趙銳名　成小英

摘要?[目的]?探討產(chǎn)鐵細菌對芒草鉛吸收特性的影響。[方法]?從土壤中分離產(chǎn)鐵載體細菌，并進行土壤pH影響芒草鉛富集試驗和產(chǎn)鐵載體細菌影響芒草促生特性試驗。[結(jié)果]?pH值越接近7，植株生物量、株高生長勢越強，葉片、根系對鉛的吸收能力越弱;鉛脅迫下添加產(chǎn)鐵載體細菌均提高了芒草植株的葉、根重量及其總干重、根冠比、株高，使根系含鉛量下降，葉片含鉛量在400、600?mg/kg脅迫下也顯著下降。[結(jié)論]?產(chǎn)鐵載體細菌可提高鉛脅迫下芒草抗逆性，降低富集量，應(yīng)用價值高。

關(guān)鍵詞?芒草;產(chǎn)鐵細菌;鉛脅迫;促生性

中圖分類號?Q945.78文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）16-0093-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.027

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Growth?Promoting?Properties?of?Siderophore?producing?Bacteria?on?the?Seedlings?of?Miscanthus?sinesis?under?Lead?Stress

ZHAO?Rui?ming1，2，3，?CHENG?Xiao?ying1，2，3

（1.School?of?Environment?and?Civil?Engineering，?Jiangnan?University，?Wuxi，?Jiangsu?214122;2.Jiangsu?Key?Laboratory?of?Anaerobic?Biotechnology，Wuxi，?Jiangsu?214122;3.Jiangsu?Province?Water?Treatment?Technology?and?Materials?Collaborative?Innovation?Center，?Suzhou，Jiangsu215000）

Abstract?[Objective]?To?study?the?effects?of?siderophore?producing?bacteria?on?lead?absorption?characteristics?of?Miscanthus?sinesis.?[Method]?Siderophore?producing?bacteria?were?separated?from?the?soil，?then?the?effects?of?soil?pH?on?lead?bioaccumulation?characters?and?the?effects?of?siderophore?producing?bacteria?on?growth?promoting?properties?of?Miscanthus?sinesis?were?studied.?[Result]?The?growth?potential?of?biomass?and?height?became?stronger?and?the?lead?absorptive?capacity?of?leaf?and?root?became?weaker?when?pH?was?close?to?7.?The?addition?of?siderophore?producing?bacteria?under?lead?stress?increased?the?leaf，?root?weight?and?total?dry?weight?of?Miscanthus?sinesis?plants.?The?root?shoot?ratio?and?plant?height?decreased?the?lead?content?in?roots，?and?the?lead?content?in?leaves?decreased?significantly?under?the?stress?of?400?and??600?mg/kg.[Conclusion]?Siderophore?producing?bacteria?could?improve?stress?resistance?of?Miscanthus?sinesis?under?lead?stress，?meanwhile，?it?could?also?reduce?lead?concentration?of?enrichment?which?had?higher?application?value.

Key?words?Miscanthus?sinesis;Siderophore?producing?bacteria;Lead?stress;Growth?promoting?activity

環(huán)境污染問題已成為當今社會普遍關(guān)注的生態(tài)問題之一，日益受到人們關(guān)注[1-3]。而隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的迅猛發(fā)展，重金屬廢棄物源源不斷進入人們賴以生存的環(huán)境，嚴重污染了土壤、水質(zhì)和大氣，導致環(huán)境惡化，土壤重金屬污染加劇[4]。鉛是毒性極高的神經(jīng)毒物，是常見重金屬污染物之一，而頻繁的采礦、冶煉等活動也使大量鉛進入陸地表層生態(tài)系統(tǒng)，既對環(huán)境造成了污染，又給生態(tài)安全造成了威脅[5]。研究表明，鉛對植物生長發(fā)育、生理代謝、產(chǎn)量、品質(zhì)等均會造成顯著負面影響，鉛易通過食物鏈進行富集，對人體神經(jīng)、消化、免疫和生殖系統(tǒng)甚至可造成嚴重影響[6-8]，使人類的生命健康受到威脅。因此，重金屬污染及其修復一直是國內(nèi)外研究者重點關(guān)注的研究方向之一。

土壤修復技術(shù)是針對土壤重金屬污染而涌現(xiàn)的現(xiàn)代手段，可分為物理修復、化學修復和生物修復3種。生物修復是近年發(fā)展起來的一種新興技術(shù)，潛力巨大，其較傳統(tǒng)修復技術(shù)處理費用低、環(huán)境干擾小、?不產(chǎn)生二次污染，具有經(jīng)濟性、有效性和非破壞性等特點，應(yīng)用前景廣闊[9]。微生物可通過自身代謝活動及其代謝產(chǎn)物溶解重金屬，提高其生物有效性，促進植物對重金屬的吸收，同時還可通過分泌植物激素使植物生長旺盛、生物量增加、土壤重金屬污染修復效率提高[10-11]。微生物產(chǎn)鐵載體對鐵元素親和力強，可螯合Fe3+、Pb2+、Al3+等金屬離子，形成大分子而留在細胞外，以提高修復植物對重金屬的耐受能力[12-14]。

芒草（Miscanthus?sinesis）隸屬于禾本科黍亞科高粱族甘蔗亞族芒屬，是一類多年生高大草本植物，因其具有生物質(zhì)產(chǎn)量高、水肥消耗低、環(huán)境適應(yīng)性強等優(yōu)勢而備受關(guān)注[15]。芒草在我國分布廣泛，有的種植區(qū)也常常受到鉛污染。然而，目前關(guān)于鉛對芒草生長發(fā)育的影響以及產(chǎn)鐵載體細菌對提高芒草吸收土壤鉛的能力都鮮見報道。為此，筆者擬篩選芒草根際土壤中產(chǎn)鐵能力較強的細菌，對其影響芒草吸收鉛的特性進行研究，以期為鉛污染土壤的生物修復提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試土樣采集。2017年5月采集坡向和地勢平緩一致的地段周圍生長正常、無病蟲害的芒草植株，按照“S”形取樣法進行采集。采集時，先在植株周圍5?cm處畫一個規(guī)整的圓形，用鐵鍬慢慢挖出芒草植株，將整個植株連同根際土壤一起用聚乙烯塑料袋包裹嚴實，置于冰盒中，迅速帶回實驗室，并進行根際土壤取樣工作。土壤取樣在超凈工作臺上進行，避免污染，將取好的土樣進行封裝，備用。

1.1.2

培養(yǎng)基。采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）進行菌株的分離、純化和保種，該培養(yǎng)基中含蛋白胨10?g/L、牛肉浸膏?5?g/L、NaCl?10?g/L，pH?7.0～7.2，在115?℃下滅菌20?min。固體平板在液體LB的基礎(chǔ)上再添加2%的瓊脂。

1.2?方法

分離并篩選產(chǎn)鐵載體細菌。芒草根際土壤細菌的分離采用稀釋平板涂布法[16]。稱取鮮土樣10?g，溶于?100?mL已滅菌的去離子水中，在28?℃、145?r/min下培養(yǎng)?30?min，之后進行稀釋。吸取上清液50?μL，均勻涂抹在CAS平板上，置于培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)48?h，反復鏡檢以獲得純培養(yǎng)根際細菌樣本。所獲得的細菌用-20?℃下的牛肉膏斜面和-80?℃下的30%甘油中。產(chǎn)鐵細菌的篩選采用CAS檢測法，以菌斑周圍產(chǎn)生黃色暈圈作為產(chǎn)鐵載體陽性細菌篩選的主要參考指標[17]，記錄黃色暈圈產(chǎn)生時間、顏色、大小、形態(tài)特征等，分析細菌分泌鐵載體的能力，以定性篩選出產(chǎn)鐵載體能力強的菌株。

1.3?芒草盆栽試驗

1.3.1

土壤pH影響芒草鉛富集試驗。首先通過預備試驗測試產(chǎn)鐵載體細菌對Pb2+的耐受能力。土壤pH對土壤中金屬元素的生物可利用性影響較大，因此設(shè)計以下試驗來進行探討：設(shè)置盆栽芒草蛭石基質(zhì)中的Pb2+濃度為600?mg/kg，pH梯度分別為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，測試不同pH下芒草對鉛的富集特性。每處理10盆，3次重復，共計30盆。

1.3.2

產(chǎn)鐵載體細菌對芒草的促生特性試驗。設(shè)置盆栽芒草蛭石基質(zhì)中Pb2+的濃度分別為0、200、400、600、800、?1?000?mg/kg。先對芒草種子進行表面消毒，并將其浸泡在95%的酒精中30?s，在滅菌的0.1%?HgCl?2?溶液中浸泡?5?min，以無菌水清洗5～6?次。將種子播在1×105?Pa下滅菌30?min的蛭石基質(zhì)中，并噴施植物營養(yǎng)液，進行培養(yǎng)。待植株長出土表2?～3?cm時，在根周圍接種產(chǎn)鐵載體菌懸液（108個細胞）10?mL，表面鋪已滅菌、干燥的石英砂，防止雜菌污染。在光（25℃?17?h）、暗（17℃?7?h）交替的光照培養(yǎng)室中生長60?d，收獲整株植株，進行相關(guān)指標測定。每處理10盆，3次重復，共計30盆。以不接種菌株為對照。

1.3.3

測試方法。將收獲的新鮮植株分別用自來水、去離子水各沖洗3次，先用米尺測量株高，然后將植株根和地上部分分離，在105?℃下殺青30?min，然后轉(zhuǎn)至80?℃烘干至恒重，稱重，并計算根冠比（地下部與地上部的比值）。粉碎，取?0.2?g樣品加入酸液（HNO?3∶H?2SO?4?=?4∶1），用MARS240?微波消解系統(tǒng)消解，冷卻，過濾，濾液保存于塑料瓶中。樣品中的鉛含量（mg/kg干重）用AA-6300原子吸收分光光度計測定。

1.4?數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft?Excel錄入作圖。用SPSS?22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?土壤pH對芒草幼苗生長的影響

2.1.1

對生物量的影響。由圖1可見，隨著pH的升高，葉片干重呈現(xiàn)顯著的上升趨勢，pH?7.0下葉片的干重最大。就根系干重和總生物量（總干重）而言，以pH?5.0和pH?5.5?處理表現(xiàn)相同的趨勢，該2個指標均處于最低水平且二者差異不顯著，而pH?6.5的處理根系干重和總生物量最高（P<005），pH?7.0的處理次之。不同pH處理下芒草幼苗的根冠比排序為pH?6.5>pH?5.0>pH?5.5>pH?7.0>pH?6.0。說明芒草幼苗在pH?6.5的微酸環(huán)境下表現(xiàn)出較好的生長勢，生物量高，根冠比大;而pH越低，生物量越小，對生長發(fā)育影響越大。

2.1.2?對株高的影響。圖2表明，隨著基質(zhì)pH的降低，芒草幼苗的株高呈顯著下降的趨勢（P<0.05），與葉片干重變化趨勢一致。pH?7.0的處理株高最高（96.25?cm），而pH?5.0的處理株高最低（62.14?cm）。表明基質(zhì)pH對芒草幼苗高度影響顯著，pH越低，基質(zhì)酸度越大，對株高的增加越不利。

2.2?土壤pH對芒草幼苗鉛吸收積累的影響

2.2.1?對葉片鉛積累的影響。圖3表明，pH越低，芒草葉片中鉛含量越高，不同處理間呈顯著差異（P<0.05）。表明pH對芒草葉片積累鉛的能力有顯著影響，酸性環(huán)境下更易導致鉛的吸收和積累。

2.2.2?對根系鉛積累的影響。由圖4可見，隨著pH的降低，根系鉛含量表現(xiàn)為與葉片一致的變化趨勢，且不同處理間差異顯著（P<0.05）。說明芒草根系對鉛的吸收和積累也受pH值的影響，酸性環(huán)境可使根系富集更多的鉛。

2.3?添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑對芒草幼苗生長的影響

2.3.1

對生物量的影響。由圖5可看出，隨著Pb2+濃度的

增加，對照和添加菌劑處理的葉、根干重和總生物量均呈逐漸降低的趨勢，但在同一濃度梯度下，添加菌劑處理的這3個指標均顯著高于對照。就根冠比而言，添加菌劑的處理表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，對照的根冠比隨Pb2+的濃度變化則不明顯?？梢姡寥乐蠵b2+的濃度對芒草幼苗生物量積累影響顯著，濃度越高，影響越大;而添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑則可在一定程度上提高其生物量，以應(yīng)對鉛的不利影響。

2.3.2?對株高的影響。由圖6可見，隨著Pb2+濃度的提高，芒草幼苗添加菌劑處理和對照的株高均呈現(xiàn)降低趨勢，在每一濃度梯度下，添加菌劑處理的株高均顯著低于對照。表明Pb2+濃度越高，越不利于芒草幼苗的向上生長，但產(chǎn)鐵載體細菌菌劑可起到在鉛脅迫下增強芒草生長的效果。

2.4?添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑對芒草幼苗鉛吸收積累的影響

2.4.1?對葉片鉛積累的影響。圖7為不同濃度Pb2+脅迫下添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑后芒草幼苗葉片鉛含量的差異。處理和對照的葉片鉛含量均隨著Pb2+濃度的提高呈先上升后下降的趨勢，200?mg/kg的Pb2+濃度下菌劑處理的芒草葉片鉛含量最高，而400?mg/kg的Pb2+濃度下對照葉片的鉛含量則最高。同一Pb2+濃度下不同處理相比，Pb2+濃度為200、800、1?000?mg/kg的處理具有顯著高的葉片鉛含量，而其他濃度下則相反?？梢?，基質(zhì)中Pb2+濃度、是否添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑均對芒草葉片鉛含量有重要影響;添加菌劑可降低一定Pb2+濃度下芒草葉片中鉛的含量。

2.4.2

對根系鉛積累的影響。由圖8可看出，隨著Pb2+濃度的增加，添加菌劑和對照的芒草幼苗根部鉛含量均呈上升趨勢，同一Pb2+濃度下2個處理比較，添加菌劑處理的根系鉛含量均顯著低于對照。以上結(jié)果表明，在Pb2+脅迫下，添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑可減少芒草幼苗根系對鉛的積累。

3?結(jié)果與討論

鐵載體是一種生長在鐵含量較低的環(huán)境中、由微生物合成的、對Fe3+具有高專一性的低分子量鐵螯合劑[18]。產(chǎn)鐵載體細菌對遭受重金屬污染的植物維持正常生理活動有重要作用，緩解離子毒害，降低脅迫程度[19-20]。產(chǎn)鐵載體細菌產(chǎn)生的鐵載體能與一些重金屬離子相結(jié)合，形成螯合物，進而增加植物根系對重金屬的吸收，提高修復土壤的效率。

土壤pH的變化與重金屬積累量關(guān)系密切，其主要影響重金屬在土壤中的存在形態(tài)以及土壤顆粒的表面性質(zhì)。研究表明，鉛主要在酸性條件下實現(xiàn)在沉積物中的釋放，隨著pH的升高，鉛釋放率逐漸降低[21]。翟娜等[22]研究發(fā)現(xiàn)，芥菜地上、地下部分鉛含量受土壤中鉛釋放量影響顯著，含鉛量為地下部分最高，認為鉛在芥菜植株內(nèi)的轉(zhuǎn)移過程中，地下部分積累了較多的鉛;彭克儉等[23]研究表明，在pH為3～7的范圍內(nèi)，龍須眼子菜對鉛的吸附隨pH升高而減少。該研究發(fā)現(xiàn)，隨著pH的升高，芒草幼苗葉片和根系鉛積累量也逐漸降低，與前人的研究結(jié)果一致。積累量降低的原因可能是由于鉛在較高pH的溶液中溶解度降低以致產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象而使其不易被吸附所致。從不同pH下芒草幼苗的生長勢差異可見，pH越低，生長勢越弱;pH越接近中性，生長勢越強;總體上表現(xiàn)為pH?6.5～7.0時生長最好。這進一步驗證了pH影響植物根系對鉛的吸收的論斷，pH越高，植物對鉛的吸附能力越弱，生長表現(xiàn)越好。

盆栽試驗表明，添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑的芒草幼苗在不同濃度鉛脅迫下的葉干重、根干重、總干重、根冠比、株高等指標均較對照顯著增加，表明該菌劑對芒草幼苗促生作用明顯，但不同濃度間的促生效果也有差異。就植株上、下部對鉛的吸收而言，添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑的處理均可使根部鉛積累量降低，吸收減少，其原因可能是產(chǎn)生的鐵載體螯合了基質(zhì)中的Pb2+，進而抑制了芒草植株根部對鉛的吸收，使根部鉛含量降低，與前人在其他重金屬脅迫研究中的結(jié)果一致[24-26]。該研究通過試驗篩選確定的產(chǎn)鐵載體細菌具有改善芒草幼苗根際缺鐵癥狀的作用，產(chǎn)生的螯合鐵可用來攝取鐵元素，進而提高對重金屬鉛的抗性，促進植株生物量的積累和株高的增加。該研究還發(fā)現(xiàn)，400、600?mg/kg鉛濃度處理下添加產(chǎn)鐵載體細菌菌劑可使葉片鉛含量降低，而其他濃度下葉片鉛含量卻較高，表明鉛濃度過高或過低都影響產(chǎn)鐵載體細菌發(fā)揮螯合作用，尤其是濃度過高時可能導致細菌死亡而使螯合作用喪失。

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