孔德松，張自力，張 峰，鄭仕中

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院科研部，江蘇 南京 210001；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇 南京 210023；3. 江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)的大量生成與活化是肝纖維化過程中的核心環(huán)節(jié)[1-2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，肝細(xì)胞經(jīng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞后，對(duì)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展起重要作用，我們的前期研究也得到了同樣的結(jié)論[6]。抑制肝細(xì)胞EMT過程，減少M(fèi)FB的生成，將是減緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效措施。姜黃素(curcumin)的藥理作用與臨床開發(fā)一直是國(guó)內(nèi)外制藥領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)之一[7-8]，臨床應(yīng)用前景十分誘人。我們的研究表明，姜黃素可以有效抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化，具有很強(qiáng)的體內(nèi)外抗肝纖維化作用，姜黃素在各類肝損傷中對(duì)肝細(xì)胞具有選擇性保護(hù)作用[9-10]。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，在姜黃素抗纖維化作用的研究中，涉及肝細(xì)胞EMT調(diào)控機(jī)制研究的報(bào)道較少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞EMT進(jìn)程，減少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的生成[6]，但參與調(diào)控的具體機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入研究。

大量研究證實(shí)，自噬在非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝癌等肝臟疾病的發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[11-14]。在肝細(xì)胞內(nèi)，自噬通過清除錯(cuò)誤折疊蛋白、過度積累的脂類(脂肪分解)和(或)受損的線粒體(線粒體自噬)等途徑，保證肝臟細(xì)胞的能量供給，從而維持肝臟細(xì)胞的自穩(wěn)態(tài)[15]。我們?cè)谇捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肝纖維化小鼠肝細(xì)胞的整體自噬水平是下降的，在缺氧環(huán)境下的，隨著時(shí)間的推移，肝細(xì)胞自噬水平先是有所增加，后逐漸下降。最新研究表明，肝損傷進(jìn)程中，肝細(xì)胞的自噬與EMT之間可相互調(diào)節(jié)，自噬可降低Snail蛋白的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞EMT進(jìn)程，同樣EMT也可影響肝細(xì)胞內(nèi)的自噬流[16]。為此，我們推測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)自噬流的變化與肝細(xì)胞的EMT及向MFB轉(zhuǎn)變存在著重要關(guān)聯(lián)。本文旨在探討姜黃素對(duì)肝細(xì)胞自噬及EMT的干預(yù)效應(yīng)，進(jìn)一步深入闡釋姜黃素的抗肝纖維化作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL CL.2，購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 藥物與試劑姜黃素(純度>99%，美國(guó)Sigma公司)；干擾質(zhì)粒構(gòu)建(南京謹(jǐn)庭生物科技有限公司)；蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)(Cell Signal公司)；波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)、Beclin-1、LC3抗體(Abcam公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real time-PCR用試劑(Bio-Rad公司)。

1.3 儀器DM1L倒置光學(xué)顯微鏡(德國(guó)萊卡)；SPECTRA MAX 190可見-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司)；Mini Protean 3 Cell電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；GS-15R冷凍離心機(jī)、MSD97K49微量離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；PCR儀(美國(guó)AB公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL CL.2，分為5組：正常對(duì)照組、模型組、姜黃素低、中、高劑量(10、20、30 μmol·L-1)組，以TGF-β1(2 μg·L-1)處理細(xì)胞，同時(shí)給予姜黃素干預(yù)，作用24 h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

按文獻(xiàn)方法構(gòu)建BECN1與陰性對(duì)照(CTR)基因的干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL CL.2，得兩種體外細(xì)胞模型：自噬基因沉默(siBECN1，模型細(xì)胞1)及對(duì)照(siCTR，模型細(xì)胞2)用于實(shí)驗(yàn)[16]。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、TGF-β1刺激組、BECN1 siRNA組、CTR siRNA組、姜黃素組、BECN1 siRNA+姜黃素組、CTR siRNA+姜黃素組，共7組。除正常對(duì)照組外，其余各組均以TGF-β1(2 μg·L-1)處理細(xì)胞，同時(shí)給予姜黃素干預(yù)，作用24 h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.2 Western blot檢測(cè)BNL CL.2肝細(xì)胞自噬、細(xì)胞表型及纖維化標(biāo)志物蛋白表達(dá)細(xì)胞干預(yù)處理后，加入預(yù)冷RIPA裂解液，立即加入PMSF和磷酸酶抑制劑，冰上孵育30 min，移入離心管，4℃、15 000 r·min-1離心15 min，取上清液為細(xì)胞裂解液。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加上樣緩沖液，沸水浴10 min。SDS-PAGE凝膠電泳(上樣量50 μg)，100 V轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂奶粉封閉。根據(jù)實(shí)驗(yàn)前處理，分別加入一抗：肝細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1、LC3)、細(xì)胞表型相關(guān)蛋白(Vimentin)及纖維化標(biāo)志物α-SMA，然后孵育二抗，化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色。

2.3 Real-time PCR檢測(cè)BNL CL.2肝細(xì)胞自噬、細(xì)胞表型及纖維化標(biāo)志物基因表達(dá)按TRIzol Reagent說明書提取細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀測(cè)定RNA含量。將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。PCR以GAPDH為內(nèi)參，所用特異性引物序列見Tab 1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)基于比較CT(threshold cycle)值法，每個(gè)樣本的mRNA含量用各內(nèi)參GAPDH含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.4 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL CL.2，用0.25%胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于12孔板中(1×105個(gè)/孔)。至細(xì)胞80%貼壁后，按“2.1”干預(yù)分為7組，顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.5 GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞的篩選按照質(zhì)粒小量抽提純化試劑盒說明書提取質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP-LC3。采用Effectene Transfection Reagent介導(dǎo)方法，將pcDNA3.1-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BNL CL.2肝細(xì)胞，按說明書操作，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后加入G418工作液，終濃度為800 mg·L-1，每3～5 d更換培養(yǎng)液，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的BNL CL.2肝細(xì)胞作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)14 d后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞有抗藥克隆長(zhǎng)出，而陰性對(duì)照組細(xì)胞全部死亡。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞有限稀釋，并克隆化培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)5 d后，挑選單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)孔于倒置熒光顯微鏡下觀察，有綠色熒光的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。待孔中細(xì)胞增殖至約50%融合度時(shí)，相繼傳代于24孔、6孔培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素增強(qiáng)BNL CL.2肝細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白與基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞間質(zhì)型及纖維化標(biāo)志物蛋白與基因的表達(dá)Fig 1的Western blot結(jié)果表明，TGF-β1刺激后，BNL CL.2肝細(xì)胞間質(zhì)型標(biāo)志物Vimentin及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)增加，而細(xì)胞自噬水平降低，Beclin-1與LC3表達(dá)下降；姜黃素能夠降低Vimentin與α-SMA的表達(dá)，同時(shí)升高細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果(Tab 2)與Western blot結(jié)果一致。

Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

Tab 2 Effect of curcumin(CUR) on mRNA expression of Vimentin,α-SMA, BECN1, LC3 in BNL CL.2 cells stimulated by TGF-β1

Tab 3 Effect of CUR and BECN1 siRNA on mRNA expression of Vimentin,α-SMA, BECN1, LC3 in BNL CL.2 stimulated by TGF-β1

3.2 姜黃素可阻滯TGF-β1誘導(dǎo)及自噬基因干擾所致的BNL CL.2肝細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上看(Fig 2)，TGF-β1誘導(dǎo)和自噬相關(guān)基因(BECN1)干擾后，BNL CL.2肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)型細(xì)胞表型，給予姜黃素(20 μmol·L-1)干預(yù)，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生間質(zhì)化轉(zhuǎn)變。

3.3 姜黃素可減少TGF-β1誘導(dǎo)及自噬基因干擾所致的BNL CL.2肝細(xì)胞的自噬小體的形成如Fig 3所示，TGF-β1與BECN1 siRNA處理后，BNL CL.2肝細(xì)胞自噬水平降低，給予姜黃素(20 μmol·L-1)能明顯增加細(xì)胞內(nèi)自噬水平。

3.4 姜黃素通過促進(jìn)自噬抑制BNL CL.2肝細(xì)胞EMT進(jìn)程Tab 3的Real-time PCR結(jié)果表明，TGF-β1刺激后，BNL CL.2肝細(xì)胞間質(zhì)型標(biāo)志物Vimentin及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA基因表達(dá)增加；干擾自噬基因BECN1后，姜黃素抑制Vimentin與α-SMA基因表達(dá)的作用被部分阻斷。

4 討論

肝纖維化在我國(guó)常見、高發(fā)，肝細(xì)胞經(jīng)EMT向MFB的轉(zhuǎn)變是肝纖維化發(fā)病進(jìn)程的關(guān)鍵事件。姜黃素體內(nèi)外具有明顯抗肝纖維化作用，并能抑制肝細(xì)胞EMT進(jìn)程，減少ECM的生成。自噬參與多種肝臟疾病的發(fā)展進(jìn)程調(diào)控，可能與肝細(xì)胞EMT存在重要關(guān)聯(lián)，但機(jī)制仍不明確。目前，姜黃素確切的抗肝纖維化作用的內(nèi)在機(jī)制仍不十分清楚，特別是其調(diào)控肝細(xì)胞EMT進(jìn)程與抗肝纖維化的關(guān)系更是知之甚少，有待于進(jìn)一步解析與闡明，以此為靶標(biāo)的藥物作用與機(jī)制研究更為鮮見，是當(dāng)前肝纖維化病理機(jī)制與治療學(xué)研究的一個(gè)突出的前沿創(chuàng)新點(diǎn)?；谖覀円延械难芯糠e累和掌握的文獻(xiàn)資料，課題組提出并推測(cè)，自噬在肝纖維化發(fā)生時(shí)肝細(xì)胞EMT進(jìn)程調(diào)控中發(fā)揮重要作用；姜黃素可通過影響肝細(xì)胞內(nèi)自噬流的變化，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞EMT進(jìn)程，減少M(fèi)FB的生成及ECM的沉積。

Fig 1 Protein expression of Vimentin,α-SMA,Beclin-1,LC3 in BNL CL.2 cells influenced by TGF-β1 and intervened by curcumin(CUR) by Western blot detection

Fig 2 Morphologic change of BNL CL.2 cells in each group

Fig 3 Autophagy levels in each group

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1(2 μg·L-1)處理后，BNL CL.2肝細(xì)胞間質(zhì)型標(biāo)志物Vimentin及MFB標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)增加，細(xì)胞形態(tài)也向間質(zhì)型轉(zhuǎn)變，自噬水平下降。干擾自噬相關(guān)基因BECN1，肝細(xì)胞的間質(zhì)化表型轉(zhuǎn)變更加明顯。姜黃素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)后肝細(xì)胞Vimentin及α-SMA的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的EMT進(jìn)程，增加肝細(xì)胞自噬相關(guān)基因與蛋白Beclin-1、LC3的表達(dá)。干擾自噬基因BECN1后，姜黃素抑制Vimentin、α-SMA基因表達(dá)的作用被部分阻斷，表明姜黃素抑制肝細(xì)胞EMT的作用依賴于對(duì)自噬的調(diào)控環(huán)節(jié)。我們的研究初步揭示了自噬在肝細(xì)胞向MFB轉(zhuǎn)變中的作用，以及姜黃素通過提高肝細(xì)胞自噬水平，抑制肝細(xì)胞EMT進(jìn)程，進(jìn)而抑制肝纖維化發(fā)生與發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制。

本研究仍存在諸多不足，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步解決：① 項(xiàng)目的機(jī)制研究還有待進(jìn)一步深入。姜黃素通過何種機(jī)制調(diào)控肝細(xì)胞的自噬，姜黃素調(diào)控自噬后，自噬又是通過何種機(jī)制影響肝細(xì)胞EMT的。細(xì)胞自噬過程是胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)綜合調(diào)控的結(jié)果，ROS、mTOR、AMPK、p38-MAPK等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中[17-20]。前期本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過激活PPARγ，抑制HSC的氧化應(yīng)激及進(jìn)一步的活化。姜黃素是否能通過抑制ROS，調(diào)控肝細(xì)胞自噬，仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。但自噬對(duì)EMT進(jìn)程調(diào)控的報(bào)道仍較少，仍需進(jìn)一步闡明其中調(diào)控機(jī)制。② 姜黃素調(diào)控肝細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡、壞死、焦亡等進(jìn)程的區(qū)別與聯(lián)系等。當(dāng)細(xì)胞遭受外界損傷時(shí)，細(xì)胞走向不同的死亡方式可能是由于細(xì)胞不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，各通路間也存在著相互調(diào)控與關(guān)聯(lián)。