劉瑞莉，袁 瑋，吳 磊，劉賢勛，柏學(xué)進(jìn),3，董雅娟,3*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物胚胎工程中心，山東青島 266109；2.山東省黑牛繁育工程技術(shù)研究中心，山東青島 266109；3.山東布萊凱特黑?？萍脊煞萦邢薰荆綎|淄博 256306）

肌內(nèi)脂肪含量與大理石花紋是肉牛非常重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，提高這2 個(gè)指標(biāo)可為國內(nèi)牛產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益[1-2]。脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（Adipocyte Fatty Acid Binding-Protein，A-FABP），又稱FABP4，是 脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）家族的重要成員之一[3]。早期研究發(fā)現(xiàn)，A-FABP 的主要功能為加強(qiáng)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散、促進(jìn)細(xì)胞膜吸附脂肪酸、緩解不飽和脂肪酸對(duì)細(xì)胞的損傷作用、調(diào)節(jié)長(zhǎng)鏈脂肪酸的氧化供能及磷脂和甘油三酯的代謝[4]；調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸濃度，調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)過程，參與細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸隔室化分布[5]。Gerbens 等[6]首次發(fā)現(xiàn)豬A-FABP 基因內(nèi)含子上的1 個(gè)微衛(wèi)星，其多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)；近年來研究發(fā)現(xiàn)牛A-FABP 基因在脂肪組織中表達(dá)量較高，其表達(dá)活性增強(qiáng)與脂肪細(xì)胞的分化有顯著性關(guān)系[7]，此外還與代謝綜合征、糖尿病等疾病有關(guān)。由此推測(cè)，A-FABP 是影響肌內(nèi)脂肪沉積重要的候選基因，在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有著廣闊的應(yīng)用前景。

布萊凱特黑牛是青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研成果轉(zhuǎn)化基地及教學(xué)實(shí)習(xí)基地即山東布萊凱特科技股份有限公司2009年培育而成的優(yōu)良肉牛種質(zhì)資源[8]，2015 年經(jīng)國內(nèi)肉牛權(quán)威專家鑒定其為新種群[9]。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量 PCR 技術(shù)探究黑牛不同組織、不同時(shí)期中的 A-FABP 基因 mRNA 的表達(dá)規(guī)律；采用 PCR-SSCP 方法分析其與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性，為研究黑牛A-FABP 基因的生物學(xué)功能及其表達(dá)奠定理論基礎(chǔ)，為布萊凱特黑牛肉質(zhì)性狀的分子選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研成果轉(zhuǎn)化基地及教學(xué)實(shí)習(xí)基地山東布萊凱特黑?？萍脊煞萦邢薰?，選擇飼養(yǎng)條件一致、體況相近、健康的黑牛12 頭，分別采集2、6、10、12 月齡背最長(zhǎng)肌，每時(shí)間點(diǎn)各3 頭，立即放入液氮保存；黑牛宰殺后迅速采集甲狀腺、胰腺、腎上腺等組織各2～5 g，立即放入液氮保存；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為96 頭去勢(shì)后育肥的布萊凱特黑牛（25 月齡），批次與育肥環(huán)境均相同，采集背最長(zhǎng)肌肉樣，并進(jìn)行肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定。

1.2 RNA 的提取及cDNA 的合成 用Trizol 法從背最長(zhǎng)肌中提取RNA，用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟見參考文獻(xiàn)[10]。1.3 設(shè)計(jì)引物與合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中牛A-FABP基因（GenBank 登錄號(hào)：NM_174314.2 ）和GAPDH基 因（GenBank 登 錄 號(hào)：NM_001034034.2）， 使 用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.4 PCR 擴(kuò)增目的片段 對(duì)目的片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系25 μL：上、下游引物（10 pmol/ μL）各0.5 μL，cDNA（50 ng/ μL）1 μL，MIX 12.5 μL，超純水10.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，特異的退火溫度退火30 s，72℃延伸40 s，共45 個(gè)循環(huán)，72℃再延伸7 min，最后降至4℃。

1.5 A-FABP 基因的克隆與測(cè)序及生物信息學(xué)分析 對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，通過T 載體連接試劑盒將目的基因連接到p MD19-T 載體上，具體步驟見pGM-T克隆試劑盒[11]；轉(zhuǎn)化DH5ɑ 感受態(tài)細(xì)胞，搖菌，培養(yǎng)12 h 后，PCR 檢測(cè)后獲得的陽性克隆產(chǎn)物，送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

利用DNAMAN 軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)[11]；采用MEGA 4.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹；利用DNAstar 中的Protean程序?qū)-FABP 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)；高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用（http://www.expasy.org/seissmod/swissmod-el.html）；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)采用STRING 在線軟件進(jìn)行構(gòu)建。

1.6 A-FABP 基因的表達(dá)規(guī)律與統(tǒng)計(jì)分析 反應(yīng)體系（20 μL）：iTaqUniwersal SYBR Green Supermix 10 μL，RNAfree Water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40 個(gè)循環(huán)[11]。每個(gè)樣品設(shè)置3 次重復(fù)，采用2-ΔΔCT值法計(jì)算各樣本中A-FABP相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH 的表達(dá)量。利用SPSS 17.0 軟件t 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示[11]。

1.7 A-FABP 基因PCR-SSCP 基因分型及其肌內(nèi)脂肪含量統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行硝酸銀染色。操作流程：取2 μLPCR 產(chǎn)物、8 μL 配置好的變性緩沖液[98%去離子甲酰胺、10 mmol/L EDTA （pH 8.0）、0.025%二甲苯氰FF、0.025%嗅酚藍(lán)]加到PCR 管內(nèi)，98℃變性6 min，變性后冰浴10 min，采用14%丙烯酰胺凝膠（Acr: Scr=29 :1)進(jìn)行檢測(cè)，180 V 電泳10 h 結(jié)束后銀染。

統(tǒng)計(jì)圖譜中各基因型的數(shù)量，利用PopGen32 軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）；通過c2 適合性檢驗(yàn)檢測(cè)群體內(nèi)基因型分布是否符合哈德-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律；根據(jù)固定效應(yīng)模型，應(yīng)用SPSS 17.0 軟件分析A-FABP基因不同基因型對(duì)肉質(zhì)性狀的影響效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 A-FABP 基因和GAPDH 基因的PCR 擴(kuò)增 由圖1 可知，引物擴(kuò)增的條帶清晰且單一，A-FABP 基因產(chǎn)物大小分別為576 bp 和200 bp，GAPDH 基因產(chǎn)物為104 bp，與目的片段大小一致，表明引物特異性強(qiáng)，可以用于后續(xù)的克隆測(cè)序以及熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。

2.2 A-FABP 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明A-FABP 基因CDS 序列全長(zhǎng)399 bp，編碼132 個(gè)氨基酸，利用softberry 在線網(wǎng)站構(gòu)建DNA 序列可視化3D結(jié)構(gòu)，如圖2 所示。通過DNAMAN 軟件對(duì)獲得的布萊凱特黑牛A-FABP 基因CDS 序列與牛（100.00%）、瘤牛（99.25%）、水牛（98.25%）、野豬（89.97%）、山羊（96.24%）、綿羊（95.99%）、人（89.47%）、大鼠（70.64%）和原雞（72.68%）進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除大鼠（70.64%）和原雞（72.68%）外，黑牛與其他脊椎動(dòng)物的同源性均大于80%；采用 UPGMA 法對(duì)各物種進(jìn)行聚類分析（圖3），結(jié)果顯示布萊凱特黑牛與牛、瘤牛和水牛相距最近，其次與綿羊、山羊相距較近；原雞與上述動(dòng)物相距最遠(yuǎn)。

2.3 A-FABP 基因編碼蛋白的特征分析 布萊凱特黑牛A-FABP 蛋白的分子式為C646H1043N171O201S8，分子量為21 907.97，其等電點(diǎn)5.52，說明是偏酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為50.14；脂溶性指數(shù)為82.58，大于60，蛋白流動(dòng)性大；總平均親水性為-0.198，即水溶性蛋白；其摩爾消光系數(shù)為14 105。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)的 C-值、S-值、Y-值和D-值均小于0.5，期望跨膜螺旋數(shù)為0。A-FABP 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示A-FABP蛋白以 α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，含有少量的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。利用SWISS-MODEL 對(duì)A-FABP 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果見圖4。利用STRING 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（圖5），圓圈代表蛋白質(zhì)，該蛋白與同家族的FABP1、FABP6 蛋白互通性最好，其次是LIPE、PLIN1、PPARG 蛋白互通性較好。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

圖2 A-FABP DNA 序列可視化3D 結(jié)構(gòu)

圖3 A-FABP cDNA 序列構(gòu)建的UPGMA 系統(tǒng)發(fā)生樹

圖4 A-FABP 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果 由圖6 可知，A-FABP 和GAPDH 基因熔解曲線峰值單一、無雜峰，未發(fā)現(xiàn)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的情況，可知引物設(shè)計(jì)特異性良好，可用于下一步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 A-FABP 基因在不同組織中的表達(dá)分析 圖7-A 顯示， A-FABP 在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，其次是腎臟，均高于等其他組織（P＜0.01）；A-FABP 在胰腺、甲狀腺、肺臟、脾臟、睪丸、肝臟、心臟中表達(dá)量逐漸降低且差異不顯著。

圖5 差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 A-FABP 基因和GAPDH 基因熒光定量擴(kuò)增曲線（A）和熔解曲線（B）

圖7 A-FABP 在不同組織（A）及不同時(shí)期背最長(zhǎng)?。˙）中的表達(dá)水平

由圖7-B 可知，A-FABP 在4 個(gè)不同時(shí)期背最長(zhǎng)肌中均有表達(dá)，2 月齡的表達(dá)量最高且高于其他3 個(gè)時(shí)期（P＜0.01）； 6、10、12 月齡的表達(dá)量差異不顯著，隨著月齡的增加A-FABP 的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。2.6 A-FABP 基因基因型及基因頻率的分布 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR-SSCP 后帶型分布見圖8，擴(kuò)增區(qū)發(fā)現(xiàn)3 種帶型，即AA、BB、AB 基因型，2 種等位基因A、B。在黑牛第1 內(nèi)含子區(qū)存在多態(tài)性（表2），優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，其等位基因頻率為0.651。根據(jù)c2 獨(dú)立性檢驗(yàn)矯正公式，檢驗(yàn)表明黑?；蝾l率和基因型頻率符合哈德-溫伯格平衡（P＞0.05）。

2.7 A-FABP 基因不同基因型與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析 由表3 可知，AA、AB、BB 基因型肌內(nèi)脂肪含量均值較高，肌內(nèi)脂肪含量關(guān)系為AA＞BB＞AB，AB 基因型低于其他基因型（P＜0.05）；在大理石花紋評(píng)分方面，不同基因型差異不顯著。

圖8 布萊凱特黑牛A-FABP 基因PCR-SSCP 檢測(cè)圖

表2 布萊凱特黑牛A-FABP 基因PCR-SSCP 基因分型及基因頻率

表3 不同基因型肌內(nèi)脂肪含量和大理石花紋評(píng)分均值

3 討 論

3.1 A-FABP 基因克隆與生物信息學(xué)分析 本研究結(jié)果顯示，A-FABP 基因CDS 序列全長(zhǎng)為399 bp，具有完整的閱讀框，編碼132 個(gè)氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)，不同來源的A-FABP 在CDS 序列上具有較高的同源性，其中與牛、瘤牛、山羊、綿羊、人均大于80%，說明該基因CDS 序列在脊椎動(dòng)物中相對(duì)保守，在進(jìn)化過程中具有高度保守性，與“重要功能蛋白氨基酸置換率較低”[12]的理論一致。生物信息學(xué)分析顯示，A-FABP 蛋白偏酸性，表現(xiàn)親水性，說明該蛋白為水溶性蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)很容易接近水分子[13]。二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，α- 螺旋和無規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件，含有少量 β-折疊，易于形成球狀蛋白，屬于all-alpha 型[14]，蛋白質(zhì)的水溶性較好，這與上述預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)基本性質(zhì)中的總平均親水性相一致。A-FABP 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)均以一條多肽鏈構(gòu)成，呈桶狀，說明該基因編碼蛋白的功能區(qū)域在進(jìn)化過程中保守性較強(qiáng)。該結(jié)果符合“多基因家族的協(xié)同進(jìn)化”[15]理論，與上述同源比對(duì)中揭示的物種進(jìn)化關(guān)系相一致。

3.2 A-FABP 基因相對(duì)定量表達(dá)分析 脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族，其家族包括至少9 種蛋白，早期研究發(fā)現(xiàn)該家族蛋白在細(xì)胞脂肪酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物中A-FABP 蛋白主要在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，參與甘油三酯形成，調(diào)控脂肪沉積[16]，推測(cè)參與肌內(nèi)脂肪沉積的相關(guān)調(diào)控過程。本研究發(fā)現(xiàn)，A-FABP 在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，其次為腎臟，在胰腺、甲狀腺、肺臟、脾臟、睪丸、肝臟、心臟中表達(dá)量低且差異不顯著，這與研究豬A-FABP 基因的表達(dá)差異性比較時(shí)其主要沉積于肌肉組織中的結(jié)果相一致[17]。鄺良德等[18]指出，除脂肪組織外，A-FABP 可在九龍牦牛的骨骼肌、腎、脾中檢測(cè)到表達(dá)。榮光輝等[19]研究發(fā)現(xiàn)，北京鴨 A-FABP 基因主要在脂肪組織中表達(dá)。本研究選取組織有限，9 種組織A-FABP 在背最長(zhǎng)肌表達(dá)量最高，其是肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)基因，A-FABP 基因的脂肪沉積形式及部位存在差異性，還需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A-FABP 在2月齡的表達(dá)量最高，12 月齡的表達(dá)量最低，隨著月齡增加A-FABP 表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)。周志楠等[20]研究發(fā)現(xiàn)，巨型玫瑰冠雞不同時(shí)期A-FABP 基因的 mRNA 表達(dá)量也隨著周齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；晁珊珊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，幼魚A-FABP 基因表達(dá)水平顯著高于較大的魚和成魚，A-FABP 基因表達(dá)隨著魚類的發(fā)育呈下降趨勢(shì)。綜上推測(cè)，A-FABP 基因在布萊凱特黑牛肌內(nèi)脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用。

3.3 A-FABP 基因不同基因型與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析 Gerbens 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，梅山豬A-FABP 基因的多態(tài)性與背最長(zhǎng)肌上的肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，秦川牛A-FABP 的突變與肉質(zhì)性狀指標(biāo)相關(guān)[22]。由上述研究成果推測(cè)，該基因可以作為肉牛肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇的候選基因。本研究發(fā)現(xiàn)，在黑牛第1內(nèi)含子區(qū)存在多態(tài)位點(diǎn)，對(duì)肌內(nèi)脂肪含量影響顯著，AA＞AB＞BB，表明AA 基因型對(duì)肌內(nèi)脂肪含量影響顯著。近期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白豬A-FABP 與肌內(nèi)脂肪含量存在顯著相關(guān)[23]；蘇姜豬、姜曲海豬、長(zhǎng)白豬群體A-FABP的遺傳多態(tài)性對(duì)肉質(zhì)性狀的影響顯著[24]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜上表明A-FABP 與肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)，對(duì)調(diào)控肌內(nèi)脂肪含量發(fā)揮重要作用，可以作為肉質(zhì)性狀的候選基因。

本實(shí)驗(yàn)中，不同基因型大理石花紋評(píng)分差異不顯著。周國利等[25]利用PCR-RFLP 技術(shù)對(duì)魯西黃牛研究發(fā)現(xiàn)，A-FABP 對(duì)大理石花紋的影響不顯著。高妍等[26]研究黑豬和白豬A-FABP 基因的遺傳多態(tài)性，結(jié)果證實(shí)A-FABP 基因與大理石紋顯著相關(guān)，與本研究結(jié)果不一致。分析原因可能是：一是實(shí)驗(yàn)用牛的品種不同，與遺傳背景有很強(qiáng)的相關(guān)性；二是大理石花紋的等級(jí)評(píng)分具有個(gè)人的主觀判斷性，不同的評(píng)定者對(duì)同一塊肉的評(píng)分會(huì)有一定的差異；三是采用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)可能不同，具體差異分析有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上推測(cè)，A-FABP 基因參與布萊凱特黑牛肌內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)過程，對(duì)調(diào)控脂肪的沉積發(fā)揮重要作用，可作為肉質(zhì)性狀的輔助標(biāo)記基因，為布萊凱特黑牛的選育提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。