姚 婷，謝惠林，鄧勝國,，趙雅倩，董加寶*

(1.湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199；2.江華縣同泰中藥飲片有限公司，湖南 江華 425500)

月桂(Laurus nobilis L.)是樟科月桂屬亞熱帶樹種，原產(chǎn)于地中海沿岸，我國的江蘇、浙江、四川、山東、陜西、福建及云南等省有大量栽培。月桂葉中含有多糖類、多酚類化合物、氨基酸、粗蛋白、粗纖維、有機(jī)酸、維生素、礦質(zhì)元素、萜類和黃酮類化合物等。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中月桂葉中揮發(fā)油和黃酮類研究較多，其他成分的研究較少[1-3]。月桂葉水提物可作為止瀉劑，用于腸胃疾病的治療[4-6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：永州本地月桂葉于2019年3月25日采自湖南科技學(xué)院逸夫樓前，洗凈、晾干、干燥、粉碎、過篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：無水乙醇、95%乙醇、苯酚、硫酸、葡萄糖均為分析純。

1.2 主要儀器

AY220型電子分析天平；722型紫外可見分光光度計；DF-101S型集熱式磁力攪拌器；CN61M/F120型植物粉碎機(jī)；WG-71電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵；ZLS-2離心機(jī)。

2 方法

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定及多糖含量測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定及多糖含量測定按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

月桂葉中多糖提取得率 = CNV/m

式中，C為樣品稀釋液的多糖濃度(mg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；V為最初樣品定容體積(mL)；m為月桂葉的質(zhì)量(g)。

2.2 單因素試驗

精確稱取月桂葉粉約5.0 g 置于250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL的無水乙醇回流1 h，過濾，得到濾渣。

向濾渣中加入一定量的蒸餾水，在一定溫度下回流一定時間，濾液于25 mL容量瓶中定容，取1 mL定容液在100 mL容量瓶中，再次定容，制得樣品稀釋液。研究提取溫度、提取時間、液料比、提取次數(shù)四個因素對月桂葉多糖提取得率的影響。

2.2.1 提取溫度的影響

5.0 g月桂葉粉無水乙醇回流后濾渣，固定水料比16∶1，水浸取時間1 h，研究提取溫度為50、60、70、80、90、99℃時對多糖提取得率的影響。

2.2.2 提取時間的影響

5.0 g月桂葉粉無水乙醇回流后濾渣，固定水浸取溫度為80℃，水料比16∶1，研究提取時間為0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時對多糖提取得率的影響。

2.2.3 料液比的影響

5.0 g月桂葉粉無水乙醇回流后濾渣，固定水浸提溫度80℃，水浸提時間1 h，研究液料比為8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1 時對多糖提取得率的影響。

以上試驗均設(shè)3個平行組，求平均值。

2.3 提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素影響試驗結(jié)果，選取提取溫度，提取時間，料液比3個因素，每個因素選擇3個水平，按響應(yīng)面安排試驗，以多糖得率作為提取效果的指標(biāo)，分析試驗結(jié)果，優(yōu)選最佳提取工藝，得到月桂葉多糖響應(yīng)面提取的最佳工藝[8-9]，試驗因素水平編碼見表1。

表1 試驗因素水平表

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 月桂葉多糖提取的單因素試驗

3.1.1 提取溫度對月桂葉多糖得率的影響

提取溫度對月桂葉多糖得率的影響如圖1所示。隨溫度的升高，多糖提取率不斷增加，到達(dá)80℃基本不再增加，趨于平緩，在90℃后多糖得率更有下降，可能是因為較高溫度破壞了部分浸出的多糖，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的析出也將增加，從而使多糖的提取量略有降低。隨著溫度的升高，多糖色澤加深，考慮到高溫可能對多糖的結(jié)構(gòu)與活性有一定影響，溫度過高多糖易產(chǎn)生降解，而且溫度過高，水分容易揮發(fā)，給操作帶來不便，所以選擇80℃作為提取的最佳溫度。

圖1 提取溫度對月桂葉多糖得率的影響

3.1.2 提取時間對月桂葉多糖得率的影響

提取時間對月桂葉多糖得率的影響如圖2所示。隨著加熱時間的延長可以促進(jìn)多糖的溶解，2 h后提取率基本保持不變。隨著提取時間的延長，熱水可能致使月桂葉原料中大分子多糖分解，導(dǎo)致多糖提取量略有下降。此外，提取時間過長還會使溶解的雜質(zhì)增多，使多糖的純度降低，同時加熱時間若過長，能耗明顯要增加，從節(jié)約能源、減少生產(chǎn)周期考慮，故選擇2 h作為最佳提取時間。

圖2 提取時間對月桂葉多糖得率的影響

3.1.3 液料比對月桂葉多糖得率的影響

圖3 液料比對月桂葉多糖得率的影響

液料比對月桂葉多糖得率的影響如圖3所示。隨液料比的增大，多糖得率有提高的的趨勢，當(dāng)液料比等于16∶1時多糖得率最高，然而，當(dāng)液料比大于16∶1時，多糖得率呈下降趨勢。這可能是因為當(dāng)溶劑量不足時，多糖提取不充分，導(dǎo)致多糖得率較低。當(dāng)溶劑劑量過多時，會使其他雜質(zhì)同時溶出，從而影響月桂葉多糖的溶出，使得實驗準(zhǔn)確性降低，從而影響多糖得率。因此，選取液料比為16∶1左右最佳。

3.2 月桂葉提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件，以月桂葉多糖提取得率為響應(yīng)值，以提取溫度(A)、提取時間(B)、液料比(C)3個因素為自變量，建立三因素三水平中心組合試驗，共17個試驗方案，試驗結(jié)果見表2。

表2 提取率響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

3.3 回歸方程的建立

采用Design expert 8.0.6對表中試驗結(jié)果進(jìn)行多項?；貧w，得到月桂葉提取時間(B)、液料比(C)的二次多項模擬方程：

Y=1.47+0.47A-0.42B-1.17C+0.24AB-0.21AC+0.64BC-2.09A2-0.68B2-2.94C2

為了更好的驗證本實驗回歸方程的實用性，同時也為了更好的確定各因素對月桂葉多糖得率的影響程度，對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表3。由方差分析可知:模型的F=118.54模型的顯著水平p小于0.0001，遠(yuǎn)小于0.01，表明實驗所采用的二次多項模型是極顯著的，在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的[10]。該實驗方法是可行的。用失擬項來表示所選用模型與實驗擬合的程度，即二者的差異程度。本實驗的失擬項的P值為0.0514>0.05，不顯著，對模型是有利的，沒有失擬因素存在，所以可以用方程代替試驗真實點(diǎn)對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。該模型的決定系數(shù)R2=0.9851。也說明該模型能夠較好的反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好。各因素的效應(yīng)關(guān)系為PA、PB、PC、PA2、PB2、PC2、PBC均小于0.05，說明提取溫度、提取時間、液料比3個因素的二次項以及提取時間與液料比的交互項都有顯著影響。

表3 回歸模擬方差分析

注：**P<0.01為極顯著；*P<0.05為顯著。

3.4 各因素的交互作用分析

各因素的交互作用如圖5所示。由圖5可以分析得出各個因素對月桂葉多糖得率的影響程度[8]。從3張圖對比之下我們可以很直觀得分析得出：3個因素中液料比月桂葉多糖得率的影響最大，表現(xiàn)為各個因素之間的交互作用中有液料比的，響應(yīng)曲面表現(xiàn)較陡峭，再由液料比與提取溫度的交互作用影響圖和液料比與提取時間交互作用影響圖進(jìn)行比較可以很直觀得看出圖液料比與提取溫度的交互作用響應(yīng)曲面較陡，從而得出提取溫度比提取時間對月桂葉多糖的得率影響更大。再從表3中的F值中也能得到驗證這3種因素影響程度大小順序分別為:C(液料比)>A(提取溫度)>B提取時間。

圖5 各因素之間交互作用影響以及月桂葉多糖得率的響應(yīng)曲面

3.5 優(yōu)化工藝驗證試驗

運(yùn)用Design expert8.0.6軟件對二次多項式回歸方程進(jìn)行計算，得到最佳的月桂葉多糖提取條件為：溫度82.65℃,提取時間1.89 h，液料比15.35∶1，多糖得率預(yù)測值為1.4656%。但考慮到實際操作的局限性，把月桂葉多糖提取工藝修正為：提取溫度82℃，提取時間1.9 h，液料比16∶1，在修正條件下進(jìn)行了3次平行驗證實驗可達(dá)到月桂葉多糖得率平均值為1.46%。與模型預(yù)測值相差不大，具有使用價值。多糖得率見表4。

表4 最佳提取條件及其驗證

4 結(jié)論

本實驗根據(jù)單因素試驗數(shù)據(jù)分析最終得到月桂葉多糖的提取條件，結(jié)果表明月桂葉多糖提取工藝參數(shù)為：溫度80℃，提取時間2 h，液料比16∶1,在此工藝下得到月桂葉多糖含量結(jié)果最佳。由響應(yīng)面分析中的方差分析以及各因素交互作用可知，影響月桂葉多糖提取條件因素主次順序C(液料比)>A(提取溫度)>B提取時間；建立了多糖得率的回歸模型，由該模型優(yōu)化的多糖最佳提取工藝條件為：溫度82℃，提取時間1.9 h，液料比16∶1,在此條件下得到月桂葉多糖含量為1.46%。