劉婧嫻， 李媛睿， 阿旺窮吉， 劉 瑛

肺炎克雷伯菌是導(dǎo)致醫(yī)院感染的最常見的條件致病菌之一。近年來，隨著臨床上碳青霉烯類抗生素的廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）分離率逐年增加，據(jù)2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示腸桿菌科細(xì)菌中CRE的分離率逐年上升，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）上升尤為顯著[1]。CRKP所引起的感染性疾病具有高發(fā)病率和高病死率等特點(diǎn)。由于兒童患者的自身免疫力較低更容易感染CRKP，而此類菌株通常呈多重耐藥，這給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。本研究通過探討上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒科患者CRKP的耐藥機(jī)制，以期為治療兒科患者CRKP感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2010年1月-2016年12月從我院兒科患者臨床標(biāo)本中分離到的非重復(fù)CRKP 197株，菌株接種于甘油肉湯，-80 ℃保存。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和肺炎克雷伯菌ATCC 700603，均由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌（LYKPC）由上海市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。產(chǎn)IMP、VIM酶銅綠假單胞菌（RJIMP、RJVIM）由上海瑞金醫(yī)院微生物科惠贈(zèng)，產(chǎn)NDM-1及產(chǎn)OXA-232肺炎克雷伯菌為本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)分離并通過基因測(cè)序確定為攜帶相應(yīng)基因的菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器 血平皿、麥康凱平皿、巧克力平皿、選擇性巧克力平皿和MH平皿均購(gòu)自上海伊華生物技術(shù)有限公司，LB肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）購(gòu)自德國(guó)Bruker Dahonik公司，VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、菌種鑒定卡（GNI）和藥敏鑒定卡（GNl3）購(gòu)自法國(guó)Bio Mérieux公司，亞胺培南、美羅培南、厄他培南藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，水平電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司，PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 菌株復(fù)蘇后采用MALDI-TOF MS重新鑒定復(fù)核，鑒定結(jié)果與原始VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果一致的菌株納入本研究。

1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn) 采用VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)聯(lián)合紙片擴(kuò)散法對(duì)菌株重新進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，包括氨芐西林、頭孢唑林、頭孢美唑、頭孢呋辛鈉、頭孢替坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、氨芐西林-舒巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星、 左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶-磺胺甲唑等。按照2017年CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果[2]。對(duì)美羅培南、亞胺培南和厄他培南等碳青霉烯類抗生素一種或一種以上耐藥的菌株定義為CRKP[3]。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 煮沸法提取細(xì)菌總DNA作為PCR反應(yīng)模板[4]。PCR方法擴(kuò)增blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaOXA等常見碳青霉烯酶基因[4]。引物序列、反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn) [4]。反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠的加樣槽中，120 V/cm條件下電泳40 min。電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠置于紫外凝膠成像儀中觀察結(jié)果并攝片。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司采用Sanger法進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 菌株臨床資料 收集菌株標(biāo)本來源、分離時(shí)間、科室分布，以及菌株對(duì)應(yīng)患者的臨床信息，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 鑒定及藥敏結(jié)果

2010年1月-2016年12月兒科患者臨床標(biāo)本中共收集到197株CRKP，采用MALDI-TOF MS復(fù)核鑒定結(jié)果均為肺炎克雷伯菌。197株CRKP對(duì)亞胺培南、美羅培南和厄他培南的耐藥率分別為93.4%、96.0%和100%，對(duì)大部分頭孢菌素類藥物耐藥率達(dá)100%，個(gè)別菌株對(duì)頭孢美唑、頭孢替坦和頭孢吡肟以及β內(nèi)酰胺類酶抑制劑復(fù)合制劑保持敏感。CRKP菌株對(duì)喹諾酮類的耐藥率也較高，如左氧氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥率分別為61.4%和62.4%，對(duì)氨基糖苷類藥物以及甲氧芐啶-磺胺甲唑仍保持較高的敏感率。見表1。

表1 分離自兒科患者CRKP對(duì)抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 1 Susceptibility of carbapenem-resistant K. pneumoniae isolated from pediatric patients to antimicrobial agents（%）

2.2 碳青霉烯類耐藥基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

PCR及測(cè)序結(jié)果顯示，197株CRKP中113株（57.4%）攜帶KPC-2基因，其次為NDM-5、NDM-1和IMP-4。10株（5.1%）檢出2種或2種以上碳青霉烯酶基因，12株（6.1%）未檢測(cè)到本研究所包含的碳青霉烯酶基因。見表2。

表2 197株CRKP碳青霉烯類耐藥基因結(jié)果Table 2 Carbapenemase genes identi fied in 197 strains of carbapenem-resistant K. pneumoniae

2.3 臨床資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果

197株CRKP中89株（45.2%）取自痰液標(biāo)本，其次為尿液、分泌物、全血、胸腹水和導(dǎo)管，分別占17.8%（35/197）、12.2%（24/197）、7.6%（15/197）、6.6%（13/197）和4.6%（9/197）。絕大部分CRKP分離自ICU，其次為兒外科和新生兒病區(qū)。兒科ICU和兒外科檢出的耐藥基因以KPC-2為主，而新生兒科檢出的則以NDM基因?yàn)橹鳎ㄒ姳?）。197株CRKP分離自163例住院患兒，患兒的平均住院天數(shù)為（39±37）d，感染產(chǎn)KPC菌株的患者較感染產(chǎn)NDM菌株的患者平均住院時(shí)間稍長(zhǎng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；絕大部分患者為醫(yī)院獲得性感染，占92.6%（151/163）；8.0%（13/163）患者攜帶CRKP時(shí)間大于1個(gè)月，CRKP類型多為產(chǎn)KPC酶（8例）和產(chǎn)NDM酶（4例）的菌株；11.0%（18/163）患者多個(gè)部位檢出CRKP，這些菌株大多攜帶KPC基因（13例）；84.7%（138/163）患者最終好轉(zhuǎn)出院，13.5%（22/163）患者自動(dòng)出院，3例死亡。

3 討論

過去的二十余年，CRKP在全球范圍內(nèi)迅速傳播，此類菌株多攜帶KPC、NDM等碳青霉烯酶基因，表現(xiàn)出對(duì)碳青霉烯類抗生素高度耐藥，給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。近年來，CRKP在兒科患者中的檢出率逐漸增高，而兒科患者中分離的CRKP遺傳背景與成人有所不同，通常不是當(dāng)前廣泛流行的克隆株[5]。CRKP感染對(duì)患兒預(yù)后造成的不良影響也亟需引起重視。最近，一項(xiàng)多中心隊(duì)列研究顯示，感染CRE患兒30 d死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯高于感染碳青霉烯類敏感腸桿菌科細(xì)菌（CSE）的患兒[6]。因此，了解兒科患者中CRKP的耐藥機(jī)制特點(diǎn)，對(duì)于有針對(duì)性地實(shí)施治療非常重要。

表3 CRKP科室分布Table 3 The distribution of carbapenem-resistant K. pneumoniae by clinical setting

本組資料兒科患者中分離的CRKP最早于2010年檢出，2014年以前CRKP呈低水平流行，2014年以后檢出數(shù)劇增。CRKP的上升趨勢(shì)與產(chǎn)KPC菌株的檢出量呈正相關(guān)，2015年開始出現(xiàn)大規(guī)模流行，菌株所攜帶的碳青霉烯酶基因類型豐富多樣（見表4）。本研究?jī)嚎苹颊吲R床標(biāo)本中的CRKP菌株有57.4%攜帶KPC-2基因，遠(yuǎn)高于兒童?？漆t(yī)院2018年22%的報(bào)道[7]。本研究共檢出27株攜帶NDM-1基因的CRKP，2014年底產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌曾在兒科ICU引起過小規(guī)模的暴發(fā)流行，隨后其他科室也出現(xiàn)播散。2015年5月本院首次從1例兒外科患兒分離到產(chǎn)NDM-5酶CRKP，隨后，產(chǎn)NDM-5酶菌株迅速播散，截至2016年其檢出數(shù)已超過NDM-1菌株。產(chǎn)IMP-4酶菌株出現(xiàn)最早，但未出現(xiàn)流行，其耐藥程度較產(chǎn)NDM和KPC酶的菌株低。值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)10株同時(shí)攜帶2 種或2種以上碳青霉烯酶基因的CRKP，目前在國(guó)內(nèi)有關(guān)產(chǎn)多種碳青霉烯酶的相關(guān)報(bào)道較少。虞濤等[8]在2011年報(bào)道了8株同時(shí)攜帶KPC-2及IMP-4基因的菌株在兒童中暴發(fā)流行。本研究還檢出攜帶有OXA-232基因的菌株，該基因通常與其他碳青霉烯酶基因，如KPC-2等共存。OXA-232酶屬于D 類碳青霉烯酶，大多數(shù)對(duì)碳青霉烯類水解能力較低，不能水解氨曲南，常與其他耐藥機(jī)制協(xié)同導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。上海地區(qū)也曾有在兒科患者中檢出攜帶OXA-232基因CRKP的相關(guān)報(bào)道[9]。本研究尚有12株菌未檢測(cè)到耐藥基因，推測(cè)這些菌株可能攜帶較少見的碳青霉烯酶基因或者存在除產(chǎn)碳青霉烯酶以外的耐藥機(jī)制。

表4 不同年份各耐藥基因檢出情況Table 4 Prevalence of carbapenemase genes by year

本組資料兒科患者中分離的CRKP耐藥程度低于我院CRKP總體耐藥水平[10]。雖然菌株對(duì)喹諾酮類的耐藥率高達(dá)60%以上，但菌株對(duì)氨基糖苷類藥物以及甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率僅約15.7%～30.5%。由于氨基糖苷類、磺胺類藥物毒性較大，通常不建議用于兒科患者，即使在體外藥敏試驗(yàn)中顯示敏感，在兒科患者抗感染治療中選擇此類藥物仍需謹(jǐn)慎。頭孢他啶-阿維巴坦是2015年FDA正式批準(zhǔn)用于治療CRE感染的新藥，此類藥物對(duì)于產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌感染療效顯著，但不適用于產(chǎn)NDM和OXA酶菌株感染的治療[11]。本研究顯示，兒科患者中，產(chǎn)NDM和OXA酶的菌株亦占據(jù)很大比例，故對(duì)于兒科患者，除非已明確引起感染的CRKP產(chǎn)KPC酶，否則不應(yīng)建議經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用頭孢他啶-阿維巴坦進(jìn)行抗CRKP感染治療。雖然NDM、IMP等基因陽(yáng)性的CRKP通常同時(shí)攜帶超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）基因而表現(xiàn)出對(duì)氨曲南高度耐藥，但NDM、IMP等金屬酶并不能水解氨曲南，因此，對(duì)于金屬酶陽(yáng)性的菌株，可考慮碳青霉烯類或頭孢他啶-阿維巴坦等能抑制ESBL的抗菌藥物聯(lián)合氨曲南進(jìn)行治療[12]。最近，Tan?r Basaranoglu等[13]報(bào)道，兩種碳青霉烯類抗菌藥物聯(lián)合多黏菌素或氨基糖苷類藥物也能成功治療兒童多重耐藥肺炎克雷伯菌感染。

加強(qiáng)醫(yī)院感染預(yù)防控制措施是阻斷CRKP在兒科患者中流行的關(guān)鍵。本組資料顯示兒科患者CRKP目前流行范圍廣泛，涉及新生兒科、兒內(nèi)科、兒外科、兒科ICU等各個(gè)科室，其中以兒科ICU檢出量最多，這可能與ICU相對(duì)較為封閉，患者病情較重、抗生素暴露和侵襲性操作率較高，住院時(shí)間較長(zhǎng)等因素有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，攜帶KPC基因和NDM基因的菌株更容易引起多部位感染和長(zhǎng)時(shí)間定植于宿主體內(nèi)。為避免CRKP的流行范圍進(jìn)一步擴(kuò)散，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)KPC酶和NDM酶菌株的監(jiān)測(cè)，對(duì)兒科ICU、新生兒ICU等流行嚴(yán)重的病區(qū)進(jìn)行干預(yù)，如加強(qiáng)手衛(wèi)生、接觸隔離、對(duì)CRKP感染患兒進(jìn)行標(biāo)識(shí)、必要時(shí)對(duì)感染患者進(jìn)行隔離等措施。

綜上所述，CRKP在本院兒科患者中的流行情況愈演愈烈，其耐藥程度高，所攜帶的耐藥基因種類繁多，應(yīng)引起足夠重視。對(duì)于兒科ICU等CRKP存在流行的科室應(yīng)加強(qiáng)感控措施，以避免耐藥菌株進(jìn)一步流行播散。