劉永慶 王成宏 童鐘

(合肥市第一人民醫(yī)院肝膽外科，安徽 合肥 230601)

肝癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)生率(第五)高死亡率(第三)的癌癥之一[1-2]。肝炎病毒的感染是肝癌發(fā)生的主要因素(約占80%)3。其他因素，如酒精攝入，肥胖，肝硬化，吸煙甚至是糖尿病皆是肝癌發(fā)生的誘導(dǎo)因[4-8]。此外，基因突變及染色體異常也在肝癌發(fā)生發(fā)展中占據(jù)主導(dǎo)地位[9-12]。微小RNA作為一種小的非編碼核糖核酸可以通過堿基互補(bǔ)配對與靶基因結(jié)合，進(jìn)而沉默靶RNA或者抑制RNA轉(zhuǎn)錄后表達(dá)[13]。其中miR-143參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探討miR-143在肝癌組織中的表達(dá)情況，以及進(jìn)一步敲低miR-143后，通過調(diào)節(jié)SHP2-ERK1/2信號通路來升高肝癌細(xì)胞中肝細(xì)胞的比例，從而加重肝癌細(xì)胞的惡性程度的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 20例肝癌組織樣本以及正常的20份肝組織來源于安徽省合肥市濱湖醫(yī)院，所有涉及人類參與者的操作程序都符合合肥市濱湖醫(yī)院倫理委員會(huì)要求，且皆獲得參與此研究涉及的個(gè)體的知情同意。人類肝癌細(xì)胞HepG2和正常人肝上皮細(xì)胞HL02購于美國ATCC細(xì)胞庫，人肝癌細(xì)胞系SMMC-7702細(xì)胞系購于上?；鄯f生物科技有限公司。miRNA-143的相關(guān)引物購于invitrogen公司。肝癌組織以及肝癌細(xì)胞的miRNA提取是通過大連Takara公司的miRvana miRNA 試劑盒。miR-143 inhibitor以及miR-143-mimic購買于上海漢恒公司。Transwell 小室購于康寧公司。流式抗體CD133-APC購于BD pharmingen公司，乙醛脫氫酶活性檢測試劑盒購于北京索萊寶有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2，HL02以及SMMC-7702細(xì)胞皆采用相同的細(xì)胞培養(yǎng)方式進(jìn)行無菌培養(yǎng)，即細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為DMEM加10%的胎牛血清和1%的雙抗(青霉素與鏈霉素)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)試劑皆購買于美國Gibco公司。此外，所有的細(xì)胞皆培養(yǎng)于無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)。

1.2.2RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 采用miRvana miRNA試劑盒提取細(xì)胞的總的miRNA。miR-143的檢測采用大連Takara公司的primescript RT reagent試劑盒。細(xì)胞或組織中的miRNA提取方法具體如下：1、裂解組織。采用1ml RNA reagent裂解細(xì)胞或組織，將勻漿置于室溫2-3分鐘，接著加入氯仿，震蕩15秒，之后冰浴10分鐘。冰浴后4攝氏度離心15分鐘，取上層水相為RNA。2、去除RNA。將RNA轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2 mL RNA mini column中，室溫離心30-60秒(1000g)。3、miRNA的分離純化。加入十分之九的無水乙醇至離心管中，渦旋混勻，加入 RNA mini column中并加入吸附柱中，棄除流出液。最后加入500ulRWB wash buffer，離心30～60秒。最終洗脫miRNA，室溫靜置5分鐘，13000g離心一分鐘。將獲取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入qRT-PCR反應(yīng)所需試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)。GAPDH用來作為內(nèi)參。GAPDH前引物序列為：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，后引物序列為：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’;miR-143前引物序列為：5’.GCGGCGGTGAGATGAAGCACTG-3’，后引物序列為：5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’。

1.2.3細(xì)胞慢病毒感染實(shí)驗(yàn) miR-143的siRNA(si-miR-143)及其陰性對照(si-NC)，miR143的過表達(dá)質(zhì)粒皆購買于上海漢恒生物科技有限公司。這些載體質(zhì)粒的感染實(shí)驗(yàn)是采用脂質(zhì)體2000試劑盒進(jìn)行，具體操作如下1)鋪板：感染前一天將HepG2和SMMC-7721細(xì)胞各按3×104cell/孔的密度接種于24孔板中，并分組為Lv-hsa-miR-143 NC，Lv-hsa-miR-143 mimics，Lv-hsa-miR-143 inhibitor，每組設(shè)3個(gè)副孔，保證第二天感染時(shí)其細(xì)胞密度達(dá)到50%左右。(2)稀釋試劑：轉(zhuǎn)染前用DMEM培養(yǎng)基稀釋Polybrene(10 mg/mL)，按1∶200稀釋，使其濃度為50 μg/mL，配制感染體系時(shí)終濃度為5 μg/mL，即為 Polybrene(M)。病毒滴度為1×107TU/mL。(3)感染前換液：感染前8 h換成新配DMEM完全培養(yǎng)基。(4)感染：每組將1 200 μL細(xì)胞懸液、150 μL virus稀釋液、150 μL Polybrene(M)混合在一起，配成1 500 μL培養(yǎng)體系，按分組加入相應(yīng)的病毒混合液進(jìn)行細(xì)胞感染。(5)感染后換液：感染后8～12 h更換DMEM完全培養(yǎng)基。(6)觀察熒光強(qiáng)度。(7)細(xì)胞篩選：1)稀釋嘌呤霉素：將25 mg的嘌呤霉素粉末離心至管底，然后加入1 mL高壓滅菌過的超純水，使其濃度為25 mg/mL，置于-20 ℃冰箱保存。2)鋪板：將待篩選細(xì)胞種植在24孔板里培養(yǎng)，使細(xì)胞密度為70%左右。3)篩選藥物濃度：待細(xì)胞貼壁后，在培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素，設(shè)置不同的濃度梯度進(jìn)行篩選，24～48 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，最終得出HepG2細(xì)胞加入嘌呤霉素后最低致死濃度為2 μg/mL，而SMMC-7721細(xì)胞最低致死濃度為1.5 μg/mL。4)換液時(shí)加入嘌呤霉素。(8)建立穩(wěn)定細(xì)胞株：待所有細(xì)胞均有熒光表達(dá)時(shí)即可停止篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。

1.2.4細(xì)胞行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力，即收集細(xì)胞，每個(gè)孔中種500個(gè)細(xì)胞(6孔板)，加入2 mL完全培養(yǎng)基，放于孵箱中培養(yǎng)14天。用PBS清洗6孔板，晾干后加入0.1%結(jié)晶紫染色1小時(shí)左右，清洗并拍照。采用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。具體方法如下：就是在6孔板中種3×105個(gè)細(xì)胞，加入5 00 μL完全培養(yǎng)基。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)，清洗染色，并拍照。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)首先要將基質(zhì)膠均勻鋪于24孔板中，加入3×104個(gè)細(xì)胞，并加入500 μL完全培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)左右，清洗培養(yǎng)皿并拍照。

1.2.5熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前一天取一塊96孔進(jìn)行鋪板， 不同處理的細(xì)胞按1×104個(gè)/孔種細(xì)胞，加入75 μL DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。第二天將設(shè)計(jì)的miR-143與SHP2的不同質(zhì)粒(突變與未突變)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。1.按照polyplus說明書操作。每個(gè)位點(diǎn)分三組，每組劑量實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，計(jì)算每組共需的試劑總量，配制好后加入到每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔中。5 μL buffer +200 ng DNA +0.3 μL reagent +培養(yǎng)基=75 μL體系，最后每孔平均加入7 μL轉(zhuǎn)染體系。轉(zhuǎn)染后放入培養(yǎng)箱48 h后取出；最后通過多功能酶標(biāo)儀測其熒光值。計(jì)算螢火蟲/海腎比值，計(jì)算相關(guān)性分析數(shù)據(jù)。

1.2.6流式細(xì)胞實(shí)CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞的定量本采用流式細(xì)胞術(shù)來測定。先收集不同處理的肝癌細(xì)胞，測定總細(xì)胞數(shù)，取1×106個(gè)細(xì)胞(用含10%FCS，1%疊氮化鈉的冰冷PBS重懸)。向每根離心管中添加100ul細(xì)胞懸液。按照1：200的比例添加一抗(CD133，Thermo，兔來源)，室溫孵育40分鐘。離心洗滌后再加熒光二抗進(jìn)行孵育(室溫30分鐘)，離心洗滌后上機(jī)檢測。

1.2.7乙醛脫氫酶活性檢測實(shí)驗(yàn) 采用乙醛脫氫酶活性檢測實(shí)驗(yàn)用來檢測肝癌細(xì)胞的干性。本實(shí)驗(yàn)將采用細(xì)胞數(shù)量(1×104個(gè))：提取液體積(mL)為 500～1 000：1 的比例(建議 500 萬細(xì)胞加 入 1 mL 提取液)，接著通過冰浴超聲波法破碎細(xì)胞(功率 300 w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3 min)；然后 10 000 g， 4 ℃，離心 20 min，取上清置于冰上待測。紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340 nm，蒸餾水調(diào)零。 將試劑一 37 ℃(哺乳動(dòng)物)預(yù)熱 15 min。最后按照蛋白濃度計(jì)算其酶活性值。

1.2.8細(xì)胞總蛋白提取及western blot實(shí)驗(yàn) 將孔板或細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上，用1ml槍頭吸出培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞2遍。于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中加入已溶解過蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，充分混勻，放置 4度搖床或冰上快速搖晃15～20 min使裂解液浸入到所有細(xì)胞起到充分裂解細(xì)胞的作用。如果檢測的目的蛋白未磷酸化蛋白在裂解液中還應(yīng)加入磷酸酶抑制劑(細(xì)胞裂解液：磷酸酶抑制劑=100：1)。用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，吸取細(xì)胞碎片和裂解液的混合液至1.5 mL EP管中，4 ℃離心 12 000 rpm 20 min，將蛋白上清吸出轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL EP 中并標(biāo)記，也可將細(xì)胞消化后收集沉淀并用PBS清洗一遍后加入蛋白裂解液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。最后，將相同量的蛋白加入進(jìn)行丙烯酰胺膠中進(jìn)行電泳，然后繼續(xù)轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜放入1%的脫脂牛奶中封閉1個(gè)小時(shí)。之后，加入一抗，放入4℃冰箱進(jìn)行過夜孵育。第二天先洗膜，再加入二抗孵育1.5小時(shí)。洗滌后通過ECL試劑盒進(jìn)行顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件的t檢驗(yàn)分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-143在肝癌組織及細(xì)胞系中呈低表達(dá)趨勢 miR-143在肝癌組織中呈低表達(dá)趨勢(P<0.01)。見圖1A。miR-143在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于正常肝細(xì)胞，且miR-143在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)水平是顯著高于HepG2。見圖1B。

注：A.qRT-PCR用來檢測miR-143在肝癌組織與正常組織中的表達(dá)水平；B.qRT-PCR用來檢測肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞中miR-143的表達(dá)。

圖1miR-143在肝癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

2.2miR-143的敲低對肝癌細(xì)胞惡性增殖的影響 MiR-143的高表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖(圖2A-C)，但是并不影響其轉(zhuǎn)移以及侵襲能力。miR-143的敲低能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖能力而并不影響其轉(zhuǎn)移以及侵襲能力(圖2A-C)。

注：A.克隆形成，transwell without matrigenl以及transwell with matrigenl實(shí)驗(yàn)分別用來檢測miR-143過表達(dá)對肝癌細(xì)胞克隆形成能力，遷移和侵襲的影響；B.克隆形成，transwell without matrigenl以及transwell with matrigenl實(shí)驗(yàn)分別用來檢測miR-143低表達(dá)對肝癌細(xì)胞克隆形成能力，遷移和侵襲的影響；C.雙尾的學(xué)生T檢驗(yàn)用來對miR-143高低表達(dá)對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖2miR-143的敲低對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.3miR-143的敲低對肝癌細(xì)胞中的干細(xì)胞比例的影響 miR-143的敲低可以顯著提高SMMC-7721細(xì)胞株中CD133+干性樣細(xì)胞的比例。與之相反，miR-143的抬高，能夠顯著下調(diào)CD133+的干細(xì)胞比例。miR-143的敲低能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞乙醇脫氫酶的活性，反之則會(huì)抑制乙醇脫氫酶的活性。見圖3。

注：A.流式分析用來檢測miR-143高低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株中CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞比例；B.ALDH活性實(shí)驗(yàn)用來檢測miR-143高低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株中ALDH的活性。

圖3miR-143的敲低對肝癌細(xì)胞中干細(xì)胞比例的影響

2.4miR-143靶向SHP2調(diào)節(jié)ERK磷酸化 為了驗(yàn)證miR-143與SHP2之間的關(guān)系，我們通過western blot檢測了miR-143高表達(dá)的肝癌細(xì)胞中SHP2的表達(dá)，結(jié)果表明，miR-143的敲低能夠升高SHP2的蛋白表達(dá)(圖4C)，反之也成立。采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-143與SHP2的靶向關(guān)系。并且，我們還檢測了SHP2下游的ERK1/2信號通路，結(jié)果顯示，miR-143能夠調(diào)控SHP2/ERK1/2信號通路的活化。見圖4。

注：A.targetscan數(shù)據(jù)庫用來分析miR-143的靶基因；B.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用來分析miR-143與SHP2相互作用；C.western blot用來檢測miR-143高低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株中SHP2以及其下游的ERK磷酸化情況。

圖4miR-143與SHP2的靶向關(guān)系

3 討 論

miRNA是一類小的非編碼RNA，它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的多種信號通路中都扮演著重要的角色[14]。也就是說，miRNA可以靶向于腫瘤相關(guān)基因，促進(jìn)或者是抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有示miR-143在肝細(xì)胞癌中呈低表達(dá)趨勢，且在外周血中也是相同趨勢[15]。這就表明miR-143很可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。為了探究miR-143的表達(dá)及其機(jī)制。本研究選取20例肝細(xì)胞癌癥患者(此類患者皆未接受放射，化療以及靶向藥治療)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-143表達(dá)，結(jié)果表明miR-143在肝癌患者中的確呈現(xiàn)低表達(dá)趨勢，不管是組織抑或是細(xì)胞水平。為了進(jìn)一步探究miR-143在肝癌細(xì)胞中的作用。我們在miR-143高低表達(dá)的細(xì)胞株中相應(yīng)地敲低或者抬高其表達(dá)來驗(yàn)證miR-143在肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用。很有意思的是，miR-143的差異表達(dá)并不會(huì)影響其轉(zhuǎn)移及侵襲能力，反而會(huì)增強(qiáng)其增殖，克隆形成能力。由此我們假設(shè)，miR-143是否會(huì)影響其細(xì)胞干性。通過檢測CD133陽性細(xì)胞的比例，結(jié)果表明CD133陽性的細(xì)胞比例明顯上升，并且乙醛脫氫酶活性驗(yàn)證了miR-143的敲低會(huì)升高肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞比例。事實(shí)上，已經(jīng)有相當(dāng)數(shù)量的報(bào)道提示miR-143與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16-17]。而腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移與腫瘤干細(xì)胞緊密相連。大多數(shù)腫瘤的治療往往歷經(jīng)較差預(yù)后，這與腫瘤細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)移，手術(shù)清掃不干凈，靶向藥藥效有限等等密切相關(guān)。其中腫瘤干細(xì)胞理論引起領(lǐng)域內(nèi)學(xué)者廣泛關(guān)注。理論上來說，腫瘤細(xì)胞(尤其是上皮樣細(xì)胞)可以通過上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化，改變腫瘤細(xì)胞的極性，可塑性[18]。重編程的腫瘤細(xì)胞能夠適應(yīng)更加惡劣的環(huán)境(例如化療，放療甚至是靶向藥治療)，作為一類種子細(xì)胞，待時(shí)機(jī)成熟，進(jìn)行定居，歸巢，進(jìn)而惡性增殖[19]。為了進(jìn)一步探究miR-143是如何影響腫瘤干細(xì)胞的比例。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測其靶基因，其中，SHP2因其在肝癌中的高表達(dá)以及其與腫瘤干細(xì)胞關(guān)系密切引起我們的注意。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也驗(yàn)證了miR-143與SHP2的確相互作用。接下來我們又驗(yàn)證了SHP2下游的ERK信號通路的活化情況。結(jié)果同樣表明EKR的磷酸化與miR-143的低表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)調(diào)控關(guān)系。以上結(jié)果均揭示了miR-143-SHP2-ERK信號通路調(diào)控了肝癌干細(xì)胞的比例。

綜上所述，此研究揭示了miR-143低表達(dá)影響肝癌惡性程度的機(jī)制，為肝癌的基礎(chǔ)研究，尤其是肝癌干細(xì)胞的研究提供一個(gè)新的視野。更為重要的是，此研究也為肝癌的臨床研究添加一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。