方閱 劉振威

(1.上海市第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080;2.上海市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥科，上海 200080)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由心源性以外的各種直接或間接因素所引起的以急性彌漫性肺泡炎性病變?yōu)樘卣鞯姆尾考毙匝装Y反應(yīng)，是臨床上常見的危重性疾病，可進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病率高，且尚無有效的治療措施，其死亡率高達(dá)40%以上。因此，尋找新的有效治療方法，是基礎(chǔ)研究和臨床研究中都急待解決的難題。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是一種與 ACE 相似的酶，是腎素—血管緊張素系統(tǒng)(rennin-a giotensin system，RAS)的重要組成部分[1]。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2在ALI/ARDS、SARS中發(fā)揮著保護(hù)作用[2-3]。在酸吸入、內(nèi)毒素以及膿毒血癥誘導(dǎo)的ARDS模型中，ACE2基因敲除小鼠與表達(dá)ACE2的對照組小鼠相比表現(xiàn)出更嚴(yán)重的ALI癥狀及病理表現(xiàn)[4]。通過應(yīng)用催化活性的重組ACE2蛋白可以改善野生型及ACE2基因敲除小鼠的ALI癥狀及病理表現(xiàn)，提示ACE2可作為ALI/ARDS可能的新治療藥物[5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植入動物體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)能夠在ALI模型動物中參與抑制炎癥反應(yīng)，觸發(fā)與修復(fù)相關(guān)的生長因子，不同程度地減輕肺的炎性反應(yīng)，給ALI/ARDS的治療帶來了新方向[6-9]。目前，MSCs主要來源于骨髓，但該途徑來源相對貧乏，獲取過程為有創(chuàng)操作，取材過程困難，大大制約了MSCs的臨床應(yīng)用。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)是MSCs的一種，其可從廢棄的胎盤中分離提取，來源廣泛，較骨髓來源的MSCs具有更低的免疫原性，更易體外擴(kuò)增，且無倫理學(xué)制約，逐漸成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中最具發(fā)展前景的種子細(xì)胞。本研究基于HUMSCs的特性和ACE2對肺損傷的保護(hù)作用，采用轉(zhuǎn)染法構(gòu)建攜帶ACE2基因的HUMSCs，旨在通過觀察其對博來雷素(BLM)誘導(dǎo)的ALI大鼠肺組織病理改變，檢測肺組織炎癥水平變化等指標(biāo)，評價(jià)攜帶ACE2基因的HUMSCs 移植對ALI的保護(hù)作用及機(jī)制，為未來臨床提高干細(xì)胞移植及攜帶基因聯(lián)合治療ALI奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量(250±20) g，由中國科學(xué)院動物中心提供。

1.1.2試劑 BLM (美國Sigma公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；PE anti-mouse CD45、CD 105， FITC anti-mouse CD29、 CD34、CD44(美國eBiocsience)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ACE2抗體(美國Cell Signal 公司)；MPO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，INF-γ 、IL-4引物(上海生工生物工程公司)；TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.1.3主要儀器 流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國BD Bioscences公司)；PCR儀、電泳儀和電源(美國Bio-rad公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HUMSCs的分離培養(yǎng) 無菌條件下取正常足月剖宮產(chǎn)健康嬰兒臍帶，剪成約1 mm2的組織塊，將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，加入含有雙抗及10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約80%融合時(shí)，用含胰蛋白酶的消化液消化，按104/cm2的密度傳代至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定 取對數(shù)生長期第4代的細(xì)胞，分別加入PE anti-mouse CD86、 CD45、CD 105， FITC anti-mouse CD29、CD34、CD44標(biāo)記HUMSCs。用流式細(xì)胞儀檢測HUMSCs表型。

1.2.3ACE2基因轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 利用Trizol試劑從人肺組織提取總RNA，然后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得人ACE2的cDNA片段。構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)移載體，然后與包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，擴(kuò)增病毒。其次還轉(zhuǎn)染一個(gè)GFP基因在臍帶間質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)作為追蹤臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的基因。收集病毒后轉(zhuǎn)染HUMSCs，在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP熒光陽性率來檢測轉(zhuǎn)染效率。公式：發(fā)出轉(zhuǎn)染率=綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/可見光下總細(xì)胞數(shù)×100%，并測定轉(zhuǎn)染了ACE2基因HUMSCs的表型。

1.2.4BLM誘導(dǎo)建立大鼠ALI模型 實(shí)驗(yàn)采用健康成年雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為5組，每組24只：(1)BLM組(BLM肺損傷的動物模型，靜脈注入生理鹽水)；(2)ACE2組(BLM肺損傷的動物模型，靜脈注入由慢病毒攜帶ACE2基因)；(3)HUMSCs組(BLM肺損傷的動物模型，靜脈單純注入HUMSCs而沒有ACE2基因)；(4)HUMSCs-ACE2組(BLM肺損傷的動物模型，靜脈輸注攜帶ACE2基因的干細(xì)胞)；(5)NS對照組(正常動物模型)。BLM組、ACE2組、HUMSCs組、HUMSCs-ACE2組采用一次性氣管內(nèi)滴注BLM(5 mg/kg)制造肺損傷的動物模型，NS對照組滴注生理鹽水。收集肺損傷前(D0)、肺損傷后第3天(D3)、第7天(D 7)和第14天(D 14)標(biāo)本行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.5生存分析 每組12只動物用于單獨(dú)記錄生存狀況，記錄每只動物的生存天數(shù)，觀察14 d的研究周期內(nèi)的生存狀況，計(jì)算生存率并繪制生存曲線。

1.2.6收集肺泡灌洗液測定中性粒細(xì)胞和總蛋白 利用10%水合氯醛麻醉大鼠，取預(yù)冷的生理鹽水灌洗支氣管肺泡，收集肺泡灌洗液(BALF)，離心后取上清液根據(jù)BCA試劑盒說明測定總蛋白含量，取沉淀部分經(jīng)1 mL PBS重懸，常規(guī)瑞氏染色后，在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.7肺組織形態(tài)學(xué)觀察及肺損傷嚴(yán)重度病理評分 制備肺組織石蠟切片，脫蠟，蘇木素染色，伊紅染色，光鏡下觀察病變區(qū)及附近肺組織病理變化。重點(diǎn)就肺充血及肺出血情況、肺泡內(nèi)滲出、肺泡及血管壁的中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡壁的增厚程度以及肺透明膜的形成等四種情況進(jìn)行評估及對肺損傷嚴(yán)重度打分。共分為五個(gè)等級：0=沒有損傷，1=輕微損傷，2=中度損傷，3=重度損傷，4=極重度損傷。最終將各個(gè)評分進(jìn)行匯總，總分即代表肺損傷程度。

1.2.8Western-blotting測定肺組織ACE2蛋白表達(dá) 取肺組織勻漿，離心，取上清，進(jìn)行蛋白定量和免疫印記。各實(shí)驗(yàn)組取等量蛋白20μg進(jìn)行電泳分析。采用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白條帶通過濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下封閉，然后與抗ACE2抗體孵育過夜，洗脫一抗，加二抗(1∶1 000)孵育，洗去二抗，經(jīng)過化學(xué)發(fā)光法顯色后顯影、定影。

1.2.10肺水含量程度測定 新鮮肺組織取下后稱濕重，然后置烤箱烤至恒重，稱干重，計(jì)算兩次肺組織重量之比，即肺組織的濕干比(W/D)，以反映肺水腫的程度。

1.2.11RT-PCR測定肺組織中促炎因子INF-γ和抗炎因子IL-4 mRNA 變化 取肺組織勻漿，加入TRIzol試劑冰上提取總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。IL-4基因引物序列如下：正向引物 5’-CTG ACG GCA CAG AGC TAT TGA-3’，反向引物 5’-TAT GCG AAG CAC CTT GGA AGC-3’；INF-γ基因引物序列如下：正向引物 5’-GCA TCT TGG CTT TGC AGC T-3’，反向引物 5’-CCT TTT TCG CCT TGC TGT TG-3’；β-actin基因引物序列如下：正向引物 5’-AGC TGC GTT TTA CAC CCT TT-3’，反向引物 5’-AAG CCA TGC CAA TGT TGT CT-3’。采用2-△△Ct方法來分析數(shù)據(jù)。其中，△Ct=Ct(目的基因)—Ct(內(nèi)參基因)，△△Ct=△Ct(樣品)—△Ct(對照)。

1.2.12ELISA測定肺組織中細(xì)胞因子TNF-α的含量 取肺組織用生理鹽水冰上勻漿，離心后取上清液，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作檢測TNF-α的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，使用SPSS13.0 One-way ANOVA 中的Bonferroni Test 進(jìn)行多個(gè)樣本間的兩兩比較，P<0.05示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HUMSCs的形態(tài) 無菌條件下從正常足月剖宮產(chǎn)健康嬰兒臍帶中分離的HUMSCs在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)1～2 d后，顯微鏡下部分梭形貼壁細(xì)胞，7 d后形成形態(tài)相對一致的、呈集落狀態(tài)生長的長梭形細(xì)胞，14 d后形成80%融合的單層貼壁細(xì)胞層。

2.2ACE2基因經(jīng)過慢病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs的轉(zhuǎn)染率 采用倒置顯微鏡觀察GFP熒光情況以檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，HUMSCs轉(zhuǎn)染病毒后24 h開始檢測到熒光，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間不斷增強(qiáng)，于第5天達(dá)到高峰。實(shí)驗(yàn)中按染指數(shù)MOI=5、10、20、40、80分別接種相應(yīng)體積的的病毒液于細(xì)胞，當(dāng)MOI=10時(shí)，GFP熒光檢測陽性細(xì)胞百分比>95%，且細(xì)胞感染后可以看出細(xì)胞未出現(xiàn)病變，細(xì)胞活力及生長狀態(tài)良好。MOI≥10時(shí)，細(xì)胞死亡率明顯增加，到MOI=80時(shí)，細(xì)胞大量死亡，故確定轉(zhuǎn)染的最佳MOI值=10。

2.3轉(zhuǎn)染前后HUMSCs表型檢測結(jié)果 用流式細(xì)胞儀對轉(zhuǎn)染前后HUMSCs 進(jìn)行表面標(biāo)志檢測。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前CD29、CD44、CD105均呈陽性表達(dá)，而 CD34、CD45 、CD86呈陰性表達(dá)，提示所獲得的細(xì)胞符合HUMSCs特性。HUMSCs經(jīng)轉(zhuǎn)染ACE2基因后其表型并未發(fā)生顯著變化，提示轉(zhuǎn)染本身以及ACE2并未影響HUMSCs相關(guān)表型的變化。

2.4生存分析 通過繪制Kaplan-Meier生存分析曲線圖，表明模型動物在實(shí)驗(yàn)后3～7 d區(qū)間內(nèi)容易死亡，而此區(qū)間外死亡率較低。采用Log Rank(Mantel-cox)比較各干預(yù)組與BLM組的生存率差異，結(jié)果顯示HUMSCs-ACE2組差異顯著。見圖1、表1。

圖1 生存分析曲線

組別BLM組ACE2組HUMSCs組HUMSCs-ACE2組NS對照組BLM組-0.1670.0870.037?0.000??

注：與BLM組對比，*P<0.05；與BLM組對比，**P<0.01。

2.5BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)目變化 中性粒細(xì)胞是反映肺血管通透性的指標(biāo)之一，在正常情況下BALF中數(shù)量很少。經(jīng)BLM刺激后的各實(shí)驗(yàn)組BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，與NS對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時(shí)期的BLM組相比，中性粒細(xì)胞數(shù)量在第3、7、14天較同期的BLM組呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降趨勢，其中以HUMSCs-ACE2組降低量明顯(P<0.05)。見圖2。

注：與同時(shí)期NS對照組對比，#P<0.05；與D3 HUMSCs-ACE2組對比，*P<0.05；與D3 HUMSCs-ACE2組對比，**P<0.01。

圖2BALF中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.6BALF中總蛋白含量變化 BALF中總蛋白量是反映肺血管滲透性的重要指標(biāo)，血管滲透性增加，血漿中蛋白滲出量增加，提示炎癥損傷發(fā)生。通過BCA試劑盒檢測BALF中總蛋白量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)BLM刺激后，各實(shí)驗(yàn)組中BALF的總蛋白量升高，其中以第3天的BALF的總蛋白量表達(dá)最高；HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時(shí)期的BLM組相比，BALF的總蛋白量降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同期的BLM對照組呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降趨勢(P<0.05)。見圖3。

注：與同時(shí)期BLM組對比，#P<0.05；與D3 HUMSCs-ACE2組對比，*P<0.05；與D3 HUMSCs-ACE2組對比，**P<0.01。

圖3BALF中總蛋白含量變化

2.7肺組織形態(tài)學(xué)觀察及肺損傷嚴(yán)重度病理評分 經(jīng)HE染色結(jié)果可知，肺組織損傷在第3天到第7天最為嚴(yán)重，肺部出現(xiàn)水腫，并有較多炎性細(xì)胞浸潤，肺纖維化嚴(yán)重，與動物死亡數(shù)的時(shí)間分布相符，隨后損傷有減輕趨勢，肺泡炎癥好轉(zhuǎn)，少量淋巴細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞少量增生。其中，第7天的HE染色結(jié)果如下：NS對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整光滑，無炎性細(xì)胞浸潤(圖4 A)；BLM組肺組織水腫，少量出血，光鏡下觀察可見大量中性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡壁破壞(圖4 B)；HUMSCs-ACE2組炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肺損傷程度較模型組顯著減輕(圖4 E)。肺損傷嚴(yán)重度病理評分結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組肺組織損傷情況，以第3天最嚴(yán)重。經(jīng)過ACE2、HUMSCs、HUMSCs-ACE2干預(yù)后，肺組織損傷情況得到不同程度改善，尤其以HUMSCs-ACE2組表現(xiàn)為佳。ACE2組、HUMSCs組、HUMSCs-ACE2組與BLM實(shí)驗(yàn)組比較，僅HUMSCs-ACE2組的病理評分在3、7、14 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

注：A：NS對照組；B：BLM組； C：ACE2組； D：HUMSCs組； E：HUMSCs-ACE2組。

圖4D7肺組織病理HE染色(×200)

表2 病程中肺組織損傷嚴(yán)重度總體評分分]

注：與同時(shí)期BLM實(shí)驗(yàn)組對比，*P<0.05。

2.8Western-blotting測定肺組織ACE2蛋白表達(dá) 提取肺組織總蛋白后通過Western-blotting檢測ACE2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示NS對照組的ACE2蛋白在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NS對照組比較，BLM組ACE2蛋白表達(dá)下降最顯著；ACE2組、HUMSCs組及HUMSCs-ACE2組的ACE2蛋白呈下降趨勢，但在第3天開始回升，HUMSCs-ACE2組的總蛋白中ACE2表達(dá)增量最明顯，在第14天達(dá)到高峰，與同時(shí)期的BLM組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

2.9肺組織MPO活力測定 肺組織MPO活力是反映肺組織中中性粒細(xì)胞浸潤程度的指標(biāo)之一，可以間接反映肺組織炎癥反應(yīng)程度和肺損傷程度。如圖6所示，經(jīng)BLM刺激后，各實(shí)驗(yàn)組中MPO活力顯著升高，在第3天達(dá)到高峰，隨后在第7天、第14天開始回落。與NS對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時(shí)期的BLM組相比，MPO活性降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同時(shí)期的BLM組呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，在第3天， HUMSCs-ACE2組的MPO活性低于HUMSCs組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在第7、14天，HUMSCs-ACE2組的MPO活性較ACE2組、HUMSCs組均明顯降低。

2.10肺水含量程度測定 肺干濕比在BLM造模后較NS對照組顯著上升，HUMSCs-ACE2組在第3天到達(dá)高峰后開始下降，ACE2組、HUMSCs組則在第7天達(dá)到高峰。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時(shí)期的BLM組相比，肺干濕比均有所降低，以HUMSCs-ACE2組降低最明顯。見圖7。

2.11RT-PCR測定肺組織中促炎因子INF-γ和抗炎因子IL-4的mRNA 變化 圖8為肺組織中INF-γ的mRNA表達(dá)情況。BLM組和HUMSCs組INF-γmRNA表達(dá)量一直維持在較高水平，在第7天達(dá)到高峰，隨后隨時(shí)間推移開始下降，ACE2組及HUMSCs-ACE2組INF-γmRNA表達(dá)量在第3天達(dá)到高峰，隨后在第7、14天開始下降。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時(shí)期的BLM組相比INF-γmRNA水平降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同時(shí)期的BLM組呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降趨勢(P<0.05)。圖9為肺組織中IL-4的mRNA表達(dá)情況。各實(shí)驗(yàn)組中IL-4的mRNA表達(dá)顯著下降，在第3天達(dá)到最低量，隨后在第7天、第14天開始上升。與NS對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時(shí)期的BLM組相比，IL-4的mRNA表達(dá)升高，以HUMSCs-ACE2組升高量最明顯，第3、7、14天較同時(shí)期的BLM組呈現(xiàn)時(shí)間依賴性上升趨勢(P<0.05)。

2.12ELISA測定肺組織中細(xì)胞因子TNF-α的含量 結(jié)果如圖10所示，BLM組中TNF-α含量一直維持在較高水平，在第3天達(dá)到高峰，在第7、14天隨著時(shí)間推移開始下降。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時(shí)期的BLM組相比，TNF-α的表達(dá)降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同時(shí)期的BLM組呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降趨勢(P<0.05)。其中，在第3天， HUMSCs-ACE2組TNF-α的表達(dá)高于HUMSCs組，但在第7、14天，HUMSCs-ACE2組TNF-α的表達(dá)較ACE2組、HUMSCs組均明顯降低，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。

3 討 論

ALI是臨床常見的危急重癥，炎癥爆發(fā)反應(yīng)是其重要的病理特征之一。本研究采用一次性氣管內(nèi)滴注BLM制造肺損傷動物模型，模擬ALI的病理生理過程，通過肺組織病理學(xué)及相關(guān)炎癥指標(biāo)的檢測顯示，肺組織中出現(xiàn)炎性滲出、水腫，肺血管膜受損和通透性增加，符合ALI的模型要求。鑒于ALI/ARDS目前尚無有效治療措施，死亡率很高，而臟器移植又存在許多局限，因而干細(xì)胞移植，通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為受損肺細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)肺臟的修復(fù)和再生，將是一個(gè)嶄新的治療策略。

干細(xì)胞是當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，可作為體內(nèi)基因治療的載體，被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療[10-12]。 近來已將MSCs引入到肺損傷的治療中，在適當(dāng)?shù)臈l件下MSCs可定向分化為包括肺組織細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等組織細(xì)胞[13]。當(dāng)前，MSCs的主要來源仍然是骨髓，但存在來源有限、取樣時(shí)要進(jìn)行侵襲性操作等缺點(diǎn)，因而尋找一種新的更具優(yōu)勢的替代細(xì)胞成為當(dāng)務(wù)之急。HUMSCs可從廢棄的胎盤中分離提取，來源豐富且不涉及倫理學(xué)爭議[14]。ACE2基因?qū)ngⅡ有極高的催化效率，具有擴(kuò)張血管、參與炎癥反應(yīng)調(diào)控的作用[15-17]。研究表明，ACE2基因缺失能加劇BLM誘導(dǎo)的肺損傷，而重組ACE2對于小鼠ALI有保護(hù)作用[18]。目前尚無攜帶ACE2基因的HUMSCs對ALI的作用研究，故本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究其在肺損傷中的作用機(jī)制以及為肺損傷的臨床治療提供理論依據(jù)。

基于HUMSCs和ACE2分別對肺損傷的保護(hù)作用的研究，本實(shí)驗(yàn)通過BLM構(gòu)建大鼠ALI模型，旨在修復(fù)受損肺細(xì)胞、改善肺組織病理學(xué)、減輕肺損傷指標(biāo)及促炎性細(xì)胞因子等方面觀察以HUMSCs為媒介的ACE2基因轉(zhuǎn)染對大鼠ALI的治療作用。本研究采用具有轉(zhuǎn)化修復(fù)與融合修復(fù)肺損傷功能的HUMSCs作為運(yùn)輸工具，通過Lentivirus病毒載體轉(zhuǎn)染ACE2基因，并形成穩(wěn)定表達(dá)，輸入大鼠體內(nèi)進(jìn)行基因治療，同時(shí)設(shè)置GFP作為示蹤蛋白，追蹤HUMSCs在體內(nèi)的變化，結(jié)果顯示HUMSCs攜帶ACE2/eGFP基因，經(jīng)靜脈輸入體內(nèi)后，在肺組織受損處多處出現(xiàn)表達(dá)GFP的肺泡上皮細(xì)胞，提示攜帶ACE2基因的HUMSCs在肺部有轉(zhuǎn)化修復(fù)的能力。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)BLM誘導(dǎo)ALI后，模型組大鼠的ACE2顯著下降到較低水平，單獨(dú)給予ACE2基因的模型組和單獨(dú)給予HUMSCs的模型組大鼠在第3天開始回升，而給予攜帶ACE2基因的HUMSCs大鼠肺組織中的ACE2表達(dá)在第3天也逐漸增加，且增加程度較前兩組高，在第14天達(dá)到高峰，說明攜帶ACE2基因的HUMSCs，較單獨(dú)ACE2或HUMSCs具有更好的修復(fù)效果。

本研究就肺水腫、肺組織病理學(xué)改變、肺組織中MPO活性的高低以及肺組織中促炎性細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α和抗炎因子IL-4水平的變化，對干預(yù)前后實(shí)驗(yàn)動物的肺損傷嚴(yán)重程度進(jìn)行了探討。通過病理學(xué)研究和肺組織損傷嚴(yán)重度總體評分發(fā)現(xiàn)，肺組織損傷在第3天和第7天最為嚴(yán)重，與動物死亡數(shù)時(shí)間分布相符，隨后損傷有減輕趨勢。經(jīng)ACE2、HUMSCs和攜帶ACE2基因的HUMSCs這三種不同方法干預(yù)后，肺組織病理學(xué)和肺組織損傷得到不同程度的改善，尤其以HUMSCs-ACE2組表現(xiàn)為佳，提示攜帶ACE2的HUMSCs在改善實(shí)驗(yàn)大鼠整個(gè)病程的肺損傷上存在優(yōu)勢。

中性粒細(xì)胞在肺損傷發(fā)病機(jī)制中是反映肺水腫程度的關(guān)鍵因子，MPO是中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒所釋放的過氧化物酶，其水平與中性粒細(xì)胞數(shù)目表達(dá)量呈正比，兩者過量生成均可造成組織損傷。通過對肺組織MPO活性和BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)目的檢測，結(jié)果顯示第3天各組的MPO活性和BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰，其中HUMSCs-ACE2組動物的MPO活性和BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)目與HUMSCs和ACE2組比較，在第3天后開始迅速下降，表現(xiàn)出改善跡象，提示攜帶ACE2基因的HUMSCs對于治療肺損傷較HUMSCs或ACE2單獨(dú)治療有優(yōu)勢。

細(xì)胞因子的改變是肺損傷病程中的一個(gè)重要體現(xiàn)。細(xì)胞因子按炎癥反應(yīng)可分為促炎因子和抗炎因子，其中促炎因子INF-γ、TNF-α、IL-1、TL-6等，抗炎因子主要有IL-4、TL-10等。本研究選取促炎因子INF-γ、TNF-α及抗炎因子主要有IL-4作為研究對象，通過ELISA和RT-PCR檢測其表達(dá)水平。結(jié)果表明，經(jīng)BLM刺激后，各組促炎因子INF-γ、TNF-α表達(dá)量增加，在第3天達(dá)到高峰，抗炎因子IL-4的表達(dá)量下降，在第3天達(dá)到最低值，隨后的第7、14天促炎因子INF-γ、TNF-α表達(dá)量隨時(shí)間降低，抗炎因子IL-4的mRNA水平隨時(shí)間呈上升趨勢，均以HUMSCs-ACE2組表達(dá)量改變最明顯，提示HUMSCs協(xié)同ACE2基因治療對于抑制促炎因子INF-γ、TNF-α表達(dá)、提高抗炎因子IL-4的表達(dá)較單純ACE2、HUMSCs治療效果更佳。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，攜帶ACE2基因的HUMSCs能有效降低ALI大鼠肺部炎癥滲出和血管通透性程度，降低肺組織中促炎因子基因水平，并能提高抗炎因子IL-4以及ACE2的表達(dá)，從而減輕ALI大鼠病理損傷程度，提示HUMSCs介導(dǎo)的ACE2治療具有修復(fù)肺損傷的功能，且治療效果優(yōu)于單純HUMSCs或ACE2的治療效果。

目前HUMSCs移植治療ALI/ARDS的研究多停留在動物模型階段，應(yīng)用到臨床治療仍面臨許多挑戰(zhàn)，但隨著HUMSCs對肺組織修復(fù)機(jī)制的深入研究和進(jìn)一步闡明，我們相信結(jié)合ACE2基因治療的HUMSCs移植將在ALI/ARDS 的臨床應(yīng)用中呈現(xiàn)光明的前景。

(圖5～10見封三)