張曉瑩，傅巧娟，趙?？?，李春楠，阮若昕

(杭州市農業(yè)科學研究院 園藝研究所，浙江 杭州 310024)

隨著我國經濟的發(fā)展和國民收入的增加，人們對蘭科植物的興趣和需求日益提高。我國作為很多重要蘭科植物的世界分布中心，擁有豐富的野生蘭科植物資源[1-2]，如何充分利用這些蘭科植物資源，解決市場需求與蘭科植物新優(yōu)品種缺乏之間的矛盾成為發(fā)展我國現代蘭花產業(yè)的重中之重。中國蘭花要走向世界，必須立足育種資源，選擇優(yōu)良親本，培育出具有自主知識產權的品種，才能在競爭中立于不敗之地。

利用大花蕙蘭花序較大、花葶長、小花數多且花色艷麗、花期長等優(yōu)良特性進行雜交蘭新優(yōu)品種的培育具有廣闊的研究前景[3]?；ǚ勖劝l(fā)能力是直接影響蘭科植物雜交成功與否的重要因素之一，具有足夠數量的有活力的花粉是雜交育種的必要條件。蘭科植物花粉活力的研究主要集中在花粉采集時間、花粉活力測定方法篩選等方面[3-5]。本研究在前人的研究基礎上，以大花蕙蘭為材料，篩選適宜的花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基配方；對不同貯藏溫度、不同保存時間的大花蕙蘭花粉進行離體萌發(fā)檢測，探尋適宜的花粉保存方法，旨在解決大花蕙蘭與其他蘭花花期不遇的問題，為蘭花雜交育種工作提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試的植物材料為大花蕙蘭品種JOIC和KK560，保存于杭州市農業(yè)科學研究院連棟溫室，常規(guī)栽培養(yǎng)護管理。試驗于2017年12月到2018年8月進行，在大花蕙蘭開花期選擇生長健壯且無病蟲害的4年生苗為供試植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉收集與保存

大花蕙蘭開花當日上午9:00采取花粉，冰盒帶回實驗室，用鑷子去除藥帽和粘盤裝入硫酸紙袋中，置于硅膠干燥器內常溫干燥24 h(圖1)。將干燥后的花粉分別置于室溫(25 ℃)、4 ℃和-20 ℃(培養(yǎng)前24 h置于4 ℃解凍)保存。花粉以2種形式保存，一種為花粉塊形式，另一種為人工碾壓成粉末狀，即花粉粒形式。

1.2.2 培養(yǎng)基篩選與花粉離體培養(yǎng)

大花蕙蘭的花粉離體萌發(fā)所需時間較長，本研究采用液體培養(yǎng)基進行離體培養(yǎng)。利用鮮花粉進行花粉離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基篩選，培養(yǎng)基配方見表1。取各種培養(yǎng)基1 mL于2 mL的EP管中，分別加入4個花粉塊或研磨的花粉粒，在人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度為28 ℃，光強為4 800 lx，每隔12 h振蕩1次，使花粉粒分散。篩選出的最適培養(yǎng)基用于檢測不同保存溫度(25、4、-20 ℃)、不同保存時間(7、30、60、120、180、240 d)的花粉萌發(fā)率。

1.3 拍照記錄與統計分析

用移液器將培養(yǎng)大花蕙蘭花粉粒的培養(yǎng)基滴在載玻片上(50 μL)，蓋玻片封片，OLYMPUS光學顯微鏡定期觀察花粉萌發(fā)情況。培養(yǎng)8 d后統計花粉萌發(fā)數，花粉管生長正常且長度大于(等于)花粉粒直徑視為有生命力的花粉，每個處理觀察5個視野，計數并拍照記錄。計算花粉萌發(fā)率，萌發(fā)率(%)=已萌發(fā)的花粉粒數÷花粉粒總數×100。采用Excel軟件整理原始數據，SPSS軟件進行數據分析。

A，大花蕙蘭品種JOIC；B，大花蕙蘭品種KK560。A， Cymbidium hybridum JOIC; B， Cymbidium hybridum KK560.圖1 大花蕙蘭品種JOIC和KK560的花與花粉Fig.1 Flowers and pollens of Cymbidium hybridum JOIC and KK560

表1 大花蕙蘭花粉離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方

Table1Medium formulation forinvitrocultureCymbidiumhybridumpollen

編號No.蔗糖Sucrose/%硼酸Boricacid/%氯化鈣Calciumchloride/%MS (含30%蔗糖)MS (Containing30% sucrose)0.5MS (含30%蔗糖)0.5 MS (Containing30% sucrose)萘乙酸NAA/(mg·L-1)1300.010.10002300.030.10003300.050.10004300.010.20005300.030.20006300.050.20007300.010.30008300.030.30009300.050.300010300.01000011300.03000012300.050000133000+001430000+015000+00.516000+01.0170000+0.5180000+1.0

+表示添加MS或 0.5 MS。

+represent adding MS or 0.5 MS.

2 結果與分析

2.1 花粉離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基篩選

利用大花蕙蘭的新鮮花粉進行培養(yǎng)基的篩選，在供試的18種培養(yǎng)基中，不同大花蕙蘭品種的花粉萌發(fā)率存在明顯差異。同時發(fā)現，花粉塊在培養(yǎng)液中自然散開，四合花粉粒均保持完整的膜結構，能夠萌發(fā)；而經過人工研磨的花粉塊，經過物理碾壓，花粉粒的膜結構遭到破壞，未見膜結構不完整的花粉萌發(fā)(圖2)。表明大花蕙蘭花粉適宜的貯藏形態(tài)為花粉塊狀保存。

A，粒狀保存；B，塊狀保存。A， Preservation with granular morphology; B， Preservation with block morphology.圖2 不同保存形式的花粉在培養(yǎng)液中的形態(tài)(400×)Fig.2 Morphology of different preserved forms of pollen in culture medium (400×)

大花蕙蘭品種JOIC在以0.5 MS為基礎添加物的培養(yǎng)液中離體萌發(fā)率最高(表2)，培養(yǎng)4 d花粉開始萌發(fā)，花粉管萌發(fā)過程中能夠正常伸長，花粉管平滑且伸展(圖3A-F)；但在添加不同濃度NAA的培養(yǎng)液中，花粉的萌發(fā)率差異不顯著(P>0.05)，說明NAA對大花蕙蘭花粉離體萌發(fā)沒有明顯的促進作用。以MS為基礎添加物的培養(yǎng)液中，4 d時也能觀察到花粉萌發(fā)，但是萌發(fā)率明顯低于0.5 MS培養(yǎng)基，并且大量萌發(fā)的花粉出現異常，包括花粉管停止伸長、膨大與卷曲等(圖3G-I)；以硼酸和氯化鈣為基礎添加物的培養(yǎng)基中，花粉可以離體萌發(fā)，但萌發(fā)率相對較低。大花蕙蘭品種KK560的萌發(fā)率在以硼酸和氯化鈣為基礎添加物的培養(yǎng)液中最高(表2)，在以MS和0.5 MS為基礎添加物的培養(yǎng)液中相對較低，且出現花粉管膨大、停止伸長的現象。

因此，綜合考慮大花蕙蘭品種JOIC和KK560的花粉離體萌發(fā)情況，確定大花蕙蘭品種JOIC花粉離體萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為14號培養(yǎng)基，配方為0.5 MS+30%蔗糖；大花蕙蘭品種KK560花粉離體萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為4號培養(yǎng)基，配方為0.01%硼酸+0.2%氯化鈣+30%蔗糖。

表2 大花蕙蘭品種JOIC和KK560花粉在不同培養(yǎng)基中的萌發(fā)率

Table2Germination rate ofCymbidiumhybridumJOIC and KK560 pollen in different culture medium

編號No.JOIC萌發(fā)率Germination rateof JOIC/%KK560萌發(fā)率Germination rateof KK560/%140.86±2.33 def44.85±2.32 ab247.47±2.21 bc45.05±5.24 ab347.15±1.51 c44.37±4.68 b444.34±2.31 cdef53.11±2.10 a544.45±4.52 cdef50.58±5.73 ab646.14±0.95 cde50.96±4.21 ab746.33±3.61 cd49.20±2.18 ab847.23±2.75 c51.29±2.91 ab940.73±1.36 def49.50±2.02 ab1038.26±3.17 f45.82±2.78 ab1139.98±0.81 ef45.23±4.92 ab1238.80±0.94 f47.00±6.10 ab1342.73±3.75 cdef42.72±1.91 b1453.98±2.54 a44.72±3.15 ab1539.92±2.17 ef43.12±3.59 b1642.03±4.70 cdef44.75±1.99 ab1753.65±3.13 ab47.45±4.45 ab1854.22±2.18 a49.74±3.04 ab

數據統計分析使用單向方差分析，數據后面無相同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。

One-way ANOVA was used for the statistical analysis of data. Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05.

2.2 不同貯藏溫度、時間對大花蕙蘭花粉離體萌發(fā)的影響

將不同貯藏溫度、時間保存的花粉接種到最適培養(yǎng)基(JOIC接種到14號培養(yǎng)基，KK560接種到4號培養(yǎng)基)?；ǚ勖劝l(fā)情況統計結果顯示，保存溫度相同時，隨保存時間延長，花粉離體萌發(fā)率均逐漸降低(圖4)。室溫(25 ℃)保存7 d，萌發(fā)率迅速降低，保存30 d，花粉萌發(fā)率在10%左右；4 ℃保存隨著保存時間延長，花粉離體萌發(fā)率持續(xù)降低，保存至180 d，花粉基本不能離體萌發(fā)；-20 ℃保存至60 d，花粉離體萌發(fā)率沒有明顯降低，此后逐漸降低，保存180 d，部分花粉可以萌發(fā)，但萌發(fā)率為10%～20%(圖4)，并出現中空現象(圖5)，保存至240 d，花粉基本不能離體萌發(fā)。

保存時間相同時，隨保存溫度的升高，花粉離體萌發(fā)率逐漸降低(圖4)。保存7 d，室溫(25 ℃)保存的花粉萌發(fā)率明顯降低，4 ℃和-20 ℃保存的花粉萌發(fā)率變化不明顯；保存至30 d，室溫(25 ℃)保存的花粉基本不能萌發(fā)，4 ℃保存的花粉萌發(fā)率開始降低，降低幅度較小，-20 ℃保存的花粉萌發(fā)率變化不明顯；保存至60 d，不同保存溫度花粉的萌發(fā)率均呈降低趨勢，4 ℃保存的花粉降低幅度較大，花粉基本不能萌發(fā)；保存至180 d，不同保存溫度下盡管仍有部分花粉能夠萌發(fā)，但萌發(fā)率均在10%左右；保存至240 d，不同保存溫度下，花粉基本不能萌發(fā)(圖4)。

3 結論與討論

大花蕙蘭花粉粒外面包裹的膜結構，將花粉粒黏連成花粉塊，這減緩了花粉的脫水、復水與萌發(fā)速度[6]。液體培養(yǎng)液更有利于蘭科植物花粉的離體萌發(fā)，王利民等[7]研究表明，大花蕙蘭花粉在人工培養(yǎng)基上萌發(fā)時間較長，離體培養(yǎng)4 d開始萌發(fā)，本研究結果與此相似；海南原產墨蘭花粉離體培養(yǎng)需24 h，臺灣金線蓮離體培養(yǎng)2 d開始萌發(fā)。不同種間的蘭科植物花粉離體萌發(fā)時間存在差異，一方面可能由于自身活力等遺傳特性差異，另一方面可能與采集時間和花粉含水量相關[4，7-9]。周桂英等[10]認為，光照可以影響大花惠蘭的開花質量，間接影響大花蕙蘭花粉的生活力。本研究還對花粉保存形態(tài)進行研究，以花粉粒和花粉塊2種形式保存的花粉進行離體萌發(fā)培養(yǎng)，盡管花粉粒能夠更好地干燥和復水，可能因為物理碾壓破壞了四合花粉粒的膜結構，導致花粉粒不能萌發(fā)。

A，離體培養(yǎng)4 d (400×)；B，離體培養(yǎng)6 d (400×)； C，離體培養(yǎng)8 d (400×)；D，離體培養(yǎng)10 d (400×)； E，離體培養(yǎng)12 d (400×)；F，離體培養(yǎng)14 d (100×)；G，花粉管直接膨大(400×)；H，花粉管伸長后膨大(400×)；I，花粉管扭曲 (400×)。A， In vitro culture for 4 d (400×); B， In vitro culture for 6 d (400×); C， In vitro culture for 8 d (400×); D， In vitro culture for 10 d (400×); E， In vitro culture for 12 d (400×); F， In vitro culture for 14 d (100×); G， The pollen tube bulges directly (400×); H， The pollen tube bulged after elongation (400×); I， Pollen tube twisted (400×).圖3 大花蕙蘭品種JOIC花粉的離體萌發(fā)過程Fig.3 Germination of Cymbidium hybridum JOIC pollen

圖4 大花蕙蘭品種JOIC(A)和KK560(B)花粉的離體萌發(fā)率Fig.4 In vitro germination rate of Cymbidium hybridum JOIC (A) and KK560 (B) pollen

圖5 大花蕙蘭品種KK560花粉粒中空現象(400×)Fig.5 Empty pollens of Cymbidium hybridum KK560(400×)

蘭科植物花粉離體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件研究表明，蔗糖、硼酸、鈣離子濃度是影響蘭花花粉離體萌發(fā)的重要因素。蔗糖不僅提供能量，同時起到調整滲透壓的作用，濃度過低易發(fā)生吸漲現象，濃度過高則易造成原生質體脫水，均會抑制花粉萌發(fā)[7-8，11]；硼能促進糖的吸收與代謝，并促進花粉管的伸長生長；Ca2+主要影響花粉萌發(fā)速度和花粉管的生長速度，鄭寶強等[12]研究結果表明，雜種卡特蘭花粉萌發(fā)培養(yǎng)過程中H3BO3和CaCl2的濃度過高和過低，都不利于花粉管的萌發(fā)和生長。本研究中大花蕙蘭品種JOIC和KK560的最適離體萌發(fā)培養(yǎng)基也存在較大差異，在不適宜的培養(yǎng)基中萌發(fā)率普遍不高且花粉管萌發(fā)后很難伸長，與前人的研究結果相似[7]。

不同保存溫度和保存時間對花粉活力影響較大，降低保存溫度能夠延長保存時間。鄧茜玫[13]研究表明，石斛蘭花粉在4 ℃保存80 d，花粉萌發(fā)率下降至0；-20 ℃保存3個月內花粉萌發(fā)率均保持在20%以上，可供正常授粉使用。本研究結果表明，大花蕙蘭花粉在4 ℃保存30 d后生活力迅速下降，-20 ℃保存能夠顯著提高保存時間，與卡特蘭的相關研究結果相符[12]。本研究發(fā)現，隨貯藏時間的延長，花粉粒出現中空現象，可能由于花粉內耗導致。因此，建議保存前花粉塊硅膠陰干24 h，-20 ℃保存，期限為6個月。