楊移斌，姜 蘭，宋 懌，董 靖1,，胥 寧1,，艾曉輝1,

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141)

黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)是我國(guó)重要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，因其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。在經(jīng)濟(jì)利益的推動(dòng)下，我國(guó)水產(chǎn)科技工作者突破了黃顙魚(yú)人工繁育，甚至培育出全雄黃顙魚(yú)，給養(yǎng)殖戶提供了充足的苗種需求，使得養(yǎng)殖規(guī)模及區(qū)域不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷攀升，滿足了市場(chǎng)的需求。在如此形勢(shì)下，養(yǎng)殖黃顙魚(yú)也遇到不少困難，其中之一就是病害問(wèn)題，直接導(dǎo)致黃顙魚(yú)養(yǎng)殖失敗案例比比皆是。目前黃顙魚(yú)病害主要分為兩大類，一類是生物病原性疾病，主要包括細(xì)菌性疾病[1]、真菌性疾病[2]、寄生蟲(chóng)寄生疾病[3]及病毒病[4]等；二類是非生物引起的疾病，主要包括環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)不適以及人工操作不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致的疾病[5]。病害問(wèn)題成為了養(yǎng)殖黃顙魚(yú)需要急切突破的技術(shù)瓶頸。

2018年9-10月，浙江湖州某養(yǎng)殖場(chǎng)黃顙魚(yú)出現(xiàn)體表潰爛癥，發(fā)病率很高，而且造成養(yǎng)殖黃顙賣相不好，價(jià)格低，給養(yǎng)殖戶造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。本研究就該病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，病因確定及防治藥物進(jìn)行初步篩選，以期為黃顙魚(yú)體表潰爛病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚(yú)

體表具有典型潰爛癥的黃顙魚(yú)采自浙江湖州某黃顙魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)；感染用黃顙魚(yú)(30±2)g購(gòu)于武漢江夏某養(yǎng)殖場(chǎng)，所購(gòu)黃顙魚(yú)體表無(wú)明顯傷痕，體格健壯游泳能力強(qiáng)，在玻璃缸內(nèi)暫養(yǎng)7 d后開(kāi)展試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

試劑：TCBS瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、MH瓊脂、藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自solarbio公司；2×Taq PCR Mix、引物合成、膠回收試劑盒、PMD-19T載體、瓊脂糖H及測(cè)序服務(wù)均由上海生工提供；尼泊金乙酯、丙酸鈣、脫氫乙酸鈉、山梨酸鉀、雙乙酸鈉及硫酸銅(均為化學(xué)純)均為國(guó)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑集團(tuán)出品。

儀器：PCR儀、恒溫干燥箱、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、冰箱、無(wú)菌操作臺(tái)以及電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查

對(duì)發(fā)病黃顙魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)外環(huán)境進(jìn)行調(diào)查，并檢測(cè)發(fā)病水溫、水質(zhì)及水源是否出現(xiàn)污染等情況，向養(yǎng)殖戶詢問(wèn)養(yǎng)殖黃顙魚(yú)發(fā)病情況、以往病例以及用藥情況?，F(xiàn)場(chǎng)對(duì)病魚(yú)進(jìn)行解剖，觀察發(fā)病黃顙魚(yú)鰓部及主要內(nèi)臟器官有無(wú)寄生蟲(chóng)，是否出現(xiàn)腫大、充血等病變。就本次黃顙魚(yú)發(fā)病情況，取具有體表潰爛典型癥狀的病例進(jìn)行液氮凍存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步分析。

1.2.2 病原分離

取具有典型潰爛癥(如圖1所示)的黃顙魚(yú)5尾，在其未潰爛處表面使用75%酒精進(jìn)行噴灑消毒處理，用無(wú)菌刀片刮下潰爛肌肉，無(wú)菌去掉污物后，取5小塊(0.8 cm×0.3 cm×0.2 cm)潰爛肌肉置于5個(gè)PDA平板上，同時(shí)使用經(jīng)酒精燈灼燒后的接種環(huán)蘸取潰爛組織，劃線于TCBS及普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，將PDA平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，將TCBS及普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。PDA板上的菌株進(jìn)行接種純化，最終長(zhǎng)出單一的霉菌，接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行干燥冷凍保存，暫命名HSZJ01。同時(shí)挑取TCBS及普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形狀、大小及顏色基本一致的菌落進(jìn)一步純化，獲得分離菌株的純培養(yǎng)物，加入15%的甘油混勻后置于-80 ℃保存，分別暫命名為HSZJ02、HSZJ03。

圖1 發(fā)病黃顙魚(yú)癥狀Fig.1 Symptoms of P.fulvidraco

1.2.3 人工感染

1.2.3.1 分離株HSZJ01對(duì)黃顙魚(yú)的致病性研究

將分離株HSZJ01接種于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)48 h，使得菌絲長(zhǎng)的鋪滿平板，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將60尾黃顙魚(yú)分到兩個(gè)玻璃缸進(jìn)行養(yǎng)殖，即A組和B組，每組共30尾，每尾黃顙魚(yú)均在體表輕微割傷，以不出血為準(zhǔn)。參照孫琪等水霉浸泡感染方法[6]，取數(shù)個(gè)長(zhǎng)滿菌絲的平板去掉培養(yǎng)皿后，將帶培養(yǎng)基的菌絲放入濾網(wǎng)中，置于A組養(yǎng)殖水體，使水體孢子濃度達(dá)到104個(gè)/mL，而B(niǎo)組正常養(yǎng)殖，不加入菌絲。養(yǎng)殖條件：連續(xù)充氧，水溫(25±2)℃，pH 6.8～7.5，其他水質(zhì)指標(biāo)符合漁業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。定時(shí)觀察A、B組的黃顙魚(yú)活動(dòng)情況，體表是否出現(xiàn)異常等，及時(shí)記錄，并對(duì)可能瀕死的黃顙魚(yú)進(jìn)行解剖觀察。

1.2.3.2 分離株HSZJ02、HSZJ03對(duì)黃顙魚(yú)的致病性研究

將分離株HSZJ02、HSZJ03菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，同置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

將感染用黃顙魚(yú)分為4組，每組30尾，分別為C、D、E、F組，其中C、E組養(yǎng)殖用水中分別加入分離菌株HSZJ02、HSZJ03，使其濃度分別達(dá)到104、105CFU/mL，而對(duì)照D、F組正常養(yǎng)殖，每尾黃顙魚(yú)均在體表輕微割傷，以不出血為準(zhǔn)。養(yǎng)殖條件與1.2.3.1相同。定期觀察黃顙魚(yú)游泳狀況，對(duì)發(fā)病死亡魚(yú)進(jìn)行解剖觀察，并進(jìn)行細(xì)菌再分離。

1.2.4 分離株HSZJ01分子鑒定

參照動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行HSZJ01總DNA提取，提出的總DNA即作為PCR模板。引物ITS1: 5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′和ITS4:5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC3′[7]。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mix 50 μL、ddH2O 47 μL、引物各1 μL及模板1 μL ；反應(yīng)條件：95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；35個(gè)循環(huán)； 72℃延伸10min，4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠驗(yàn)證為目的片段后進(jìn)行切膠，并進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物連接到pMD-19T 載體上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)內(nèi)，涂板后挑出單克隆并進(jìn)行陽(yáng)性驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。

1.2.5 藥物篩選

1.2.5.1 抗生素篩選

藥敏實(shí)驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，參照NCCLS抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[8]。將分離菌株HSZJ01接種于液體PDA培養(yǎng)基中，使得孢子濃度達(dá)到102個(gè)/mL，再取200 μL均勻涂布于PDA平板上，后貼上不同的藥敏紙片25 ℃培養(yǎng)36 h后測(cè)量藥物抑菌圈直徑，結(jié)果用平均直徑±SD表示。

1.2.5.2 消毒劑篩選

將尼泊金乙酯、丙酸鈣、脫氫乙酸鈉、山梨酸鉀、雙乙酸鈉及硫酸銅等化學(xué)藥物均配制成100 mg/mL的溶液，裁剪8 mm圓形紙片浸泡于各溶液中24 h，即制成藥敏紙片，置于4 ℃?zhèn)溆?。將分離菌株HSZJ01接種于液體PDA培養(yǎng)基中，使得孢子濃度達(dá)到102個(gè)/mL，再取200 μL均勻涂布于PDA平板上，后貼上不同的藥敏紙片25 ℃培養(yǎng)36 h后測(cè)量藥物抑菌圈直徑，結(jié)果同樣用平均直徑±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

本次發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)位于浙江湖州，湖州是國(guó)內(nèi)黃顙魚(yú)主要集中養(yǎng)殖地，規(guī)模達(dá)數(shù)千公頃。此次發(fā)病水面約0.7 hm2，屬黃顙魚(yú)精養(yǎng)池塘，周邊池塘養(yǎng)殖的也多是黃顙魚(yú)，發(fā)病率約60%，死亡率近40%，發(fā)病規(guī)格多為100～200 g的商品魚(yú)，并且因潰爛癥在魚(yú)體表，影響美觀，影響銷售，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)臨床診斷發(fā)現(xiàn)發(fā)病魚(yú)體表潰爛明顯，甚至爛穿漏出內(nèi)臟，鰓部有充血跡象，肝臟脂化嚴(yán)重，肝腎脾無(wú)充血，無(wú)腫大，亦未發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)，但取潰爛肌肉組織進(jìn)行鏡檢發(fā)現(xiàn)有菌絲存在?，F(xiàn)場(chǎng)水質(zhì)檢測(cè)結(jié)果為水溫24 ℃，pH 8.5，氨氮0.3 mg/L，亞硝酸鹽0.05 mg/L。據(jù)調(diào)查，黃顙魚(yú)暴發(fā)此類疾病在一年的養(yǎng)殖周期主要有兩個(gè)時(shí)間段，一是5月中旬-6月底，二是9月中下旬-10月下旬，水溫多在18～25 ℃，而水溫達(dá)到30 ℃以上則基本不發(fā)病。養(yǎng)殖在預(yù)防治療此類疾病時(shí)，多采取調(diào)節(jié)水質(zhì)，外用碘制劑消毒，內(nèi)服氟苯尼考或者恩諾沙星等藥物的方案，效果往往不是很理想，但當(dāng)消毒劑中添加硫酸銅，效果較好。

2.2 分離菌株人工感染及分子鑒定

經(jīng)人工感染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用3株分離菌株浸泡割傷的黃顙魚(yú)，僅HSZJ01浸泡實(shí)驗(yàn)組黃顙魚(yú)出現(xiàn)體表嚴(yán)重潰爛，發(fā)病率為66.67%，與自然發(fā)病癥狀類似，鏡檢可以在其潰爛肌肉中明顯發(fā)現(xiàn)菌絲，并從感染發(fā)病黃顙魚(yú)體內(nèi)再次分離到菌株HSZJ01，表明分離株HSZJ01是黃顙魚(yú)此次發(fā)病的病原。

將分離菌株HSZJ01的ITS序列放入NCBI中進(jìn)行blast比對(duì)，結(jié)果顯示HSZJ01與不規(guī)則毛霉(Mucorirregularis)同源性最高，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析(圖2)，其結(jié)果顯示HSZJ01與不規(guī)則毛霉聚為一支。因此判定HSZJ01為不規(guī)則毛霉。

2.3 藥物篩選

本次選取了5種抗生素以及6種消毒劑作為試驗(yàn)藥物，結(jié)果顯示抗生素中兩性霉素對(duì)HSZJ01抑菌效果最好，而消毒劑中硫酸銅抑菌效果最佳，具體見(jiàn)表1。

3 討論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，水產(chǎn)動(dòng)物病害日益增多，而養(yǎng)殖動(dòng)物體表潰爛癥在養(yǎng)殖過(guò)程中廣泛流行。目前已經(jīng)報(bào)道的患過(guò)此類疾病的養(yǎng)殖品種有鰻鱺(Anguillajaponica)[9]、黃鱔(Monopterusalbus)[10]、黃顙魚(yú)Pelteobagrusfulvidraco[11]、羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[12]、石斑魚(yú)(Epinephelussp)[13]、鮸魚(yú)(Miichthysmiiuy)[14]、泰山螭霖魚(yú)(Varicorhinusmacrolepis)[15]、諸氏鯔蝦虎魚(yú)(Mugilogobiuschulae)[16]、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[17]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[18]等，主要癥狀以體表潰爛為主，潰爛部位不定，主要是肌肉潰爛，發(fā)病個(gè)體無(wú)規(guī)格差異，無(wú)地區(qū)差異，但因養(yǎng)殖品種、養(yǎng)殖環(huán)境以及地理因素等，導(dǎo)致發(fā)病的病原多種多樣，有真菌[9]、細(xì)菌[11]以及浮游生物[19]等等。因水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體表潰爛癥病情復(fù)雜多變，給防控帶來(lái)了極大的麻煩，并且影響魚(yú)體美觀，銷售價(jià)格低下，因此給養(yǎng)殖戶帶來(lái)極大經(jīng)濟(jì)損失，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的一重要瓶頸。

圖2 HSZJ01株 ITS基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS gene sequence of HSZJ01 strain and its relatives

表1 菌株HSZJ01藥物篩選結(jié)果Tab.1 Antibiotic screening results

同樣隨著黃顙魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖過(guò)程中同樣病害頻發(fā)，使得黃顙魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)舉步維艱。近年來(lái)潰爛癥也時(shí)常在黃顙魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中大規(guī)模爆發(fā)，主要癥狀仍然是體表潰爛，甚至爛穿漏出內(nèi)臟，并造成死亡，逐漸成為黃顙魚(yú)養(yǎng)殖的一大危害。目前關(guān)于黃顙魚(yú)體表潰爛癥的報(bào)道也很多，但主要病原集中報(bào)道為溫和氣單胞菌[20]、擬態(tài)弧菌[21]以及維氏氣單胞菌[11]等，相關(guān)研究對(duì)黃顙魚(yú)體表潰爛癥的防控提供一定的參考意義。

本次浙江湖州出現(xiàn)黃顙魚(yú)體表潰爛癥，危害較大，主要癥狀與以往黃顙魚(yú)體表潰爛癥癥狀類似，但經(jīng)臨床診斷及病原分離共純化獲得3株分離株，分別暫命名為HSZJ01、HSZJ02及HSZJ03。經(jīng)浸泡人工感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有HSZJ01能夠使受傷黃顙魚(yú)出現(xiàn)潰爛癥，并可以從感染發(fā)病的黃顙魚(yú)潰爛體表再次分離到HSZJ01，表明HSZJ01為此次黃顙魚(yú)發(fā)病的病原。分子鑒定發(fā)現(xiàn)HSZJ01為不規(guī)則毛霉，是一種真菌，而黃顙魚(yú)暴發(fā)該病的溫度介于18～25 ℃之間，符合真菌發(fā)病條件，也佐證了分離株HSZJ01是黃顙魚(yú)此次體表潰爛癥的病原。 此次發(fā)現(xiàn)真菌導(dǎo)致黃顙魚(yú)發(fā)病的研究結(jié)果與鰻鱺腐皮病真菌病[9]存在一定的相似性。另本次黃顙魚(yú)發(fā)病與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》所列的疫病流行性潰瘍綜合征[22]癥狀存在類似，但據(jù)病原學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，本次黃顙魚(yú)發(fā)病是由不規(guī)則毛霉引起，而非絲囊霉菌，其進(jìn)一步危害值得關(guān)注。

不規(guī)則毛霉分離于一例原發(fā)性皮膚病患者。最初被命名為多變根毛霉，但隨著近年來(lái)分子生物鑒定技術(shù)的迅猛發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多變根毛霉在種系發(fā)生關(guān)系上與毛霉屬，尤其凍土毛霉具有最近的親緣關(guān)系，因此，2011年多變根毛霉被更名為不規(guī)則毛霉[23]。不規(guī)則毛霉主要引起人類繼發(fā)性皮膚感染病例，中國(guó)、澳洲、日本、美國(guó)及印度等均有病例報(bào)告。據(jù)文獻(xiàn)資料顯示，不規(guī)則毛霉為一種室外真菌，在全球都有分布，并且在土壤、動(dòng)植物以及昆蟲(chóng)腸道中廣泛存在[23]。此次發(fā)現(xiàn)黃顙魚(yú)感染不規(guī)則毛霉發(fā)病，在國(guó)內(nèi)尚屬首次。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害治療過(guò)程中，藥物仍然是重要的手段。本研究通過(guò)紙片擴(kuò)展法，研究了5種抗生素以及6種消毒劑對(duì)分離菌株HSZJ01的抑菌效果，結(jié)果顯示抗生素中兩性霉素對(duì)HSZJ01抑菌效果最好，而消毒劑中硫酸銅抑菌效果最佳，因目前尚無(wú)水產(chǎn)動(dòng)物源不規(guī)則毛霉的藥物敏感資料，因此只有參考人醫(yī)方面的數(shù)據(jù)，資料顯示不規(guī)則毛霉對(duì)兩性霉素敏感[23]，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此次藥物篩選可以為臨床防控提供一個(gè)參考，但在實(shí)際情況下，由于發(fā)病魚(yú)多食欲下降，口服療效差，采用消毒手段效果更佳。