張志 呂建偉 覃開(kāi)羽 吳敏 張蓓 李俊偉 王瑩 馮秀芳 盧森華

摘要：采用HLPC法，色譜柱為Agilent Eclipse-C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)合主成分分析對(duì)10批次銀菊合劑樣品進(jìn)行研究。結(jié)果表明，標(biāo)定出11個(gè)共有峰，定性了3個(gè)共有峰，指紋圖譜相似度均在0.9以上，符合指紋圖譜研究技術(shù)要求，影響制劑質(zhì)量差異是多成分協(xié)同作用的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：銀菊合劑;HPLC;化學(xué)計(jì)量學(xué);指紋圖譜

中圖分類(lèi)號(hào)：O69? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）16-0110-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.025? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Using HLPC， Agilent Eclipse-C18 column， detection wavelength 330 nm， mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid gradient elution， flow rate was 1.0 mL/min. 10 batches of Yinju mixture samples were studied by similarity evaluation of chromatographic fingerprints of traditional Chinese medicine. Results showed that thirteen common peaks were calibrated and three common peaks were qualitatively identified. The similarity of fingerprints was above 0.9， which met the requirements of fingerprint technology. The synergistic effect of multi-components affected the quality of preparations.

Key words： Yinju mixture; HPLC; chemometrics; fingerprint

銀菊合劑是柳州市中醫(yī)醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方，通過(guò)多年臨床觀(guān)察證明其具良好的清熱解毒、疏散風(fēng)熱作用，常用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、瘡毒或壯熱口渴、小兒胎毒等病癥的治療，且療效顯著。銀菊合劑組方含山銀花和菊花二味中藥，山銀花（Lonicera hypoglauca）性甘寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒，涼散風(fēng)熱的功效[1]，為君藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，山銀花中具有抗菌、抗病毒、解熱、抗氧化及保護(hù)肝臟的作用[2，3]。山銀花的質(zhì)量控制除了法定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的外觀(guān)、性狀、鑒別及以綠原酸含量為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制外，多集中于不同產(chǎn)地、不同加工方法山銀花有效成分的含量測(cè)定，并越來(lái)越傾向于多種成分的同時(shí)測(cè)定[4，5];HPLC指紋圖譜可用于山銀花藥材、提取物品質(zhì)的鑒定[6]。菊花[Dendranthema morifolium（Ramat. ）Tzvel.]性苦、辛、微寒，歸肝、心經(jīng)，散風(fēng)清熱，平肝明目，清熱解毒，以增強(qiáng)主藥之功效[1]，為臣藥。菊花具有抗菌、抗炎、舒血管、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[7，8]。二藥配伍，苦寒瀉火以解毒，甘寒化陰以補(bǔ)虛，標(biāo)本兼顧，共奏清熱解毒、疏散風(fēng)熱之效。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，目前采用定量部分指標(biāo)性成分的方法難以全面控制其質(zhì)量，中藥指紋圖譜技術(shù)有利于整體獲取中藥活性組分群，已成為中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別、質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)和產(chǎn)品穩(wěn)定性考察的可行模式[9，10]。

目前，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)已被廣泛地應(yīng)用于中成藥的質(zhì)量控制[11]，但有關(guān)銀菊合劑指紋圖譜的研究甚少。本研究采用HPLC結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)銀菊合劑進(jìn)行指紋圖譜研究，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制銀菊合劑的質(zhì)量提供參考依據(jù)，為下一步形成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的成果和產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 試劑? 銀菊合劑樣品來(lái)源于柳州市中醫(yī)醫(yī)院，制備銀菊合劑所用飲片購(gòu)于廣西柳州醫(yī)藥股份有限公司、國(guó)藥控股柳州有限公司和廣西柳州百草堂中藥飲片廠(chǎng)責(zé)任有限公司，經(jīng)柳州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部中藥庫(kù)唐鳳嵐副主任中藥師鑒定：山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera Confusa DC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花;菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥頭狀花序，藥材形狀特征與《中國(guó)藥典》2015年版描述一致，各飲片產(chǎn)地來(lái)源、批號(hào)信息見(jiàn)表1。綠原酸（批號(hào)110753-201415）、咖啡酸（批號(hào)110885-200102）、木犀草苷（批號(hào)111720-2013）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。乙腈、甲醇（美國(guó)Fisher公司，色譜純），磷酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，優(yōu)級(jí)純），高效液相色譜儀用水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

1.1.2? 儀器? 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）;XS-205Du型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）;HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)）;Synergy型超純水機(jī)（美國(guó)密里博公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 混合對(duì)照品溶液的配制? 分別精密稱(chēng)定綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對(duì)照品10 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取上述3種對(duì)照品準(zhǔn)備液1.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得。

1.2.2? 供試品溶液的制備? 精密量取銀菊合劑2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

1.2.3? 色譜條件? 色譜柱為Agilent Eclipse-XDB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為5 μL;流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫（乙腈體積分?jǐn)?shù)在0→5 min為10%，5→50 min為10%→90%）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 精密度試驗(yàn)

取S1號(hào)銀菊合劑2.0 mL制備供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.03%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為0.02%～0.30%，該試驗(yàn)精密度良好。

2.2? 重復(fù)性試驗(yàn)

取6份S1號(hào)銀菊合劑供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，考察樣品的重復(fù)性。結(jié)果表明，6份樣品的各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.10%;各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為0.4%～3.7%，該方法的重復(fù)性良好。

2.3? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.08%;各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為0.08%～3.60%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4? 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.4.1? 參照色譜峰的建立? 綠原酸為銀菊合劑中已知主要成分，而且綠原酸所在指紋圖譜中的2號(hào)峰保留時(shí)間適中，分離度良好，峰面積較大且為共有峰，故選用綠原酸（2號(hào)峰）作為參照峰，見(jiàn)圖1。

2.4.2? 指紋圖譜的采集[12]? 精密量取10批次的銀菊合劑2.0 mL，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，并按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄10批次銀菊合劑的色譜圖及數(shù)據(jù)，建立銀菊合劑HPLC指紋圖譜（圖2），10批銀菊合劑HPLC疊加色譜圖如圖3所示。

2.4.3? 共有峰的確定? 運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算機(jī)軟件對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，10批次圖譜都具有的色譜峰標(biāo)定為共有指紋圖譜峰。選擇1號(hào)銀菊合劑的圖譜為參照?qǐng)D譜，以平均數(shù)法作為生成對(duì)照指紋圖譜的方法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，軟件自動(dòng)匹配圖譜，系統(tǒng)根據(jù)銀菊合劑的共有模式，生成對(duì)照指紋圖譜為銀菊合劑指紋圖譜。以參照峰的保留時(shí)間和峰面積作為1，分別計(jì)算10批銀菊合劑共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。結(jié)果表明，不同批次的銀菊合劑共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.1%～1.0%，相差較小;而相對(duì)峰面積RSD相差較大。本試驗(yàn)建立的色譜方法可以使不同批次的銀菊合劑具有基本一致的色譜行為，即各批次銀菊合劑樣品在化學(xué)成分種類(lèi)上基本一致，但不同批次之間各種化學(xué)成分的含量受多種因素的影響，因此各峰的峰面積有所差異，各成分的含量有差異。

2.4.4? 共有峰的指認(rèn)? 利用對(duì)照品對(duì)照法對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對(duì)照品，配制成適量濃度，按照“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示3種對(duì)照品的保留時(shí)間分別與特征色譜圖中的2、3、7號(hào)峰保留時(shí)間一致，并通過(guò)在線(xiàn)紫外吸收光譜對(duì)照，2、3、7號(hào)峰分別與綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對(duì)照品峰一致，因此可以確定2號(hào)峰為綠原酸、3號(hào)峰為咖啡酸、7號(hào)峰為木犀草苷，這些特征峰可作為控制銀菊合劑質(zhì)量的指標(biāo)之一。

2.4.5? 相似度評(píng)價(jià)? 選擇S1號(hào)銀菊合劑樣品的圖譜為參照?qǐng)D譜，以平均數(shù)法作為生成對(duì)照指紋圖譜（SR）的方法，時(shí)間窗寬度設(shè)定為0.1 min，然后進(jìn)行譜峰識(shí)別和譜峰匹配，結(jié)果見(jiàn)圖3。系統(tǒng)根據(jù)銀菊合劑樣品的共有模式，生成銀菊合劑對(duì)照指紋圖譜并計(jì)算相識(shí)度，結(jié)果見(jiàn)圖4和表4。結(jié)果表明，10批次銀菊合劑樣品與對(duì)照指紋圖譜（SR）的相似度均大于0.9，說(shuō)明各批次銀菊合劑樣品圖譜與對(duì)照指紋圖譜有較好的一致性，完全符合HPLC指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4.6? 主成分分析? 以10批次銀菊合劑樣品色譜數(shù)據(jù)的11個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析[13]，以主成分的特征根和貢獻(xiàn)率作為選擇主成分的依據(jù)，提取到2個(gè)主成分的特征根大于1的主成分，2個(gè)主成分特征值分別為6.690%、2.664%，方差貢獻(xiàn)率分別為60.814%、24.220%，且它們的累積方差貢獻(xiàn)率大于85.034%，結(jié)果見(jiàn)表5。從PCA碎石圖（圖5）可以看出，先提取出來(lái)的2個(gè)主成分的坡度較為陡峭，說(shuō)明所提取的 2個(gè)主成分可以代表銀菊合劑樣品的質(zhì)量。根據(jù)因子荷載矩陣，推測(cè)影響銀菊合劑樣品質(zhì)量差異的并不是單一成分，而是多成分協(xié)同作用的結(jié)果。從表6和圖6中可以看出，第1主成分的信息主要來(lái)自于色譜峰 2、3、5、7、10、11的信息;第2主成分主要來(lái)自色譜峰1、4、6、8、9的信息。

3? 討論

中藥制劑的生產(chǎn)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，生產(chǎn)環(huán)節(jié)、影響因素多，生產(chǎn)中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，均對(duì)制劑產(chǎn)品的安全有效造成影響。中藥自身毒性或潛在毒性、中藥之間相互作用、配伍禁忌或者臨床用藥不合理等因素會(huì)引發(fā)中藥制劑的安全問(wèn)題。中藥制劑的藥材來(lái)源、處方、制備成型工藝、輔料、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)壬婕爸兴幹苿┑馁|(zhì)量問(wèn)題[14]。中藥制劑指紋圖譜則通過(guò)各色譜峰的峰面積或峰高比值來(lái)確定樣品中化學(xué)成分的相對(duì)量，并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法通過(guò)相似度的比較來(lái)評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量的優(yōu)劣，能較為全面地反映中藥制劑中所含化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量，尤其是在現(xiàn)階段有效成分大部分未明確的情況下，能較全面地反映中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量[15]。

從10批樣品的高效液相色譜指紋圖譜中可以看出，不同批次銀菊合劑各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致，所含成分基本相同，符合指紋圖譜的要求。本研究建立銀菊合劑指紋圖譜，為銀菊合劑的質(zhì)量控制提參考，進(jìn)而對(duì)于其相應(yīng)制劑的質(zhì)量控制也會(huì)起積極的作用。

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