蘇曉倩，王 斐，胡鳳榮

(南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

風(fēng)信子(Hyacinthusorientalis)是重要的秋植球根花卉，花色鮮亮，花序優(yōu)美，栽培方式多樣，既可作花壇花鏡，又可水養(yǎng)或作切花觀賞，園林應(yīng)用極為廣泛[1]。20世紀(jì)50年代我國(guó)各地開(kāi)始種植風(fēng)信子[2]，國(guó)內(nèi)外對(duì)風(fēng)信子的生物學(xué)特性[3]、次生代謝[4]、栽培育種[5]等方面進(jìn)行了大量研究。但目前我國(guó)尚無(wú)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的風(fēng)信子品種，每年需要進(jìn)口大量種球滿足市場(chǎng)需求[6]。因此，開(kāi)展遺傳多樣性研究和新品種選育工作是目前國(guó)內(nèi)發(fā)展風(fēng)信子的重要途徑。

植物的染色體數(shù)目和形態(tài)是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一，進(jìn)行染色體核型分析是研究植物分類、物種進(jìn)化與種間親緣關(guān)系的重要手段[7-8]。國(guó)內(nèi)已報(bào)道了百合(Liliumbrownii)[9]、萱草(Hemerocallisfulva)[10]等多個(gè)百合科植物的核型分析。風(fēng)信子起源簡(jiǎn)單，品種繁多，品種間遺傳差異較小，尚未形成統(tǒng)一、科學(xué)的分類方法，開(kāi)展核型分析工作是進(jìn)行品種分類最直觀和簡(jiǎn)便的研究方法[6]。本文對(duì)3個(gè)風(fēng)信子品種的染色體核型進(jìn)行比較，分析其進(jìn)化程度和不同品種間的血緣關(guān)系，以期為風(fēng)信子品種選育工作提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以吉普賽女王(Gipsy Queen)、紫色情感(Purple Sensation)、奧德修斯(Odysseus)3個(gè)風(fēng)信子品種為材料進(jìn)行染色體核型分析(圖1)，研究所用種球購(gòu)自荷蘭。

1.2 方法

1.2.1 染色體制片

實(shí)驗(yàn)材料選取水培風(fēng)信子根尖，當(dāng)水培根系長(zhǎng)達(dá)1 cm時(shí)，在9:00—11:00剪取水培根尖放入10 mL盛有預(yù)處理液的離心管中，進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理液由0.2%秋水仙素與0.002 mol·L-18-羥基喹啉混合液按體積比1∶1配制而成，處理20 h后轉(zhuǎn)至卡諾氏固定液Ⅰ(無(wú)水乙醇：冰醋酸體積比3∶1)固定24 h，4 ℃貯存?zhèn)溆?。隨機(jī)選取各風(fēng)信子品種10條根尖，45%醋酸解離2 h，堿性品紅染色壓片，鏡檢，Olympus 60×物鏡(干鏡)、DP72系統(tǒng)拍照。

1.2.2 核型分析

選取5張高質(zhì)量染色體核型照片進(jìn)行核型分析，采用Photoshop CS軟件進(jìn)行染色體的剪取和同源染色體配對(duì)；采用Auto CAD2007軟件以曲線代替染色體進(jìn)行染色體長(zhǎng)短臂的測(cè)量；采用excel軟件計(jì)算染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比，采用SPSS軟件計(jì)算5個(gè)細(xì)胞的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差。

按Levan等[11]分類系統(tǒng)分析染色體類型，具體如下：臂比值1.00的為正中部著絲點(diǎn)，簡(jiǎn)寫為M；臂比值1.01～1.70的為中部著絲區(qū)，簡(jiǎn)寫為m；臂比值1.71～3.00的為近中部著絲區(qū)，簡(jiǎn)寫為sm；臂比值3.01～7.00的為近端部著絲區(qū)，簡(jiǎn)寫為st；臂比值7.01以上的為端部著絲區(qū)，簡(jiǎn)寫為t；臂比值∞的為正端部著絲區(qū)，簡(jiǎn)寫為T。

參照Stebbins[12]和李懋學(xué)等[13]的方法進(jìn)行核型分析和相關(guān)參數(shù)計(jì)算：相對(duì)染色體長(zhǎng)度≥1.25為長(zhǎng)染色體，簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)；相對(duì)染色體長(zhǎng)度1.01≤～1.25為中長(zhǎng)染色體，簡(jiǎn)寫為M2；相對(duì)染色體長(zhǎng)度0.76≤～1.01為中短染色體，簡(jiǎn)寫為M1；相對(duì)染色體長(zhǎng)度0.67≤～0.76為短染色體，簡(jiǎn)寫為S。按Hisao[14]的方法計(jì)算核型不對(duì)稱系數(shù)。

A，吉普賽女王；B，紫色情感；C，奧德修斯A， Gipsy Queen; B， Purple Sensation; C， Odysseus.圖1 三個(gè)風(fēng)信子品種Fig.1 Three diploid hyacinth cultivars

2 結(jié)果與分析

由圖2和表1可得出，風(fēng)信子Gipsy Queen的核型公式為2n=2x=16=6m+8sm+2sm(sat)，染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為2.95%～10.14%，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=6L+2M2+4M1+4S，著絲點(diǎn)指數(shù)變化范圍在26.53%～49.54%，臂比變化范圍為1.02～2.84，平均臂比為1.83，最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度之比為3.44，臂比大于2的染色體占總?cè)旧w數(shù)的37.5%，核型不對(duì)稱系數(shù)為59.24%，為2B核型。風(fēng)信子Gipsy Queen 16條染色體中有3對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體，5對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體，其中1對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體在短臂具隨體。

風(fēng)信子Purple Sensation的核型公式為2n=2x=16=6m+2m(sat)+8sm，染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為2.89%～10.44%，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=6L+2M2+2M1+6S，著絲點(diǎn)指數(shù)變化范圍為25.63%～49.13%，臂比變化范圍為1.04～2.91，平均臂比為1.87，最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度之比為3.61，臂比大于2的染色體占總?cè)旧w數(shù)的43.75%，核型不對(duì)稱系數(shù)為58.92%，為2B核型。風(fēng)信子Purple Sensation的16條染色體中有4對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體，其中1對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體在短臂具隨體，4對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體(圖2，表2)。

風(fēng)信子Odysseus的核型公式為2n=2x=16=6m+2m(sat)+8sm，染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為2.77%～10.41%，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=7L+1M2+2M1+6S，著絲點(diǎn)指數(shù)變化范圍在26.76%～48.67%，臂比變化范圍為1.05～2.73，平均臂比為1.78，最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度之比為3.75，臂比大于2的染色體占總?cè)旧w數(shù)的37.5%，核型不對(duì)稱系數(shù)為59.18%，為2B核型。風(fēng)信子Odysseus的16條染色體中有4對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體，其中1對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體在短臂具隨體，4對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體(圖2，表3)。

1，吉普賽女王；2，紫色情感；3，奧德修斯。1， Gipsy Queen; 2， Purple Sensation; 3， Odysseus.圖2 三個(gè)風(fēng)信子品種中期染色體(A)、核型(B)與核型模式圖(C)Fig.2 Metaphase chromosome (A)， karyotype (B) and karyotype pattern map (C) of three hyacinth varieties

表1GipsyQueen染色體核型參數(shù)

Table1Parameters of chromosome karyotype of Gipsy Queen

序號(hào)No.相對(duì)長(zhǎng)度Relative length/%短臂Short arm長(zhǎng)臂Long arm全長(zhǎng)Length臂比(長(zhǎng)臂/短臂)Arm ratio(L/S)著絲點(diǎn)位置Position ofcentromere著絲點(diǎn)指數(shù)Centromericindex/%染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)Coefficient ofrelative length染色體相對(duì)長(zhǎng)度類型Type of relativelength14.97±0.195.17±0.0910.14±0.211.04±0.05m49.011.62L24.81±0.144.99±0.169.80±0.301.04±0.01m49.081.57L34.26±0.304.66±0.218.92±0.151.10±0.13m47.761.43L43.96±0.114.43±0.178.40±0.231.12±0.04m47.141.34L53.95±0.304.03±0.217.98±0.151.02±0.13m49.541.28L63.80±0.114.06±0.177.85±0.231.07±0.04m48.371.26L72.94±0.174.87±0.60(7.81±0.77)1.71±0.11sm(sat)37.641.25M2+(2.02±0.22)82.55±0.124.39±0.18(6.94±0.30)1.72±0.02sm(sat)36.741.11M2+(1.95±0.09)91.58±0.053.64±0.225.22±0.272.31±0.08sm30.270.84M1101.51±0.023.46±0.154.97±0.152.30±0.09sm30.380.80M1111.32±0.083.60±0.124.92±0.192.74±0.08sm26.830.79M1121.21±0.083.43±0.084.65±0.072.84±0.23sm26.530.76M1131.03±0.052.31±0.093.34±0.032.32±0.31sm30.840.53S140.94±0.102.20±0.153.14±0.222.34±0.28sm29.940.50S150.98±0.102.03±0.123.01±0.222.07±0.06sm32.550.48S161.12±0.101.84±0.132.95±0.212.06±0.10sm32.720.47S

sat，具隨體的染色體，隨體長(zhǎng)度不計(jì)入染色體長(zhǎng)度；m，中部著絲區(qū)；sm，近中部著絲區(qū)；L，長(zhǎng)染色體；M1，中短染色體；M2，中長(zhǎng)染色體；S，短染色體。下同。

sat， Satellite chromosome， satellite regions were excluded from the length calculation; m, Metacentric centromere; sm, Submetacentric centromere; L, Long chromosome; M1, Mid-short chromosome; M2, Mid-long chromosome; S, Short chromosome. The same as below.

表2PurpleSensation染色體核型參數(shù)

Table2Parameters of chromosome karyotype of Purple Sensation

序號(hào)No.相對(duì)長(zhǎng)度Relative length/%短臂Short arm長(zhǎng)臂Long arm全長(zhǎng)Length臂比(長(zhǎng)臂/短臂)Arm ratio(L/S)著絲點(diǎn)位置Position ofcentromere著絲點(diǎn)指數(shù)Centromericindex/%染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)Coefficient ofrelative length染色體相對(duì)長(zhǎng)度類型Type of relativelength15.09±0.175.35±0.3610.44±0.531.05±0.04m48.791.67L25.06±0.315.24±0.2410.31±0.541.04±0.02m49.131.65L34.51±0.074.92±0.349.43±0.301.09±0.09m47.841.51L44.37±0.184.67±0.439.04±0.601.07±0.07m48.381.45L53.96±0.194.28±0.398.24±0.211.08±0.15m48.021.32L63.83±0.194.04±0.217.87±0.401.05±0.01m48.641.26L72.80±0.194.48±0.07(7.28±0.23)1.61±0.10m(sat)38.441.16M2+(1.89±0.13)82.78±0.284.06±0.23(6.84±0.11)1.48±0.24m(sat)40.641.09M2+(1.93±0.19)91.35±0.223.52±0.384.87±0.592.63±0.15sm27.670.78M1101.30±0.203.38±0.294.68±0.492.62±0.21sm27.760.76M1111.26±0.013.36±0.174.62±0.162.67±0.15sm27.270.74S121.17±0.043.16±0.114.33±0.072.69±0.19sm27.080.69S131.10±0.202.06±0.123.16±0.241.92±0.34sm34.70.51S140.78±0.092.26±0.223.04±0.302.91±0.07sm25.630.49S150.98±0.141.98±0.112.96±0.192.05±0.31sm33.150.47S160.74±0.112.15±0.312.89±0.422.91±0.15sm25.640.46S

表3Odysseus染色體核型參數(shù)

Table3Parameters of chromosome karyotype of Odysseus

序號(hào)No.相對(duì)長(zhǎng)度Relative length/%短臂Short arm長(zhǎng)臂Long arm全長(zhǎng)Length臂比(長(zhǎng)臂/短臂)Arm ratio(L/S)著絲點(diǎn)位置Position ofcentromere著絲點(diǎn)指數(shù)Centromericindex/%染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)Coefficient ofrelative length染色體相對(duì)長(zhǎng)度類型Type of relativelength15.07±0.275.34±0.3510.41±0.611.05±0.02m48.671.67L24.46±0.254.90±0.399.36±0.591.10±0.06m47.701.50L34.00±0.194.94±0.248.93±0.561.24±0.12m44.761.43L43.92±0.164.67±0.108.60±0.151.19±0.06m45.621.38L54.08±0.154.44±0.218.53±0.351.09±0.01m47.851.36L64.00±0.044.23±0.158.24±0.171.06±0.04m48.601.32L73.28±0.585.24±0.84(8.53±0.80)1.60±0.12m(sat)38.521.36L+(2.01±0.14)82.98±0.504.38±0.53(7.36±0.57)1.48±0.15m(sat)40.491.18M2+(2.30±0.15)91.42±0.133.44±0.274.86±0.392.43±0.06sm29.220.78M1101.34±0.093.34±0.214.68±0.302.49±0.06sm28.680.75M1111.22±0.073.32±0.154.55±0.162.73±0.19sm26.760.73S121.19±0.073.17±0.194.36±0.242.68±0.12sm27.240.70S130.91±0.142.10±0.103.02±0.132.34±0.38sm30.280.48S140.84±0.091.99±0.072.83±0.082.38±0.28sm29.800.45S151.07±0.171.92±0.122.99±0.231.83±0.26sm35.710.48S161.00±0.151.77±0.112.77±0.221.79±0.21sm35.980.44S

3 結(jié)論與討論

由于植物染色體絕對(duì)長(zhǎng)度值變異較大，因此，現(xiàn)代核型分析中常以相對(duì)長(zhǎng)度值作為核型分析的重要指標(biāo)[13]。本研究中3個(gè)品種的風(fēng)信子染色體相對(duì)長(zhǎng)度介于2.77%～10.44%，Odysseus染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍較廣。Gipsy Queen的染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=6L+2M2+4M1+4S，與Ved Brat[15]報(bào)道的 Gipsy Queen染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=6L+2Ln+4M+4S的結(jié)果存在差異，猜測(cè)可能是經(jīng)過(guò)近1個(gè)世紀(jì)的變遷，導(dǎo)致Gipsy Queen發(fā)生了染色體結(jié)構(gòu)變異。

隨體是少數(shù)染色體所具有的特殊結(jié)構(gòu)，一般認(rèn)為，隨體為高度惰性的異染色質(zhì)，基本沒(méi)有功能基因[16]。通常認(rèn)為隨體的出現(xiàn)是染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的形態(tài)表現(xiàn)[10]，隨體數(shù)目、位置和大小在種或品種間差異較大，因此，隨體也是核型分析的一項(xiàng)重要指標(biāo)。試驗(yàn)的3個(gè)風(fēng)信子品種均含1對(duì)隨體，隨體數(shù)目與倍性相同，且都位于染色體的短臂上。與目前報(bào)道較多的幾種球根花卉有所不同，國(guó)內(nèi)野生的郁金香(Tulipagesneriana)未發(fā)現(xiàn)隨體[17]，百合[8]、彩色馬蹄蓮(Zantedeschiahybrida)[18]等球根的隨體多位于染色體長(zhǎng)臂上，其中二倍體百合隨體有2～8條，且多數(shù)在第1或第2對(duì)染色體短臂上存在居間隨體。卿秋靜[10]認(rèn)為，次縊痕和隨體的數(shù)目可能與植物所處海拔有關(guān)，但由于風(fēng)信子起源簡(jiǎn)單，且都為栽培品種，因此，本研究無(wú)法驗(yàn)證這一觀點(diǎn)。

高等植物核型演化的大致趨勢(shì)是由對(duì)稱至不對(duì)稱發(fā)展的，系統(tǒng)進(jìn)化比較古老或原始的物種具有較對(duì)稱的核型，而進(jìn)化程度較高的物種，核型對(duì)稱性程度低，不對(duì)稱系數(shù)大[12]。本研究中3個(gè)風(fēng)信子品種的核型不對(duì)稱系數(shù)由高到低依次為Gipsy Queen(59.24%)>Odysseus(59.18%)>Purple Sensation(58.92%)，表明3個(gè)品種中進(jìn)化程度最高的是Gipsy Queen，最低的是Purple Sensation。3個(gè)品種的核型類型均為2B型，與Hu等[19]的研究結(jié)果一致，表明這3個(gè)品種的親緣關(guān)系較近且都較為原始。有學(xué)者在研究核型過(guò)程中參照AI值計(jì)算核不對(duì)稱性[20]，且有研究表明，染色體進(jìn)化過(guò)程中，染色體間不對(duì)稱性(A1)比染色體內(nèi)不對(duì)稱性(A2)作用大[21]。隨著植物遺傳育種工作的不斷開(kāi)展，風(fēng)信子品種不斷增加，僅研究3個(gè)品種風(fēng)信子的核型不足以準(zhǔn)確說(shuō)明風(fēng)信子遺傳進(jìn)化問(wèn)題。因此，有必要開(kāi)展關(guān)于風(fēng)信子更系統(tǒng)更精確的核型研究。

多倍體風(fēng)信子品種出現(xiàn)的時(shí)間較晚，且高度可育[18]。因此，二倍體風(fēng)信子品種整體較為原始。多倍化是植物進(jìn)化的重要途徑，不同倍性種或品種間雜交可以豐富遺傳變異，增加育種潛力[22]。本研究參照胡鳳榮等[23]的方法研究了3個(gè)風(fēng)信子品種的核型，品種較少，且單靠核型類型或核不對(duì)稱系數(shù)難以準(zhǔn)確判斷植物的進(jìn)化程度，因此，需要在細(xì)胞和分子水平進(jìn)行深入研究[24-25]，為風(fēng)信子的系統(tǒng)分類和品種選育提供更為可靠的細(xì)胞學(xué)依據(jù)。近年來(lái)，熒光原位雜交等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于禾本科[26]等重要的經(jīng)濟(jì)作物與模式植物的核型分析，國(guó)內(nèi)外對(duì)風(fēng)信子進(jìn)化的研究?jī)H停留在雜交育種和核型分析，今后可構(gòu)建多種原位雜交探針來(lái)研究風(fēng)信子染色體的精細(xì)結(jié)構(gòu)。