胡 浪，劉燁蓉，許偉釗，王 璐，胡章立，王江新，雷安平

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060

實驗室馴化是指生物為適應(yīng)人工環(huán)境而改變其遺傳性狀的過程[1].實驗室馴化可被用來獲得特殊的突變體，例如，通過實驗室馴化，成功獲得了丁醇耐受的藍藻[2].另一方面，由于實驗室條件可控，實驗室馴化可以用來研究一些不適合在野外和其他復(fù)雜環(huán)境中研究的問題，如生物的“雙面下注”策略[3]和適合度的動態(tài)變化[4].“雙面下注”是高等生物在逆境條件下常采用的一種應(yīng)對策略，它是指當(dāng)存在滅種風(fēng)險時，高等生物不會將種群延續(xù)的希望全寄托于某一特定類型的后代，而是將希望寄托于多種不同類型的后代[5].例如，一年生植物會產(chǎn)生推遲發(fā)芽和立即發(fā)芽兩種不同類型的種子，立即發(fā)芽的種子能更快形成植株，而推遲發(fā)芽的種子則可以幫助植物順利度過逆境時期[5].藍藻是一類古老的原核生物，但它們能以類似于高等植物光合作用的方式固定二氧化碳[6]，這類原核生物在受到脅迫時是否也會使用“雙面下注”的策略來確保種群的延續(xù)，目前尚不清楚.

藍藻可分為固氮藍藻和非固氮藍藻.氮元素是核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的組成元素，它調(diào)控光合作用、生長與發(fā)育等多種生命過程，被稱為生命元素[7-8].缺氮會影響農(nóng)作物產(chǎn)量[9]，研究長期缺氮脅迫對生物代謝的影響，對解析缺氮條件下的生物適應(yīng)機制、開發(fā)氮利用率高的農(nóng)作物具有重要意義.在受到缺氮脅迫時，固氮藍藻可利用空氣中的氮氣來緩解缺氮環(huán)境帶來的壓力[10]，因此，在研究缺氮脅迫對生物代謝的影響時，固氮藍藻不能用作研究材料.非固氮藍藻不能利用空氣中的氮氣，只能利用環(huán)境中的化合態(tài)氮，集胞藻Synechocystissp. PCC6803是非固氮藍藻的模式生物，具有易于培養(yǎng)、繁殖快、遺傳背景清晰、遺傳操作簡單等特點[11-12]，是研究缺氮對生物代謝影響的適宜材料[13].然而，尚未見通過實驗室馴化來獲得能夠耐受缺氮脅迫的集胞藻的報道.

代謝組可以提供有關(guān)生物代謝網(wǎng)絡(luò)的信息.由于細胞內(nèi)酶促反應(yīng)的速率直接受代謝物濃度的調(diào)控，代謝組被認(rèn)為比其他組學(xué)更能反映生物的生理變化[14].氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)可以同時檢測氨基酸、脂肪酸和糖類等多種小分子，具有靈敏性高、選擇性好等優(yōu)點[15]，常用于代謝組的檢測. WANG等[14]利用GC-MS分析了多個Synechocystissp. PCC6803鹽敏感突變體的代謝組，并成功鑒定了每個突變體的特異代謝模塊，表明GC-MS能夠用于解析藍藻代謝組的變化.

本研究以非固氮藍藻集胞藻Synechocystissp. PCC6803為實驗材料，通過長達615 d的缺氮實驗室馴化獲得了8株缺氮馴化株.用GC-MS檢測這些馴化株的代謝組，分析它們的代謝模式，以此探究藍藻在缺氮條件下的進化規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 藻株與培養(yǎng)條件

集胞藻Synechocystissp. PCC6803由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供.培養(yǎng)溫度為30 ℃，光照強度為30 μmol/(m2s)，光暗周期比為12 h∶12 h，正常培養(yǎng)時選用BG11培養(yǎng)基(培養(yǎng)基含1.5 g/L NaNO3)[16]，缺氮培養(yǎng)選用1/3 N BG11培養(yǎng)基(NaNO3的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.5 g/L)或1/20 N BG11培養(yǎng)基(NaNO3的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.075 g/L)，無氮培養(yǎng)時選用-N BG11培養(yǎng)基(不含NaNO3).

1.2 缺氮條件下的實驗室馴化

從野生型Synechocystissp. PCC6803固體平板上隨機挑選1個單克隆，將其接種到液體BG11培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將培養(yǎng)物分為9份，分別轉(zhuǎn)移到12孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每個培養(yǎng)孔的體積為3 mL，其中8個作為缺氮馴化株，1個作為對照株. 缺氮馴化株和對照株來源于同一個單克隆，遺傳背景相同.缺氮馴化株采用-N BG11培養(yǎng)基和1/3 N BG11培養(yǎng)基交替培養(yǎng).培養(yǎng)開始時，730 nm處的光密度D(730)=0.05. 細胞先在-N BG11培養(yǎng)基中缺氮脅迫9 d，離心收集后轉(zhuǎn)入1/3 N BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d，如此反復(fù).對照株始終用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接時間與缺氮馴化株一致.每次轉(zhuǎn)接后取部分樣品鏡檢并用10%的二甲基亞砜凍存保種，若發(fā)現(xiàn)污染則舍棄所有當(dāng)前批次樣品，隨后的馴化實驗以最近一次保種的未受污染的樣品繼續(xù)進行.

1.3 生長曲線和比生長速率

培養(yǎng)時每兩天測定一次培養(yǎng)物的D(730)， 靜置培養(yǎng)至平臺期并繪制生長曲線.生長實驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù).比生長速率的計算公式[17]為

(1)

其中，t2和t1為對數(shù)生長期中的兩個給定的時間點；N2和N1為t1和t2對應(yīng)的D(730)， 用lnN與t作線性回歸分析，回歸直線的斜率即為比生長速率.

1.4 基于氣相色譜-質(zhì)譜的代謝組檢測

將對照株和馴化株接種到1/3 N BG 11中，起始D(730)為0.05，培養(yǎng)12 d后顯微計數(shù)，取1×108個細胞提取代謝組，用GC-MS對代謝組進行檢測.實驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù).代謝組的提取方法及GC-MS的檢測條件參考文獻[18].細胞經(jīng)4 ℃、8 000 g離心收集，用雙蒸水洗滌3次，加入1 mLV(甲醇)∶V(氯仿)∶V(水)=10∶3∶1的混合液，反復(fù)凍融5次后4 ℃、 15 000 g 離心3 min，收集上清液.取200 μL上清液與20 μL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氘標(biāo)記的琥珀酸(氘標(biāo)記的琥珀酸用作GC-MS檢測時的內(nèi)標(biāo))混合，旋轉(zhuǎn)真空干燥儀干燥后將沉淀溶于20 μL質(zhì)量濃度為20 mg /mL的甲氧基胺鹽酸鹽，30 ℃孵育90 min后加入90 μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺，37 ℃孵育30 min，最后4 ℃、15 000 g離心3 min得到衍生化的代謝物.衍生化的代謝物用配有HP-5MS毛細管柱(30m×250 mm)的7890A-MSD5975C系統(tǒng)檢測.樣品在230 ℃、無分流模式下進樣.載氣為氦氣，流速控制在1 mL/min.毛細管柱首先在45 ℃恒溫2 min，后升溫至280 ℃，升溫速率為5 ℃/min，最后280 ℃恒溫2 min.采用自動質(zhì)譜處理識別系統(tǒng)(automated mass spectral deconvolution identification system, AMDIS)對質(zhì)譜峰進行分析.通過將數(shù)據(jù)與美國標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所(national institute of standards and technology, NIST)的質(zhì)譜庫比對，來對化合物進行鑒定，最后去除匹配質(zhì)量低(得分小于70)的化合物.本研究使用的代謝物分析為相對定量分析，代謝物的響應(yīng)面積與內(nèi)標(biāo)(氘標(biāo)記的琥珀酸)的響應(yīng)面積的比值為代謝物的相對響應(yīng)面積.

1.5 分層聚類分析

根據(jù)樣品的代謝組用歐氏距離計算樣品間的鄰近矩陣，使用組間連鎖的方法對樣品進行分層聚類，分層聚類由SPSS20.0軟件完成.

1.6 統(tǒng)計分析

采用Leveve法作方差齊性檢驗，采用SPSS20.0軟件對樣品的比生長速率進行單因素方差分析(one-way analysis of variance, One-way ANOVA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法.

圖1 集胞藻Synechocystis sp. PCC6803在不同氮濃度培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of Synechocystis sp. PCC6803 in mediums with different nitrogen concentrations

2 實驗結(jié)果及分析

2.1 實驗室馴化氮濃度的選擇

在進行實驗室馴化之前，需要確定合適的氮濃度來進行馴化.野生型Synechocystissp. PCC6803在BG11培養(yǎng)基、1/3 N BG11培養(yǎng)基、1/20 N BG11培養(yǎng)基和-N BG11培養(yǎng)基中的生長曲線見圖1.用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)Synechocystissp. PCC6803時，D(730)隨培養(yǎng)時間的延長而增加，到12 d 時D(730)達到(1.76±0.06).當(dāng)用1/20 N BG11培養(yǎng)基和-N BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)時，D(730)不隨培養(yǎng)時間的延長而增加，表明Synechocystissp. PCC6803不能在這兩種培養(yǎng)基中生長.當(dāng)用1/3 N BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)Synechocystissp. PCC6803時，D(730)也隨培養(yǎng)時間延長而增加，但增加幅度小于用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng).用1/3 N BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d 時，D(730)僅為(1.27±0.13)，表明在1/3 N BG11培養(yǎng)基中，Synechocystissp. PCC6803能夠生長，但生長受到抑制.為保證實驗室馴化中Synechocystissp. PCC6803既能生長，又受到缺氮抑制，本研究選用1/3 N BG11培養(yǎng)基和-N BG11培養(yǎng)基交替培養(yǎng)藻細胞.

2.2 馴化株與對照株在缺氮脅迫條件下的生長

經(jīng)過615 d的實驗室馴化，獲得了8株缺氮馴化株(NS1～NS8)和1株對照株(CT).為研究長期缺氮對集胞藻生長的影響，比較了馴化株和對照株在缺氮條件下(1/3 N BG11培養(yǎng)基)的生長(圖2)，對照株和馴化株在培養(yǎng)初期均沒有明顯的滯后期，它們均在第16 d達到各自的最大D(730). 圖3顯示了馴化株和對照株在1/3 N BG11培養(yǎng)基中的比生長速率，樣品上方含相同字母表明樣品間比生長速率無顯著差異，不含相同字母表明樣品間比生長速率差異顯著.對照株在1/3 N BG11培養(yǎng)基中的比生長速率為0.23±0.01 /d，對照株與馴化株的比生長速率差異不顯著(p>0.05). 馴化株的比生長速率在(0.22～0.24)/d，其中，NS1、NS2、NS3、NS7和NS8的比生長速率相對較高，NS4、NS5和NS6的比生長速率相對較低.馴化株NS1、NS7和NS8的比生長速率顯著高于NS4、NS5和NS6(p<0.05)， 馴化株NS6的比生長速率顯著低于NS1、NS2、NS7和NS8(p<0.05)(圖3).

圖2 馴化株(NS1-NS8)和對照株(CT)在1/3 N BG11培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 Growth curves of nitrogen deficiency-generated strains (NS1-NS8) and control strain (CT) in 1/3 N BG11 medium

圖3 馴化株(NS1-NS8)和對照株(CT)在1/3 N BG11培養(yǎng)基中的比生長速率(μ)Fig.3 Specific growth rates (μ) of nitrogen deficiency-generated strains (NS1-NS8) and control strain (CT) in 1/3 N BG11 medium

2.3 基于氣相色譜-質(zhì)譜的代謝組檢測及分層聚類分析

為了研究長期缺氮對藻株代謝組的影響，利用GC-MS對這些藻株的代謝物進行了檢測，共鑒定到52種代謝物，主要為氨基酸、脂肪酸、糖及其衍生物(代謝物的相對響應(yīng)面積請掃描論文末頁右下角二維碼).對這些藻株進行分層聚類分析，以揭示藻株代謝組的相似性(圖4).圖4中樣品用“-”把藻株和生物學(xué)重復(fù)間隔開，例如，CT-1代表對照株CT的第1個生物學(xué)重復(fù)，NS6-2代表馴化株NS6的第2個生物學(xué)重復(fù).結(jié)果顯示樣品聚集形成3個聚類，其中比生長速率較高的馴化株NS1、NS2、NS3、NS7和NS8形成一個聚類(A簇)，比生長速率較低的馴化株NS4、NS5和NS6形成一個聚類(B簇)，對照株形成另外一個聚類(C簇)，這些結(jié)果表明實驗室馴化產(chǎn)生了兩種代謝模式不同的馴化株.

圖4 以代謝組為基礎(chǔ)的樣品分層聚類Fig.4 Hierarchical cluster of samples based on their metabolic compositions

3 討 論

本次實驗室馴化共獲得8個缺氮馴化株，所有馴化株的比生長速率與對照株無顯著差異，表明長期缺氮馴化不會提高Synechocystissp. PCC6803的生長.然而，本課題組前期用含有丁醇的培養(yǎng)基馴化Synechocystissp. PCC6803，成功獲得了丁醇耐受的馴化株[2].這兩次實驗室馴化效果不同可能是由選擇壓力不同所致，缺氮馴化株的生長沒有提高，因此不會增加營養(yǎng)鹽的消耗，推測在營養(yǎng)鹽缺乏的環(huán)境下更有利于種群的延續(xù).

GC-MS可以檢測細胞內(nèi)多種代謝物[15]，因此能夠用于發(fā)現(xiàn)代謝的細微變化.本研究利用GC-MS檢測缺氮馴化株的代謝組時，共檢測到52種代謝物，本課題組前期在Synechocystissp. PCC6803鹽敏感突變株中檢測到60種代謝物[14].這兩項研究檢測到的代謝物數(shù)量相當(dāng)、種類相似，可能是因為它們使用的實驗材料都是由野生型Synechocystissp. PCC6803衍生而來.

用分層聚類分析樣品代謝組相似性時發(fā)現(xiàn)，雖然馴化株的比生長速率與對照株無顯著差異，但馴化株的代謝組卻不同于對照株，表明實驗室馴化會對細胞代謝產(chǎn)生影響.另外，比生長速率較高的馴化株(NS1、NS2、NS3、NS7和NS8)的代謝組，不同于比生長速率較低的馴化株(NS4、NS5和NS6)，表明實驗室馴化最終產(chǎn)生了2種代謝模式不同的馴化株.缺氮脅迫下Synechocystissp. PCC6803形成不同代謝模式的后代，類似于逆境條件下，一年生植物產(chǎn)生不同類型的種子[5]，表明藍藻這類原核生物在受到脅迫時，也會使用“雙面下注”的策略來確保種群的延續(xù).野生型Escherichiacoli不能利用檸檬酸只能利用葡萄糖，與此類似，BLOUNT等[19]用缺乏葡萄糖但富含檸檬酸的培養(yǎng)基馴化E.coli， 最終也獲得了兩種不同代謝模式的馴化株(一種能高效利用葡萄糖，另外一種能利用檸檬酸).

本課題組曾經(jīng)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)缺氮脅迫會增加Synechocystissp. PCC6803細胞間基因表達的差異[20]，推測在實驗室馴化過程中，長期缺氮提高了細胞間基因表達的差異，最終產(chǎn)生了兩種不同代謝模式的馴化株.解析不同代謝模式的遺傳基礎(chǔ)，則需進一步對馴化株進行基因組重測序，以便發(fā)現(xiàn)基因組層面上的差異[21]；另外，缺氮脅迫會影響Synechocystissp. PCC6803的DNA甲基化修飾模式，利用DNA甲基化測序技術(shù)來探究馴化株的表觀修飾變化也很有必要[22].

結(jié) 語

本研究表明Synechocystissp. PCC6803在應(yīng)對長期的缺氮脅迫時，會產(chǎn)生不同代謝模式的后代，以此來增加種群延續(xù)的可能，該結(jié)果有助于增加對藍藻缺氮脅迫下適應(yīng)機制的理解.