宋瑞龍　周子彥　徐天祺　潘士鋒　劉宗平

摘要?免疫熒光技術是標記免疫技術中應用最為廣泛的一項技術，具有特異性強、靈敏度高、速度快和便于觀察等特點。影響免疫熒光染色質量的因素多種多樣，從熒光染料、抗體、樣品前處理、染色過程等幾個重要的方面入手，就如何提高免疫熒光染色質量，以獲得一張高分辨率的圖片做了詳細的介紹。該研究有利于提高免疫熒光染色質量，為生命科學研究提供了有力幫助。

關鍵詞?免疫熒光染色技術;抗體;影響因素

中圖分類號?Q2-33文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）16-0124-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.036

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Influencing?Factors?of?Quality?of?Immunofluorescent?Staining?Technology

SONG?Rui?long，ZHOU?Zi?yan，XU?Tian?qi?et?al?（College?of?Veterinary?Medicine，Yangzhou?University/Jiangsu?Co?innovation?Center?for?Prevention?and?Control?of?Important?Animal?Infectious?Diseases?and?Zoonoses，Yangzhou，Jiangsu?225009）

Abstract?As?one?of?the?most?widely?used?immunolabeling?techniques，immunofluorescence?has?several?advantages?including?high?specificity，high?sensitivity，rapid?detection?and?clear?positioning.?However，the?quality?of?immunofluorescent?staining?could?be?affected?by?multiple?factors，such?as?fluorescent?dyes，antibodies，sample?preparation?and?staining?process.Starting?with?those?vital?factors，we?introduced?how?to?improve?the?quality?of?immunofluorescent?staining?so?as?to?obtain?a?high?resolution?image?in?detail.This?study?improved?the?quality?of?immunofluorescent?staining?and?provided?powerful?help?for?life?science?research.

Key?words?Immunofluorescent?cell?staining?technology;Antibody;Influencing?factor

免疫熒光染色技術是一種以免疫學為基礎，結合生物化學技術和顯微技術發(fā)展而來的蛋白等分子檢測技術。這種技術是Coons等在1941年首先建立的，尤其近三十幾年來，免疫標記技術和檢測技術有了長足的進步，其穩(wěn)定性、靈敏性和特異性都有了飛速的發(fā)展。免疫熒光染色技術作為一種科學研究的技術手段，已被廣泛應用于細胞生物學、微生物學、寄生蟲學、免疫學等科學研究，以及臨床診斷方面[1-5]。因此，提高免疫熒光染色質量尤為重要。

免疫熒光技術利用了抗原與抗體高度特異性結合的原理，將某種可測定的物質偶聯(lián)到抗體或者抗原上，通過檢測標記物的有無和含量，對樣品中待檢抗原或抗體進行定性、定位和定量檢測。物質原子核外電子具有多個不同大小的能級，最低能級稱為基態(tài)。當光子能量等于2個不同能級的能量差時，低能級電子吸收光子能量后，躍遷至高能級的激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)極不穩(wěn)定，會向低能級狀態(tài)躍遷，釋放出不同能量的光子，這些光子能夠通過熒光顯微鏡檢測到，進而對檢測物質進行定性、定位、定量等檢測[6]。熒光物質在持續(xù)受到激發(fā)光激發(fā)后，由于不能夠恢復到基態(tài)，從而導致熒光強度減弱或淬滅。免疫熒光染色技術包括試驗準備階段、染色過程和樣品拍攝，以下將從熒光染料、抗體、樣品前處理、染色過程等方面闡述如何提高免疫熒光染色的質量，以獲得高清晰度的圖片。

1?試驗準備

1.1?免疫熒光染色方法的選擇

免疫熒光染色技術分為直接法和間接法。直接法是將熒光標記物偶聯(lián)在抗原/抗體上，直接與相應的抗體/抗原反應;間接法是先用未標記的一抗與抗原充分反應后，再利用熒光標記的二抗與已經結合在抗原上的一抗結合，達到檢測抗原的目的[1]。直接法操作簡單、特異性高，非特異性染色少，便于相同宿主來源的不同蛋白的共定位，但是其靈敏性相對比間接法低。間接法相對直接法操作復雜，特異性稍低，但靈敏度高，染色更加靈活，成本低。一般情況下，間接法因上述特點應用更加廣泛，而直接法主要應用于流式細胞術或者無法購買到不同宿主來源的一抗時而進行的蛋白共定位檢測試驗中。

1.2?抗體的選擇

抗原通常包含多個抗原決定簇，抗體按是否由單一抗原決定簇刺激機體產生而分為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是經一種抗原決定簇刺激后的雜交瘤細胞，經HAT培養(yǎng)基篩選，ELISA檢測效價，得到陽性克隆株，注射到動物腹水中，收集純化得到的抗體[7-8]。多克隆抗體只需將具有多個抗原決定簇的抗原直接注射到動物體內進行幾次免疫，ELISA測其效價合格后，收集血液離心得到上清，純化后得到多克隆抗體[9-11]。

單克隆抗體特異性高[12]，但因單克隆抗體由單一抗原決定簇抗原刺激得到，所以只能識別一個抗原表位，靈敏度相對較低，且單克隆抗體的抗原表位一旦破壞，將直接影響其與抗原的結合，導致免疫熒光染色的失敗[8，13]。另外，單克隆抗體制備過程復雜，價格也相對較高。而多克隆抗體制備過程簡單，周期短，價格相對較低[14]。因多克隆抗體由多個抗原決定簇刺激機體得到，所以其能識別多個抗原表位，相同條件下，靈敏度更高，對于表達量較低的目標蛋白更容易檢出。另外即使少數(shù)多克隆抗體的抗原表位破壞，免疫熒光染色的結果也不會受到影響。但是，因為其能識別多個抗原表位，所以其特異性也相對較低。

綜上所述，與目標蛋白直接結合的一抗，在條件允許的條件下，盡量選擇相同來源的免疫原或者選擇已驗證種屬反應性的抗體[15]。如果進行不同目標蛋白的雙染或多染時，這些不同蛋白所對應的一抗應該來源于不同宿主。單克隆抗體與多克隆抗體、種屬免疫原、反應性和抗體的宿主來源是抗體選擇最主要考慮的因素，其直接決定著免疫熒光染色的背景、特異性和成敗。熒光偶聯(lián)的二抗應選擇與一抗相對應的抗體，及抗一抗的二抗[16]。

1.3?熒光染料的選擇

隨著免疫熒光技術的不斷進步，免疫熒光染料也得到了飛速的發(fā)展，目前市場上常用的熒光染料有Alexa?Fluor?系列、CFTM系列、ATTO系列、DyLight系列和Cy系列等，使用最多的是Alexa?Fluor?系列和CFTM系列[17]。

染料的選擇應與激光共聚焦顯微鏡所配激光器的激發(fā)波長相匹配（350、405、458、488、514、561、633?nm），當需要多重熒光標記時，這些熒光探針的激發(fā)波長或發(fā)射波長盡量相差大些，可以區(qū)分開。350?nm或者405?nm激光器激發(fā)的藍色染料有CF?350、Alexa?Fluor?350、CF?405S/?CF?405?M和Alexa?Fluor?405等。488?nm激光器能夠激發(fā)綠色熒光，常用熒光染料有CF?488A、Alexa?Fluor?488、FITC、FAM、DyLight?488和Cy2等。其中FITC熒光強度極易受到pH影響，且易淬滅，在熒光染料選擇中，常用Alexa?Fluor488或者CF?488A替代。543～555?nm激光器能夠激發(fā)橙紅色熒光，染料有CF?543、Alexa?Fluor?546、ATTO550、Cy3、DyLight?549、Rhodamine?（TRITC）[18]。568～594?nm激光器激發(fā)紅色熒光，染料有CF?568、Alexa?Fluor568、ATTO?565、Rhodamine?Red等。620～660?nm激光器激發(fā)遠紅外熒光，染料有CF?620R、LightCycler?Red?640等。680～790?nm激光器激發(fā)近紅外熒光，染料有CF?680R/680、Alexa?Fluor?680、IR?Dye?680等[19]。

在進行雙重或多重免疫熒光染色時，一般先通過ThermoFisher等網站上的熒光光譜查看器進行預選擇，不同熒光的激發(fā)波長或發(fā)射波長盡量無交叉，防止串色，影響試驗結果的準確性。熒光染料各有各的特性，Alexa?Fluor?系列熒光染料激發(fā)和發(fā)射光譜窄，且在較寬的pH范圍內保持穩(wěn)定（pH4～10），可用于雙重或多重熒光染色而光譜重疊少[20]。ATTO?系列熒光染料具有較強的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，已被應用于STED?（stimulated?emission?depletion，受激發(fā)射損耗）?超高分辨率顯微成像技術[21]。DyLight、CF?等具有較高的激發(fā)效率、良好的光穩(wěn)定性和pH?穩(wěn)定性等，從而被廣泛應用于組織及細胞免疫熒光染色[20]。

1.4?抗體保存

應該防止熒光抗體失活、污染以及熒光染料的脫落和淬滅。在抗體保存過程中，適量分裝，避免反復凍融。蛋白極易被塑料等吸附，如果用塑料管分裝，抗體中應添加BSA等。為防止污染也可以添加0.01%的硫柳汞或者0.1%的疊氮化鈉。為防止淬滅，保存熒光抗體時應該注意避光，可以利用錫箔紙包好，或者放在避光的容器中。

1.5?培養(yǎng)載體的選擇

根據(jù)貼壁情況，細胞可分為貼壁細胞和懸浮細胞。貼壁細胞一般常用24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，接種細胞前放置0.17?mm玻璃細胞爬片。懸浮細胞常用6孔板培養(yǎng)，免疫熒光染色處理后，取少量加在0.17?mm玻璃細胞爬片上。最后將細胞爬片倒扣到載玻片上，封片，放4?℃保存。

2?免疫熒光染色

免疫熒光染色流程主要包括細胞固定、透膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、封片以及每一步之間的洗滌等。

2.1?細胞固定

細胞固定是為了盡可能地使細胞形態(tài)結構和物質組成保存原有狀態(tài)，防止細胞死后發(fā)生自溶或破壞，以便最大程度地反映固定前的生命活動，同時對細胞自身也起到了一定的固定作用[22]。

免疫熒光染色常用的固定劑有甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇等[23]。多聚甲醛較甲醛穩(wěn)定，不易析出[24];4%的多聚甲醛在細胞免疫熒光染色中最為常用[25-28]。在進行破骨細胞骨架免疫熒光染色試驗中發(fā)現(xiàn)，4%的多聚甲醛固定20?min效果顯著好于其他固定劑的固定效果。因其易分解，4%的多聚甲醛最好現(xiàn)配現(xiàn)用。丙酮的組織穿透性強，可使蛋白沉淀，抗原固定較好，但對核固定較差，固定效果弱于多聚甲醛，且使細胞收縮嚴重。95%乙醇脫水性強，但同時也易引起組織收縮、變硬，能沉淀白蛋白、核蛋白和球蛋白等，也較為常用。甲醇的固定時間快，細胞收縮小，細胞核保存較戊二醛的反應速度快，是優(yōu)良的前固定劑，但它的滲透速度較慢。盡管如此，不同蛋白各有其適應的固定劑。

2.2?透膜處理

Triton?X-100作為免疫熒光染色最為常用的透膜劑，其實質是一種非離子型表面活性劑，能夠溶解脂質，增強細胞膜的通透性，便于抗體進入細胞內[29]。如果需檢測的目的蛋白屬于胞內蛋白或者抗原抗體結合位點位于胞內的跨膜蛋白，抗體孵育前需進行透膜處理[27]。對于一些抗原抗體結合位點位于胞外膜上的目標蛋白，是否進行透膜處理對試驗結果影響不大。

Triton?X-100濃度和透膜時間并非越大或越長越好，在破骨細胞骨架免疫熒光染色試驗中，0.5%的Triton?X-100透膜處理20?min效果最佳。時間過短或濃度過低，會造成透膜不充分，抗體進入胞內不足，熒光強度低，圖像不清晰。相反，Triton?X-100濃度過高或透膜時間過長都會造成細胞骨架結構解離，致使顯微鏡下無法檢測到骨架結構或只檢測到少量蛋白殘基。

2.3?樣品封閉

封閉處理的目的通常是減少抗體的非特異性結合，如非特異性抗體與內源Fc受體（FcR）結合或與其他物質之間的離子作用或疏水作用等[12]。最常用的封閉液有1%～5%的BSA溶液、脫脂奶粉溶液或血清溶液[30]。盡管如此，Buchwalow等[31]研究發(fā)現(xiàn)內源性FcR在標本固定后失去結合抗體Fc部分的能力。?同樣，也沒有發(fā)現(xiàn)任何離子作用或疏水作用的非特異性抗體結合，因此認為傳統(tǒng)意義上的樣品封閉步驟在免疫熒光染色中是沒有必要的。

2.4?抗體孵育

抗體孵育目的是使抗體充分與目的蛋白抗原結合，其結合程度直接影響著免疫熒光染色的效果?？贵w濃度一般按照說明書推薦進行適當調整。通常37?℃孵育?1～2?h，可根據(jù)蛋白表達量的多少適當調整時間，或者一抗4?℃過夜。一般情況下，環(huán)境溫度的升高對免疫熒光染色有明顯的影響，隨著溫度升高，熒光淬滅的可能性增大，因此適當?shù)牡蜏丨h(huán)境對于免疫熒光染色和觀察效果更好。

2.5?洗滌

在細胞進行固定處理前要用37?℃?PBS洗滌3遍，每遍1?min，以減少細胞的應激和去除附著的雜質[19]。固定后和透膜后各洗滌3遍，每遍2?min，去除其中的固定劑和Triton?X-100，封閉后的封閉液無需洗滌，只需用移液器吸凈[27]。孵育二抗前，要充分洗凈一抗，防止二抗與殘留的一抗結合，影響結果的準確性，也可減少背景色。二抗孵育結束后，再充分洗滌殘留的二抗。

2.6?封片

封片時添加少許防淬滅劑可防止樣品淬滅。但并不是每種防淬滅劑都適合免疫熒光染色。常用甘油和PBS等量混合，因每種熒光染料適應于不同的pH，建議封閉液使用前調整pH直至熒光染料的最適pH。目前商品化的防淬滅劑有Prolong?Gold、Mowiol、Vectashield和DABCO/NPG等。Prolong?Gold?（life?tech）含有防淬滅劑，封片后需要硬化一段時間，?可長期保存;Mowiol封片后可長期保存;Vectashield具有部分自發(fā)熒光，且會影響一些染料的光譜特性;而DABCO/NPG會嚴重影響某些染料的光譜特性，宜謹慎?使用。

2.7?pH

熒光素在溶液狀態(tài)下基本處于離子化狀態(tài)，故維持熒光素與溶劑之間的電離平衡至關重要。溶液的pH對免疫熒光強度影響極大，不同的熒光素標記物都有自己適合的pH，pH改變能夠影響熒光素的熒光強度，在進行免疫熒光染色時要注意熒光素標記物適宜的pH。

安徽農業(yè)科學2019年

3?結語

免疫熒光染色技術是生命科學研究中極其重要的工具之一，自Coons等首次使用熒光素標記的免疫組織化學法以來，目前已被廣泛應用于各個領域。隨著各種熒光標記物的快速發(fā)展和超分辨激光共聚焦顯微鏡的普及，其已不再受到光的衍射原理的限制，突破了分辨率最高不超過220?nm的限制，將分辨率提高到了1個納米，為生命科學研究提供了強有力的技術工具。免疫熒光染色的好壞直接關系到免疫熒光染色結果的分辨率高低和準確性等。該研究詳細分析了免疫熒光染色過程中抗體選擇、染料選擇等試驗前期準備過程以及封閉、透膜、染色等染色過程中各個主要因素的影響，有利于提高免疫熒光染色的質量，為生命科學研究提供有力幫助。

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