a, 66（7）：2773-2782.

[20]Wang J,Zhu L,Wang Q,et al.Isolation and characterization of atrazine mineralizing Bacillus subtilis strain HB-6[J].PloS One,2014,9（9）：e107270.

[21]Struthers J K, Jayachandran K, Moorman T B. Biodegradation of atrazineby Agrobacterium radiobacter J14a and, use of this strain inbioremediation of contaminated soil[J]. Applied&Environmental Microbiology,1998, 64（9）：3368-3375.

[22]Siripattanakul S,Wirojanagud W,Mcevoy J M,et al.Atrazine removal in agricultural infiltrate by bioaugmented polyvinyl alcohol immobilized and free Agrobacterium radiobacter,J14a：A sand column study[J].Chemosphere,2009,74（2）：308-313.

[23]Martinez B,Tomkins J,Wackett L P,et al.Complete nucleotide sequence and organization of the atrazine catabolic plasmid pADP-1 from Pseudomonas sp.strain ADP[J].Journal of Bacteriology,2001,183（19）：5684-5697.

[24]Wackett L P,Sadowsky M J,Martinez B,et al.Biodegradation of atrazine and related s-triazine compounds：from enzymes to field studies[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2002,58（1）：39-45.

[25]Ye J,Zhang J,Gao J,et al.Isolation and characterization of atrazinedegrading strain Shewanella sp.YJY4 from cornfield soil[J].Letters in Applied Microbiology,2016,63（1）：45-52.

[26]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2001.

DONG Xiu-zhu,CAI Miao-ying.Manual of systematic determinative familiar bacteriology[M].Beijing：Science Press,2001.

[27]Tamura K,Stecher G,Peterson D,et al.MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular Biology and Evolution,2013,30（12）：2725-2729.

[28]De Souza M L,Seffernick J,Martinez B,et al.The atrazine catabolism genes atzABC are widespread and highly conserved[J].Journal of Bacteriology,1998,180（7）：1951-1954.

[29]Mulbry W W,Zhu H,Nour S M,et al.The triazine hydrolase gene trzN from Nocardioides sp.strain C190：Cloning and construction of genespecific primers[J].Fems Microbiology Letters,2002,206（1）：75-79.

[30]Devers M,El A N,Kolic N U,et al.Detection and organization of atrazine-degrading genetic potential of seventeen bacterial isolates belonging to divergent taxa indicate a recent common origin of their catabolic functions[J].Fems Microbiology Letters,2007,273（1）：78-86.

[31]Zhang H,Zhang Y,Hou Z,et al.Biodegradation of triazine herbicide metribuzin by the strain Bacillus sp.N1[J].Journal of Environmental Science&Health Part B,2014,49（2）：79-86.

[32]李紅梅,張新建,李紀(jì)順,等.阿特拉津降解菌SD41的分離鑒定及土壤修復(fù)[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2014,37（4）：38-41.

LI Hong-mei,ZHANG Xin-jian,LI Ji-shun,et al.Experimental study on atrazine-degrading strain SD41：Isolation,identification and soil remediation[J].Environmental Science&Technology,2014,37（4）：38-41.

[33]Wang H,Liu Y,Li J,et al.Biodegradation of atrazine by Arthrobacter sp.C3,isolated from the herbicide-contaminated corn field[J].International Journal of Environmental Science&Technology,2016,13（1）：257-262.

[34]Sajjaphan K,Shapir N,Wackett L P,et al.Arthrobacter aurescens TC1 atrazine catabolism genes trzN,atzB,and atzC are linked on a 160-kilobase region and are functional in Escherichia coli[J].Applied&Environmental Microbiology,2004,70（7）：4402-4407.

[35]Aislabie J,Bej A J,Lloyd N,et al.Characterization of Arthrobacter nicotinovorans,HIM,an atrazine-degrading bacterium,from agricultural soil New Zealand[J].Fems Microbiology Ecology,2005,52（2）：279-286.

[36]Sajjaphan K,Heepngoen P,Sadowsky M J,et al.Arthrobacter sp.strain KU001 isolated from a Thai soil degrades atrazine in the presence of inorganic nitrogen sources[J].Journal of Microbiology&Biotechnology,2010,20（3）：602-608.

[37]韓 鵬,洪 青,何麗娟,等.阿特拉津降解菌ADH-2的分離、鑒定及其特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2009,28（2）：406-410.

HAN Peng,HONG Qing,HE Li-juan,et al.Isolation,identification and characterization of an atrazine-degrading bacteria ADH-2[J].Journal of Agro-Environment Science,2009,28（2）：406-410.

[38]朱希坤,李清艷,蔡寶立.節(jié)桿菌AD26的分離鑒定及其與假單胞菌ADP對(duì)阿特拉津的聯(lián)合降解[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2009,28（3）：627-632.

ZHU Xi-kun,LI Qing-yan,CAI Bao-li.Isolation and identification of Arthrobacter sp.AD26 and joint degradation of atrazine by Arthrobacter sp.AD26 and Pseudomonas sp.ADP[J].Journal of Agro-Environment Science,2009,28（3）：627-632.

[39]Vaishampayan P A,Kanekar P P,Dhakephalkar P K.Isolation and characterization of Arthrobacter sp.strain MCM B-436,an atrazinedegrading bacterium,from rhizospheric soil[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2007,60（4）：273-278.

[40]代先祝,胡 江,蔣建東,等.污染土壤中原位阿特拉津降解菌的分離和鑒定[J].土壤學(xué)報(bào),2006,43（3）：467-472.

DAI Xian-zhu,HU Jiang,JIANG Jian-dong,et al.Isolation and identification of in situ atrazine-degrading bacteria from contaminated soils[J].Aeta Pedologica Sinica,2006,43（3）：467-472.

[41]李明銳,祖艷群,陳建軍,等.阿特拉津降解菌FM326（Arthrobacter sp.）的分離篩選、鑒定和生物學(xué)特性[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2011,30（11）：2242-2248.

LI Ming-rui,ZU Yan-qun,CHEN Jian-jun.Isolation,screening and identification of atrazine-degrading bacterium FM326（Arthrobacter sp.）[J].Journal of Agro-Environment Science,2011,30 （11）：2242-2248.

[42]Zhang Y,Jiang Z,Cao B,et al.Metabolic ability and gene characteristics of Arthrobacter sp.strain DNS10,the sole atrazine-degrading strain in a consortium isolated from black soil[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2011,65（8）：1140-1144.

[43]Wang Q,Xie S.Isolation and characterization of a high-efficiency soil atrazine-degrading Arthrobacter sp.strain[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2012,71（4）：61-66.

[44]周 寧,王榮娟,孟慶娟,等.寒地黑土中阿特拉津降解菌的篩選及降解特性[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2008,2（11）：1560-1563.

ZHOU Ning,WANG Rong-juan,MENG Qing-juan,et al.Screening and identification of atrazine degrading bacteria and their degradation characteristics from black soil in cold aera[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2008,2（11）：1560-1563.

[45]Yang C,Li Y,Zhang K,et al.Atrazine degradation by a simple consortium of Klebsiella sp.A1 and Comamonas sp.A2 in nitrogen enriched medium[J].Biodegradation,2010,21（1）：97-105.

[46]Wang J,Zhu L,Liu A,et al.Isolation and characterization of an Arthrobacter sp.strain HB-5 that transforms atrazine[J].Environmental Geochemistry&Health,2011,33（3）：259-266.

[47]李紹峰,朱 靜,李鐵晶.阿特拉津降解菌株的分離、鑒定及降解特性研究[J].環(huán)境科學(xué),2012,33（9）：3214-3219.

LI Shao-feng,ZHU Jing,LI Tie-jing.Isolation,identification and characterization of an atrazine degrading bacterium[J].Environmental Science,2012,33（9）：3214-3219

[48]閆彩芳,婁 旭,洪 青,等.一株阿特拉津降解菌的分離鑒定及降解特性[J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38（4）：493-497.

YAN Cai-fang,LOU Xu,HONG Qing,et al.Isolation,identification and characterization of an atrazine-degrading strain[J].Journal of Agro-Environment Science,2011,38（4）：493-497.

[49]劉春光,楊峰山,盧星忠,等.阿特拉津降解菌T3AB1的分離鑒定及土壤修復(fù)[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50（12）：1642-1650.

LIU Chun-guang,YANG Feng-shan,LU Xing-zhong,et al.Isolation,identification and soil remediation of atrazine-degrading strain T3AB1[J].Acta Microbiologica Sinica,2010,50（12）：1642-1650.

[50]Vibber L L,Pressler M J,Colores G M.Isolation and characterization of novel atrazine-degrading microorganisms from an agricultural soil[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2007,75（4）：921-928.

[51]Arbeli Z,Fuentes C.Prevalence of the gene trzN and biogeographic patterns among atrazine-degrading bacteria isolated from 13 Colombian agricultural soils[J].Fems Microbiology Ecology,2010,73（3）：611-623.