潘孝成　沈?qū)W懷　趙瑞宏　戴銀　胡曉苗　侯宏艷　周學利　張丹俊

摘要?為了解安徽省豬流行性腹瀉病毒（porcine?epidemic?diarrhea?virus，PEDV）的遺傳變異，對5株P(guān)EDV安徽流行株M基因進行RT-PCR擴增、序列測定和分析。結(jié)果表明，5株?PEDV?安徽流行毒株M基因的全長均為681?bp，編碼226個氨基酸，核苷酸同源性為?99.1%～99.9%，其與國內(nèi)外PEDV參考毒株核苷酸同源性為96.9%～100%。進化樹分析顯示，5株流行毒株與CV777、attenuated?DR13、LZC和CHS親緣關(guān)系較遠，與2011年后國內(nèi)外PEDV分離株的親緣關(guān)系較近。

關(guān)鍵詞?豬流行性腹瀉;M基因;序列分析

中圖分類號?S852.65+1文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）16-0116-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.034

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning?and?Sequence?Analysis?of?M?Gene?of?5?Epidemic?Strains?of?Porcine?Epidemic?Diarrhea?Virus?from?Anhui?Province

PAN?Xiao?cheng1，2，?SHEN?Xue?huai1，2，?ZHAO?Rui?hong1，2?et?al

（1.Institute?of?Animal?Husbandry?and?Veterinary?Science，?Anhui?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Hefei，Anhui230031;?2.Livestock?and?Poultry?Epidemic?Diseases?Research?Center?of?Anhui?Province，?Hefei，Anhui230031）

Abstract?In?order?to?study?the?genetic?variation?of?porcine?epidemic?diarrhea?virus?（PEDV）?in?Anhui?Province，?M?genes?of?5?epidemic?strains?of?PEDV?isolated?from?Anhui?Province?were?amplified?by?RT?PCR，sequenced?and?analyzed.?The?results?showed?that?the?whole?length?of?M?genes?of?5?epidemic?strains?of?PEDV?isolated?from?Anhui?Province?was?all?681?bp，?which?encoded?226?amino?acids，?the?nucleotide?identity?was?99.1%-99.9%.?M?genes?of?5?epidemic?strains?of?PEDV?isolated?from?Anhui?Province?had?the?homology（96.9%-100%）with?the?reference?strains?of?PEDV?at?home?and?abroad.?Phylogenetic?tree?analysis?indicated?that?5?epidemic?strains?of?PEDV?isolated?from?Anhui?Province?were?far?from?CV777，?attenuated?DR13，?LZC?and?CHS?strains，?but?they?were?close?to?reference?PEDV?strains?isolated?after?2011?from?the?aspect?of?genetic?relationship.

Key?words?Porcine?epidemic?diarrhea;M?gene;Sequence?analysis

豬流行性腹瀉病毒（porcine?epidemic?diarrhea?Virus，PEDV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈有囊膜的RNA病毒，可導致豬的一種以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的傳染病。1971年首次在英國發(fā)現(xiàn)豬流行性腹瀉?。╬orcine?epidemic?diarrhea，PED）[1]，我國內(nèi)地自20世紀80年代初以來陸續(xù)有關(guān)于PEDV分離和鑒定的報道[2-3]。2010年底開始，PED在我國呈暴發(fā)性流行，流行廣泛，主要表現(xiàn)為各年齡段豬均可發(fā)生腹瀉，成年豬一般只表現(xiàn)為腹瀉癥狀，仔豬死亡率高，10日齡內(nèi)仔豬死亡率可達100%，給眾多養(yǎng)豬場（戶）帶來了巨大的經(jīng)濟損失[4-5]。PEDV?M基因由681個核苷酸組成，編碼226個氨基酸。研究表明，M基因與PEDV病毒的組裝和出芽以及誘導α干擾素的產(chǎn)生等有關(guān)[6-7]。筆者對安徽省PEDV安徽流行株的M基因進行了PCR擴增和序列分析，以期為PED的防控提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?主要試劑、材料

RNAiso?Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、pMD-18T載體等均購自TaKaRa公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DH5α、DNA?Marker等購自生工生物工程（上海）股份有限公司;豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（GARV）的抗原快速檢測試劑盒（膠體金試劑）購自BioNote公司。

1.2?病料

病料樣品為刮取的腸道黏膜，采自安徽省境內(nèi)疑似發(fā)生豬流行性腹瀉的豬場（2013—2017年）。發(fā)病仔豬臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉、腸道出血，使用PEDV、TGEV和GARV的膠體金抗原快速檢測試劑盒檢測，結(jié)果為PEDV陽性，TGEV和GARV均為陰性。

1.3?引物合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的PEDV?M基因序列，設(shè)計了1對引物：P?1（5—3）為CCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAAC，P?2（5—3）為GTTTAGACTAAATGAAGCACTTTC，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴增715?bp的基因片段，包含PEDV?M基因全長。

1.4?RNA提取及cDNA合成

刮取發(fā)病仔豬小腸黏膜層，按TaKaRa公司RNAiso?Plus試劑盒說明書提取總RNA，用TaKaRa公司1st?Strand?cDNA?Synthesis?kit進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20?℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5?PCR擴增

以合成的cDNA為模板，用引物對P?1、P?2進行PCR擴增，擴增體系為cDNA?3?μL，10×PCR?buffer??2.5?μL，dNTPs（2.5?mmol/L）2?μL，上下游引物（P?1/P?2）各?1?μL（10?pmol/μL），Ex-Taq酶0.5?μL，ddH?2O?15?μL。PCR擴增程序如下：94?℃?5?min;94?℃?1?min，50?℃?1?min，72?℃??1?min，35個循環(huán);72?℃延伸10?min。電泳鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進行回收，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)入DH5α，將鑒定為陽性的質(zhì)粒送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6?基因序列分析

使用DNA?Star、DNAMAN、Genetyx等軟件，將擴增序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的12個PEDV?分離株的M基因序列進行比對、同源性分析和遺傳進化分析。試驗所用參考毒株序列見表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?RT-PCR擴增結(jié)果和測序結(jié)果

取PEDV膠體金抗原檢測試劑檢測為陽性，且來自安徽省不同地區(qū)7個豬場的樣品用引物對P?1、P?2進行進行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示均擴增出約715?bp的基因片段（圖1），與預期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示，獲得7株P(guān)EDV流行毒株的M基因序列，序列全長均為681個核苷酸，編碼226個氨基酸，其中有2對流行毒株的基因核苷酸序列完全相同，將核苷酸序列不同的5株分別命名為AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH。

2.2?PEDV?M基因核苷酸同源性分析

將該試驗獲得的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）與參考毒株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、CHS、LZC、attenuated?DR13、IA2、S12、MEX-GTO、CV777）進行M基因核苷酸序列同源性分析，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，5株安徽地方流行毒株M基因核苷酸序列同源性為99.1%～99.9%，與經(jīng)典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated?DR13）和2011年前我國分離株（LZC和CHS）序列同源性較低，為?96.9%～98.2%;5株地方流行毒株M基因核苷酸序列與2011年后的國內(nèi)外分離株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12、MEX-GTO）序列的同源性較高，為99.0%～100%，其中同源性最高的是AH-SH與美國分離株IA2以及我國分離株GD-B，均達100%。

2.3?PEDV?M基因遺傳進化分析

將該試驗得到的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）與參考毒株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、CHS、LZC、attenuated?DR13、IA2、S12、MEX-GTO、CV777）的M基因核苷酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，進化樹分為Ⅰ和Ⅱ2個群，I群包括CHS、LZC、attenuated?DR13和CV777，Ⅱ?群包括5株安徽地方流行毒株及GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12和MEX-GTO。這表明5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）與經(jīng)典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated?DR13）和2011年前我國分離株（LZC和CHS）的親緣關(guān)系較遠。

3?討論

該研究對2013—2017年安徽省境內(nèi)經(jīng)膠體金試紙條確認為PEDV感染的7個豬場病料進行PCR擴增，均擴增出序列全長為681個核苷酸PEDV?M基因，將其中苷酸序列不同的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）與參考毒株進行核苷酸序列同源性和遺傳進化分析。結(jié)果表明，5株安徽地方流行毒株間以及它們與2011年后的國內(nèi)外分離株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12、MEX-GTO）的核苷酸序列同源性均較高，分別為99.1%～99.9%和99.0%～100%;它們與經(jīng)典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated?DR13）和2011年前我國分離株（LZC和CHS）的序列同源性較低，為?96.9%～98.2%，親緣關(guān)系也較遠。這說明一方面2011年前后的PEDV分離株存在相對較大的差異，且2011年后?PEDV的國內(nèi)外主要分離株M基因差異不大，這與盧冰霞等[8]、張紅壘等[9]、王隆柏等[10]研究結(jié)果基本一致，另一方面PEDV?M基因具有高度保守性（核苷酸序列同源性為96.9%～100%），2011年后分離株雖然與此前毒株的基因序列存在相對較大差異，但這種差異是否導致了M蛋白功能仍需進一步研究。

參考文獻

[1]?PENSERT?M?B，DE?BOUCK?P.A?new?coronavirus-like?particle?associated?with?diarrhea?in?swine[J].Arch?Virol，1978，58（3）：243-247.

[2]?蔡寶祥.介紹幾種新近發(fā)現(xiàn)的豬傳染病[J].畜牧與獸醫(yī)，1982（5）：218-221.

[3]?芮聰杰，潘孝成，沈?qū)W懷，等.豬流行性腹瀉病毒檢測技術(shù)研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2018，46（25）：22-25.

[4]?劉孝珍，陳建飛，時洪艷，等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2012，34（3）：180-183.

[5]?LI?W?T，LI?H，LIU?Y?B，et?al.New?variants?of?porcine?epidemic?diarrhea?virus，China，2011[J].Emerging?infectious?diseases，2012，18（8）：1350-1353.

[6]?DE?HAAN?C?A?M，KUO?L，MASTERS?P?S，et?al.Coronavirus?particle?assembly：Primary?structure?requirements?of?the?membrane?protein?[J].J?Virol，1998，72（8）：6838-6850.

[7]?LAUDE?H，GELFI?J，LAVENANT?L，et?al.Single?amino?acid?changes?in?theviral?glycoproteinM?affect?induction?of?alpha?interferon?by?the?coronavirus?transmissible?gastroenteritis?vims?[J].J?Virol，1992，66（2）：743-749.

[8]?盧冰霞，秦毅斌，何穎，等.2011年-2014年廣西豬流行性腹瀉病毒檢測及其M基因的序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（3）：549-557.

[9]?張紅壘，董潔，梁亞冰，等.豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR鑒定及其M、N和E基因的序列分析[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2012，21（9）：24-28.

[10]?王隆柏，吳學敏，車勇良，等.豬流行性腹瀉病毒ORF3和M基因的克隆與序列分析[J].中國動物傳染病學報，2012，20（3）：67-72.