高巧營，趙 凱

(1. 天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所, 天津 300100； 2. 天津市南開醫(yī)院心血管內(nèi)科, 天津 300100)

近年來，隨著對比劑的廣泛應用，對比劑腎病(contrast-induced nephropathy, CIN)發(fā)病率逐年升高,已成為三大醫(yī)源性急性腎損傷之一[1-2]。CIN是指在排除其他原因的前提下，血管內(nèi)應用對比劑72 h內(nèi)發(fā)生的腎功能急性損害或腎功能損害加重[3]。糖尿病是發(fā)生CIN最常見的危險因素之一[4]。對比劑可直接損傷腎小管，誘導腎細胞凋亡，加劇腎損傷[5]。線粒體Bcl-2家族中的抗凋亡基因B細胞淋巴瘤/白血病-2(b-cell lymphoma/ leukemia-2，Bcl-2)和促凋亡基因Bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)(Bcl-2 related X protein，Bax)是細胞凋亡內(nèi)源性途徑中最具代表性的調(diào)控因子,可激活天冬-半胱氨酸特異性蛋白酶家族(cysteinyl aspartate-specific proteases，caspase)信號通路促進腎細胞凋亡。

目前對CIN有確切防治效果的藥物并不多見。冬蟲夏草是一種名貴蟲草屬植物類藥用真菌，具有補益肺脾、滋補腎臟之功效，可降低血尿素氮和尿蛋白[6]，調(diào)節(jié)腎組織表皮生長因子表達，促腎小管修復和再生[7]。糖尿病患者給予冬蟲夏草干預后行介入診療時CIN的發(fā)生率明顯降低，且患者Scr、BUN、KIM-1指標等都有明顯改善[8-9]。目前關(guān)于冬蟲夏草預防CIN發(fā)生的分子機制研究較少。本研究通過建立糖尿病CIN大鼠模型，檢測不同劑量冬蟲夏草干預后大鼠腎細胞的凋亡情況及Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2表達情況，探討其對模型大鼠腎細胞中線粒體凋亡途徑的影響，分析其預防CIN保護腎損傷的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量(250±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號 SCXK(京)2016-0011)。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；碘克沙醇注射液(美國GE公司)；冬蟲夏草原粉(杭州中美華東制藥有限公司惠贈)。血清肌酐(serum creatinine，Scr)及尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)試劑盒(南京建成科技有限公司)；腎損傷因子(kidney injury molecule 1，KIM-1)和中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase related apolipoprotein，NGAL)檢測試劑盒(上海藍基生物有限公司)；TUNEL 試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，動物組織RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；Caspase-3抗體、Caspase-9抗體、Bcl-2 抗體、Bax抗體、β-actin(美國Santa Crua生物技術(shù)有限公司)。IQ5型熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Biorad公司)；LEICA DM4000B正置顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 大鼠模型建立及分組

參照文獻[10]制備動物模型。SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，造模前大鼠斷尾測血糖。隨機選取8只大鼠為正常組，其余大鼠禁食12 h后稱重，經(jīng)腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(60 mg/kg)建立糖尿病模型，72 h及7 d斷尾測血糖，以非禁食血糖≥l6.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型是否成功。按隨機數(shù)字表法將糖尿病成模大鼠40 只分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組各10只。飼養(yǎng)9周后，三蟲草干預組大鼠給予冬蟲夏草原粉(2.0 g/kg、2.5 g/kg、3.0 g/kg)配置的懸液灌胃，正常組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。第8天，除正常組以其余大鼠均經(jīng)尾靜脈緩慢注射碘克沙醇(2.0 g iodine/kg)制備CIN模型。于注射碘克沙醇前及24 h后，大鼠經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血1 mL，離心留取上清測定血清Scr。以血清Scr較基線升高超過25%以上為模型成功判定標準[11]。

2.2 實驗取材

注射對比劑后將大鼠置于代謝籠中，收集大鼠24 h尿液。10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠稱重，迅速分離雙腎。左腎置于10%中性福爾馬林中固定，用于病理檢測；右腎儲存于-80 ℃冰箱，用于氧化應激指標，基因及蛋白測定。

2.3 指標檢測

2.3.1 腎功能及腎損傷指標 脲酶法測定血清BUN，苦味酸法測定血清Scr，應用ELISA法檢測尿NGAL、KIM-1。

2.3.2 腎勻漿氧化應激指標 每100 mg腎組織加入0.9 mL 0.9%的氯化鈉溶液中研磨，制成10%腎組織勻漿，3000 r/min離心15 min，取上清。硝酸還原酶法測定NO，黃嘌呤氧化酶法測SOD，硫代巴比妥酸法測定MDA，比色法測定T-AOC。

2.3.3 Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2 mRNA表達 表1顯示，依據(jù)試劑盒說明提取大鼠腎組織總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。反應體系20 μL：模板1 μL，上下游引物(10 μM) 各0.4 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 8.2 μL。反應程序為: 94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s,56 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共43個循環(huán)；72 ℃ 10 min延伸后結(jié)束。每份樣本進行3個復孔測定，結(jié)果應用2-△△Ct法[12]進行分析。

表1 引物序列

2.3.4 Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達 將50 mg取腎組織加入500 μL裂解液中進行勻漿，參照試劑盒說明提取總蛋白。應用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。將蛋白濃度均一化為2 mg/mL，進行熱變性、電泳、轉(zhuǎn)模封閉2 h。單克隆抗體4 ℃孵育過夜后，漂洗4次5 min。二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光法發(fā)光成像，以β-actin為內(nèi)參。

2.3.5 Tunel細胞凋亡檢測 固定的腎組織進行常規(guī)脫水、包埋、切片。切片進行脫蠟2次，每次5 min；水合2次，每次5 min。蛋白酶K通透，37℃ 30 min，3% H2O2室溫封閉20 min，50 μL TdT酶反應液37℃避光反應60 min。50 μL Streptavidin-HRP工作液進行標記，37℃避光反應30 min。50 μL DAB工作液顯色，室溫反應1 min。蘇木素常規(guī)復染。酸化和反藍后中性樹膠封片并觀察。

2.3.6 腎組織病理檢測 切片按常規(guī)方法進行脫蠟，梯度濃度乙醇洗去二甲苯，進行蘇木素染色。經(jīng)酸化和反藍后，進行伊紅染色2 min，水洗30 s。再行脫水、透明，應用中性樹膠封片后觀察。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 腎功能及腎損傷指標

表2顯示，模型組大鼠BUN、Scr、NGAL和KIM-1水平均高于正常組(P<0.05)。給予蟲草干預后，低劑量組Scr水平降低(P<0.05)，而BUN、NGAL和KIM-1與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中、高劑量組BUN、Scr、NGAL和KIM-1水平均低于模型組(P<0.05)，高劑量組BUN、Scr和NGAL水平均低于低劑量組(P<0.05)。

表2 藥物干預后大鼠腎功能及腎損傷指標變化比較

注：BUN:尿素氮；Scr:血清肌酐；NGAL:中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白；KIM-1:腎損傷因子-1。與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較：▲P<0.05；與中劑量組比較：#P<0.05

3.2 氧化應激指標

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠NO、SOD和T-AOC含量降低，而MDA含量升高(P<0.05)。與模型組比較，3干預組NO含量均升高，MDA含量均降低(P<0.05)，中、高劑量組SOD含量升高(P<0.05)，高劑量組T-AOC含量亦明顯升高(P<0.05)。

表3 給予藥物干預后大鼠腎臟NO、NOS、MDA、T-SOD、T-AOC變化比較

注：NO:一氧化氮； MDA:丙二醛；T-SOD:總超氧化物歧化酶；T-AOC:總抗氧能力。與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與低劑量組比較：▲P<0.05；與中劑量組比較：#P<0.05

3.3 Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2 基因與蛋白表達

注：1.正常組；2.模型組；3.低劑量組；4.中劑量組；5.高劑量組圖1 各組大鼠Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白電泳圖

表4圖1顯示，與正常組比較，模型組大鼠Caspase-3和Caspase-9表達升高，Bcl-2與Bcl-2/Bax比值均降低(P<0.05)。與模型組比較，低劑量組大鼠Caspase-3和Bax表達降低(P<0.05)，而Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)；中、高劑量組Caspase-3、9和Bax水平降低(P<0.05)，Bcl-2與Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。

3.4 Tunel細胞凋亡改變

圖2顯示，正常組大鼠腎組織僅見少量凋亡細胞，模型組大鼠腎組織凋亡細胞(黑色箭頭)數(shù)量增多。低、中劑量組腎臟凋亡細胞數(shù)量有所減少，高劑量組大鼠腎細胞凋亡數(shù)量明顯減少。

3.5 腎臟病理改變

圖3顯示，正常組大鼠腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)基本正常。模型組腎小管管腔擴張或萎縮，可見炎性細胞浸潤，大量空泡樣變性、變形或局部壞死(黑色箭頭所示)；腎小球基底膜增厚。低、中劑量組大鼠腎組織的病理變化基本同模型組，高劑量組腎小管結(jié)構(gòu)破壞減少，損傷有所改善。

表4 藥物干預后大鼠腎臟Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2基因表達水平比較

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與低劑量組比較：▲P<0.05；與中劑量組比較：#P<0.05

圖2 各組大鼠原位腎組織凋亡細胞比較(Tunel ×400)

圖3 各組大鼠腎組織病理改變比較(HE染色 ×200)

4 討論

隨著對比劑的臨床應用增多，CIN患病率逐年上升。中醫(yī)根據(jù)CIN患者的少尿或無尿等癥狀，將其歸為“癃閉、關(guān)格、溺毒”，將對比劑歸為“藥毒、外邪”[13]。CIN患者多體虛，氣虛無力布化津液、無力行血，無力抵御“對比劑”入侵，致使?jié)耩龆鞠嗷ゲY(jié)致氣血運行逆亂，臟腑功能失調(diào)，三焦氣化失司，水液輸布紊亂，最終出現(xiàn)“癃閉、關(guān)格”等癥狀。冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌，其味甘性溫，歸腎肺二經(jīng)，有補肺平喘、益腎壯陽、益氣生精等功效。邱昌建等[14]研究表明，冬蟲夏草可提高SOD和GPX含量，降低MDA含量，起到清除氧自由基、抗氧化損傷的作用。張莉等[15]發(fā)現(xiàn)，它可促進糖尿病腎病大鼠腎小管細胞的修復再生，改善腎功能。我們發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草可預防冠心病穩(wěn)定型心絞痛及急性冠脈綜合征患者介入術(shù)后CIN的發(fā)生[9]。這些均與冬蟲夏草補氣、滋補腎臟、改善患者體虛的功效有關(guān)。

本研究應用腹腔注射鏈脲佐菌素及碘克沙醇成功制備糖尿病CIN大鼠模型，結(jié)果顯示模型組大鼠血清BUN、Scr、NGAL和KIM-1均高于正常組。給予冬蟲夏草干預后，上述4個指標有所降低，可見冬蟲夏草能夠改善糖尿病CIN大鼠的腎功能，減輕腎損傷。CIN發(fā)病機制包括腎小管氧化應激損傷，氧自由基及脂質(zhì)過氧化物生成增多，縮血管物質(zhì)釋放增加加重腎缺血缺氧，腎小管細胞凋亡。SOD是防御內(nèi)外環(huán)境中超氧離子損傷的重要酶,可特異性清除氧自由基，是反映腎臟及機體氧化應激狀態(tài)的重要指標。本研究模型組大鼠MDA含量升高，NO、SOD和T-AOC含量降低。給予冬蟲夏草干預后，3組大鼠MDA含量均降低，高劑量組大鼠NO、SOD和T-AOC指標明顯升高。由此可知，冬蟲夏草可增加腎組織NO含量，改善腎臟微循環(huán)，增加腎血流，減輕腎缺血狀態(tài)。蟲草還可抑制增加SOD和T-AOC含量，增強自由基清除，降低MDA含量，減少脂質(zhì)過氧化反應，增強抗氧化應激反應。

細胞凋亡信號傳遞的內(nèi)源性途徑由線粒體途徑介導，線粒體Bcl-2家族是其最主要的調(diào)控因子，其中抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax最具代表性。前者能阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，后者主要促進細胞凋亡。Bcl-2/Bax比值增加，細胞趨于存活，比值下降，細胞趨于凋亡。線粒體caspase信號通路的激活在凋亡過程中亦起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟Caspase-3和Caspase-9 表達水平升高，Bcl-2與Bcl-2/Bax比值降低。這與相關(guān)文獻結(jié)果相似[16]。干預后，低劑量組大鼠Caspase-3和Bax表達降低，Bcl-2/Bax比值升高；中、高劑量組Caspase-3、9和Bax表達降低，Bcl-2與Bcl-2/Bax比值明顯升高；高劑量組Bcl-2/Bax比值均高于低、中劑量組。由此推論，冬蟲夏草可下調(diào)Caspase-3、9和Bax表達水平，上調(diào)Bcl-2及Bcl-2 /Bax比值，經(jīng)線粒體Bcl-2家族傳遞“保護”信息，抑制caspase-3、9通路的激活，減輕腎細胞凋亡，保護腎臟損傷。這與高劑量大鼠腎凋亡細胞減少和腎小管結(jié)構(gòu)破壞減少相符。

綜上所述，冬蟲夏草預防糖尿病大鼠CIN發(fā)生，可改善腎功能；增強機體抗氧化應激能力，改善腎缺血缺氧；上調(diào)Bcl-2 /Bax比值，抑制Caspase-3/9通路的激活，通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑重要因子減輕腎細胞凋亡。高劑量冬蟲夏草對糖尿病CIN大鼠腎損傷的保護作用更強。