夏瀟瀟　湛琴琴　姜明敏　王飛

摘要?以冷榨花生粉為原料，使用超聲波輔助Tris-HCl溶液提取冷榨花生粉中的蛋白質(zhì)，考察液料比、超聲時(shí)間、超聲頻率和提取溫度對花生蛋白提取率的影響。單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)液料比為50∶1、超聲時(shí)間為20?min、超聲頻率為70?kHz、提取溫度為?40?℃時(shí)，冷榨花生粉中蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)87.22%。

關(guān)鍵詞?冷榨花生粉;超聲波;蛋白;提取率

中圖分類號?TS21文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）16-0220-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.062

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Ultrasound?assisted?Extraction?Experiment?of?Protein?from?Cold?pressed?Peanut?Powder

XIA?Xiao?xiao，ZHAN?Qin?qin，JIANG?Ming?min?et?al?（Department?of?Biology?&?Environmental?Engineering，Hefei?University，Hefei，Anhui?230601）

Abstract?Cold?pressed?peanut?powder?was?used?as?raw?material?to?extract?protein?with?Tris?HCl?solution?assisted?by?ultrasound.The?effects?of?liquid?to?material?ratio，ultrasonic?time，ultrasonic?frequency?and?temperature?on?the?extraction?rate?of?peanut?protein?were?investigated.?The?results?of?single?factor?experiment?and?orthogonal?experiment?showed?that?the?extraction?rate?of?protein?in?cold?pressed?peanut?powder?could?reach?87.22%?when?the?liquid?to?material?ratio?was?50∶1，the?ultrasonic?time?was?20?min，the?ultrasonic?frequency?was?70?kHz?and?the?extraction?temperature?was?40?℃.

Key?words?Cold?pressed?peanut?powder;?Ultrasonic?wave;?Protein;?Extraction?rate

花生被譽(yù)為“長生果”“植物肉”“綠色牛乳”[1]，是一種重要的油料作物，也是植物蛋白質(zhì)的重要來源之一?；ㄉ鞍谞I養(yǎng)價(jià)值高，含有人體必需的氨基酸，不含膽固醇，且消化系數(shù)在90%以上[1-2]。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)提取方法存在耗時(shí)長、效率低、操作繁瑣等缺點(diǎn)[3-4]。超聲波是一種機(jī)械能量形式[5]，能在液態(tài)體系中產(chǎn)生空化效應(yīng)。強(qiáng)烈的空化效應(yīng)會讓空化泡在崩潰的同時(shí)瞬間釋放局部高溫和高壓，因而會產(chǎn)生劇烈沖擊、剪切等作用力。當(dāng)空化效應(yīng)發(fā)生在植物組織周圍時(shí)，可以引發(fā)細(xì)胞破碎，促進(jìn)目標(biāo)物質(zhì)的釋放和溶出[5-7]。因此，超聲波是一種有效的輔助萃取手段，已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物、生物活性物質(zhì)、功能改性等領(lǐng)域，是一種安全、綠色、環(huán)境友好的提取方法[8-14]。筆者采用超聲波輔助Tris-HCl溶液提取冷榨花生粉中的蛋白質(zhì)，對影響其提取率的因素（液料比、超聲時(shí)間、超聲頻率和提取溫度）進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑?花生，購于安徽省合肥市濱湖永輝超市;考馬斯亮藍(lán)G-250，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷，購自上海陽光生物科技有限公司;氫氧化鈉，購自西隴化工股份有限公司;鹽酸，購自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司;硫酸，購自西隴化工股份有限公司，試驗(yàn)試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)蛋白，購自北京索萊寶科技有限公司，優(yōu)級純GR。蒸餾水，自制。

1.2?儀器與設(shè)備

MI-S1榨油機(jī)，為中山麥爾尼電器有限公司產(chǎn)品;DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，為上海光都儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;Centrifuge5810高速臺式離心機(jī)，為德國Eppendorf?AG公司產(chǎn)品;722可見分光光度計(jì)，為上海佑科儀器儀表設(shè)備有限公司產(chǎn)品;JK-DYJ500金尼克超聲波清洗器，為合肥金尼克機(jī)械制造有限公司產(chǎn)品;pHS-25?pH計(jì)，為上海儀電科學(xué)儀器產(chǎn)品。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?花生總蛋白的測定?；ㄉ械牡鞍踪|(zhì)總量采用凱氏定氮法測定。①稱取0.2?g樣品粉末，精確至0.001?g，移入干燥的25?mL定氮瓶中，加入0.2?g硫酸銅、6?g硫酸鉀，再加入20?mL濃硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，在溫度約100?℃條件下小心預(yù)熱2?h，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，將溫度升至350?℃，并保持瓶內(nèi)溶液微沸狀態(tài)，待溶液由黑色變?yōu)樽攸S色，再變?yōu)樗{(lán)綠色并澄清后，再繼續(xù)加熱1?h。取下冷卻，小心加入?20?mL純凈水。放冷后，移入100?mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。②將裝有消化溶液的定氮瓶放入定氮儀，接通冷凝水開啟儀器經(jīng)過加堿、硼酸、加熱、酸化、滴定，最終得到樣品中的蛋白質(zhì)含量。有機(jī)物中的銨根在強(qiáng)熱條件下與CuSO?4、濃H?2SO?4作用，硝化生成（NH?4）?2SO?4。③用已知濃度的H?2SO?4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)HCl消耗的量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算因子，即得蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)含量的計(jì)算公式：

蛋白質(zhì)含量=?N×6.25

式中，N為含氮量，N（%）=[1.401×M×（V-V?0）]/W;M為標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾濃度（mol/mL）;W為樣品的重量（g）;V?0為空白樣滴定標(biāo)準(zhǔn)酸的消耗量（mL）;V為樣品滴定標(biāo)準(zhǔn)酸的消耗量（mL）。

1.3.2?花生中蛋白質(zhì)的提取步驟?；ㄉ械鞍踪|(zhì)的提取步驟如下：新鮮花生→冷榨去油→粉碎→取適量稱重→加入Tris-HCl溶液進(jìn)行超聲波輔助萃取→離心→取上清液→測定蛋白質(zhì)的提取質(zhì)量。

1.3.3?Lowry試劑盒法測定蛋白質(zhì)含量。取5?μL樣品置于?5?mL離心管中，然后加入250?μL?RC?Reagent?Ⅰ，并振蕩，室溫下靜置1?min，然后加入250?μL?RC?Reagent?Ⅱ，振蕩，然后進(jìn)行15?000?r/min離心7?min，去上清，留沉淀，取干凈50?mL大離心管，加入100?μL?DC?Reagent?S和5?mL?DC?Reagent?A混勻，然后取255?μL混合液加入離心后沉淀物中，振蕩搖勻，靜置?15?min，最后用分光光度計(jì)于波長750?nm下測定溶液吸光度。

1.3.4?蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算。按以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)提?取率：

蛋白質(zhì)提取率=超聲波輔助提取蛋白質(zhì)量（g）冷榨花生粉中蛋白質(zhì)含量（g）×100%

2?結(jié)果與分析

2.1?冷榨花生粉中蛋白質(zhì)總量

使用凱式定氮儀測得冷榨花生粉中總蛋白質(zhì)含量為48.3%。

2.2?單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1?液料比對蛋白質(zhì)提取率的影響。

當(dāng)提取時(shí)間為?15?min，超聲頻率為60?kHz，提取溫度為40?℃時(shí)，考察不同液料比，即20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1?（mL∶g）對蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，冷榨花生粉中蛋白質(zhì)的提取率隨著液料比的提高而升高，當(dāng)液料比達(dá)到50∶1后，隨著液料比的持續(xù)加大，蛋白質(zhì)提取率的上升速度變緩。這是因?yàn)檩腿∪軇┻m度增加有利于蛋白質(zhì)與溶劑的接觸，增大擴(kuò)散作用。當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)量確定時(shí)，大部分蛋白質(zhì)已被萃取，此時(shí)再增加萃取液用量，提取率緩慢增長，溶液中蛋白質(zhì)濃度下降，造成萃取劑?浪費(fèi)。

2.2.2?超聲時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響。

當(dāng)液料比為50∶1，超聲頻率為60?kHz，提取溫度為40?℃時(shí)，考察不同超聲時(shí)間（5、10、15、20、25?min）對蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖2?所示。

從圖2可以看出，隨著超聲時(shí)間的增加，冷榨花生粉中蛋白質(zhì)的提取率先增加后減小，在超聲輔助萃取時(shí)間為?20?min?時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)槌暡芤鹛厥獾目栈?yīng)，空化效應(yīng)瞬間形成的高溫高壓可以破壞植物細(xì)胞組織，從而促使有效成分大量釋放[15]。但若超聲時(shí)間過長，超聲會引起局部過熱，從而破壞蛋白質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，使其提取率降低。

2.2.3?超聲頻率對蛋白質(zhì)提取率的影響。

當(dāng)液料比為?50∶1，提取時(shí)間為15?min，提取溫度為40?℃時(shí)，考察不同超聲頻率（40、50、60、70、80?kHz）對蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

超聲頻率越小，瞬態(tài)空化效應(yīng)越顯著，形成的瞬間沖擊波和射流能破碎植物細(xì)胞，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶出，提高提取效率，但瞬態(tài)空化效應(yīng)過強(qiáng)也會破壞被提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，引發(fā)蛋白質(zhì)變性沉淀;超聲頻率越大，萃取液的稀薄相會減小，空化效應(yīng)向穩(wěn)態(tài)空化轉(zhuǎn)變，空化效應(yīng)減弱，萃取液在花生粉周圍形成微流，而植物細(xì)胞被破壞程度小，目標(biāo)物質(zhì)的提取率低。由圖3可以看出，隨著超聲頻率的增加，冷榨花生粉中蛋白質(zhì)的提取率先增加后減小，當(dāng)超聲頻率為60?kHz時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大值。

2.2.4?提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響。

當(dāng)提取液pH為?8.0，提取時(shí)間為15?min，液料比為50∶1，超聲頻率為60?kHz時(shí)，考察不同提取溫度（20、30、40、50、60?℃）對蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，冷榨花生粉中蛋白質(zhì)的提取率隨著提取溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)提取溫度過高時(shí)，會引起蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，Tris-HCl溶液的蛋白質(zhì)提取率下降。

2.3?正交試驗(yàn)?在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳固定化條件，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2可以看出，優(yōu)化方案為A?2B?3C?2D?2，影響冷榨花生粉中蛋白質(zhì)提取率的因素從低到高依次為超聲時(shí)間、超聲頻率、提取溫度、液料比。因此，冷榨花生粉中蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)方案：液料比50∶1（mL/g）、超聲時(shí)間20?min、超聲波頻率70?kHz、提取溫度為40?℃。

2.4?驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳固定化條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在液料比50∶1、超聲時(shí)間?20?min、超聲頻率70?kHz、提取溫度40?℃的條件下，冷榨花生粉中蛋白質(zhì)的提取率為87.22%。

3?討論

超聲波的空化效應(yīng)可以破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能有效促進(jìn)目標(biāo)物質(zhì)溶解于萃取溶劑，但由于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)易被破壞，因此在實(shí)際操作中需要考慮超聲頻率、時(shí)間、溫度等因素對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[16-18]。該研究對影響超聲波輔助提取冷榨花生粉中的蛋白質(zhì)的4個(gè)因素（液料比、超聲時(shí)間、超聲頻率和提取溫度）進(jìn)行優(yōu)化，最終確定超聲波輔助萃取冷榨花生粉中的蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件如下：液料比50∶1、超聲時(shí)間?20?min、超聲頻率70?kHz、提取溫度40?℃，在此條件下蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)87.22%。

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