王麗麗，朱詩君，金樹權(quán)，周金波，徐強(qiáng)

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

黃瓜枯萎病(cucumber fusarium wilt)是由黃瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌-黃瓜轉(zhuǎn)化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)入侵植株而引起的黃瓜常見土傳病害，該病原菌的侵染方式為根部侵染[1]，在露地和保護(hù)地栽培黃瓜上均可發(fā)生，連作土壤中尤其嚴(yán)重。尖孢鐮刀菌能在土壤中存活10～15年，黃瓜種子亦可帶病菌[2]，該病現(xiàn)已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)影響黃瓜生產(chǎn)的毀滅性病害。日常農(nóng)業(yè)措施易導(dǎo)致黃瓜植株地上部傷口重復(fù)感染，在感染枯萎病初期，黃瓜葉片中午萎蔫下垂，早上和晚上恢復(fù)，后期整株枯死[3]。

目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要采用田間輪作和植株嫁接的方式來防治病害，常常和施用農(nóng)藥一起配合使用，這些方式往往效果不穩(wěn)定，且會帶來一系列健康和環(huán)境問題，因此，生物防治的理念越來越受到人們的重視[4]。生物防治是通過拮抗抑制作用采用一種生物防治另外一種生物的方法。芽孢桿菌可以形成耐高溫、輻射、高酸堿等逆境的芽孢，因而篩選具備高拮抗活性的芽孢桿菌備受人們的重視。

羅文建等[5]在黃瓜根際土壤和根、莖中分離出對黃瓜枯萎病病原菌具有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌菌株，其對黃瓜枯萎病的盆栽防治效果達(dá)到66.03%。鄭新艷等[6]用篩選得到的菌株防治馬鈴薯青枯病，發(fā)現(xiàn)拮抗菌株不僅能有效拮抗青枯病病原菌，還能提高被試土壤微生物的群落多樣性，有助于克服土壤連作性障礙。本試驗從黃瓜植株根際土壤中分離和篩選出能夠抑制黃瓜枯萎病的高效拮抗菌株，通過分子鑒定初步確定為芽孢桿菌屬，并且對其進(jìn)行了田間防治試驗研究，為黃瓜枯萎病的生物防治提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根際土壤的分離與保存

根際土壤的分離一般選自黃瓜枯萎病發(fā)病嚴(yán)重地塊的健康植株根際土，本研究依據(jù)這一原則在鄞州、海曙、慈溪、江北、寧海、余姚等地共選擇根際土壤39份。將健康黃瓜植株連根拔起，輕輕抖落根部大部分的土壤，將緊貼根的土壤連同部分須根一起收集，用封口袋裝好，帶回實驗室放入4 ℃冰箱冷藏備用。

1.1.2 供試菌株和培養(yǎng)基

試驗所用的黃瓜枯萎病病原菌株由本實驗室篩選鑒定保存的1株尖孢鐮刀菌黃瓜轉(zhuǎn)化型菌株。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出液200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，加蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。

黃瓜枯萎病病原菌選擇性培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀1.0 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，乙二胺四乙酸鐵(Ⅲ)鈉0.01 g，L-天門冬酰胺2.0 g，D-半乳糖20.0 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。待冷卻至60 ℃左右時加入五氯硝基苯1 g，牛膽汁0.5 g，硼砂1.0 g，硫酸鏈霉素0.3 g，調(diào)節(jié)pH至3.8左右。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.2 黃瓜枯萎病拮抗菌的分離與篩選

微生物菌株的分離：稱取1.1.1節(jié)中保存的根際土樣10 g，依次放入含有90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，放入搖床振蕩30 min后用無菌水依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。取10-6、10-7和10-8各100 μL涂布至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)。

拮抗菌株的篩選：將黃瓜枯萎病病原菌活化后用真菌打孔器打取直徑6 mm的菌絲塊置于PDA平板中間，將平板在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將分離到的細(xì)菌菌落用滅菌過的牙簽點(diǎn)接于病原菌菌苔周圍，28 ℃下恒溫培養(yǎng)72 h，觀察黃瓜枯萎病病原菌的生長情況及有無抑菌圈出現(xiàn)，將未接種細(xì)菌菌落的平板作為對照，選擇抑菌效果好的菌株進(jìn)一步進(jìn)行劃線純化，將純化后的菌株進(jìn)行多次平板對峙試驗，觀察其抑菌效果是否穩(wěn)定并計算其抑菌率。

1.3 菌株16S rDNA鑒定

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌株的全基因組DNA，所用的擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rRNA 基因的通用引物：F：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′；R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存[7]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行16S rDNA序列同源性比較，然后用軟件MEGA5.0以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.4 拮抗菌株對黃瓜枯萎病的生物防治效果

田間試驗設(shè)置2個處理：處理1，施用等量清水；處理2，施用拮抗菌株發(fā)酵液(有效活菌含量1.0×1010mL-1以上)，每周1次，每株黃瓜灌根10 mL發(fā)酵液，總共施用3次。統(tǒng)計黃瓜枯萎病病情指數(shù)和計算防治效果[8]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜枯萎病拮抗菌株的分離與篩選

經(jīng)篩選共分離出87株形態(tài)不同的拮抗菌株，通過對黃瓜枯萎病病原菌的初次篩選，其中11株具有抑菌效果，經(jīng)過多次純化及復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，菌株15對尖孢鐮刀菌的抑菌效果最好，且其抑制效果比較穩(wěn)定，其抑菌率能達(dá)到51.2%(圖1)。

圖1 菌株15對黃瓜尖孢鐮刀菌的平板抑制效果

2.2 拮抗菌株的16S rDNA基因鑒定

測序結(jié)果表明，菌株15的16S rDNA序列長度為1 421 bp。將菌株15序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性檢索，通過MEGA5.0軟件以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，菌株15與菌株BacillusamyloliquefaciensCAU B946(NC 016784.1)親緣關(guān)系最近。

圖2 菌株15與芽孢桿菌屬相關(guān)菌株基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

2.3 拮抗菌株對黃瓜枯萎病的生物防治效果

從表1可知，施用菌株15拮抗菌菌劑能有效防治田間黃瓜枯萎病的發(fā)生。菌株15能有效降低黃瓜枯萎病田間病情指數(shù)，2次灌菌后的防效達(dá)到23.5%，灌菌3次后的防治效果能達(dá)到44.4%。

表1 拮抗菌株15對黃瓜枯萎病的田間防治效果

3 討論

微生物是在土壤中廣泛存在的，每克土壤中常有幾億到幾百億微生物，其在土壤中發(fā)揮著極其重要的作用，并處于平衡的發(fā)展，但目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，由于化肥農(nóng)藥等化學(xué)元素的使用，使得土壤原有的微生物生態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致土壤中有益微生物種群減少，有害微生物增多，最終導(dǎo)致植株病害增多。

目前，黃瓜枯萎病在生產(chǎn)上主要還依賴于化學(xué)農(nóng)藥的防治，雖然在一定程度上有效控制了該病害的危害，但仍舊無法從根本上解決該病的發(fā)生[9]。利用拮抗菌株防治植物土傳病害目前已經(jīng)有很多報道，拮抗菌株可在一定程度上改善土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對植株本身生長環(huán)境有益[10]，本試驗從黃瓜根際土壤中分離出1株高效拮抗黃瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌的拮抗菌株，經(jīng)過16S測序初步鑒定為芽孢桿菌屬，對其田間生防效果進(jìn)行試驗，其對黃瓜枯萎病的防治效果最高可達(dá)44.4%。