黃志 顏未 蒯琳萍

摘要：為了研究核電站建設(shè)運(yùn)營(yíng)、礦源開采等行為對(duì)周邊環(huán)境的影響，以大腸桿菌為對(duì)象，通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線以及MTT（噻唑藍(lán)）法定量測(cè)量鈷（Co）、銫（Cs）、鍶（Sr）3種核素對(duì)大腸桿菌的毒性作用，得到了鈷、銫、鍶3種核素與大腸桿菌的劑量-抑菌率關(guān)系，同時(shí)通過(guò)測(cè)定細(xì)胞壁通透性以及胞內(nèi)活性氧含量，發(fā)現(xiàn)這3種離子對(duì)大腸桿菌的抑菌作用與細(xì)胞壁通透性以及胞內(nèi)活性氧的積累可能存在正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，Co2+、Sr2+、Cs+對(duì)大腸桿菌的半致死濃度分別為3.38、251、1 600 mg/L，其金屬毒性由強(qiáng)到弱順序?yàn)镃o2+>Sr2+>Cs+，并且Sr2+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)具有雙向性影響，低濃度（<10 mg/L）時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)生長(zhǎng)作用，而濃度增高則表現(xiàn)為抑制作用。Co2+的抑菌作用與大腸桿菌細(xì)胞壁通透性增大有關(guān)，而Sr2+、Cs+的抑菌作用通過(guò)金屬離子誘導(dǎo)細(xì)胞體內(nèi)活性氧含量增大，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。從宏觀層面反應(yīng)了3種核素的金屬毒性，并從微觀層面進(jìn)行了機(jī)理的探討，為后續(xù)研究鈷、銫、鍶等核素對(duì)生物體的致毒效應(yīng)以及環(huán)境中核素的生物監(jiān)測(cè)方法提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：Co;Sr;Cs;金屬毒性;大腸桿菌;活性氧含量;細(xì)胞壁通透性

隨著核技術(shù)在軍事、工農(nóng)業(yè)、科研等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，由泄漏物質(zhì)造成的放射性污染以及鈷、銫、鍶等金屬產(chǎn)生的金屬毒性對(duì)周邊水域的影響也引起了廣泛的關(guān)注[1]。我國(guó)核工業(yè)高速發(fā)展使得核電站的建設(shè)已經(jīng)成為我國(guó)能源戰(zhàn)略中的一項(xiàng)重要議事，而內(nèi)陸核電站的建設(shè)更是面臨著更嚴(yán)格的安全考量。由于內(nèi)陸核電站受納水體容積小，一旦發(fā)生泄漏，將對(duì)周圍居民的生活帶來(lái)巨大的影響，因此為保證環(huán)境污染水平監(jiān)測(cè)的可靠性，內(nèi)陸核電站需要更多的科學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[2]。同時(shí)由于磷酸鹽礦、煤礦、鐵礦等礦源經(jīng)常伴隨著天然核素的存在，這些礦源的開采利用也將會(huì)對(duì)環(huán)境帶來(lái)污染[3]。核素通過(guò)擴(kuò)散遷移流入到生態(tài)環(huán)境中，最終會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生各種影響[4-5]，因此需要采取有效的手段進(jìn)行污染檢測(cè)。生物監(jiān)測(cè)可作為一項(xiàng)重要的手段，能夠更加客觀地評(píng)價(jià)內(nèi)陸核電站在正常運(yùn)行、事故工況以及退役過(guò)程中釋放的核素對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的影響[6]。同時(shí)，隨著核能源的大力發(fā)展，核廢料的處理量也在逐年增長(zhǎng)，而原料的開采以及廢料的處理，均不可避免地會(huì)對(duì)周圍環(huán)境造成一定的影響，尤其是像鈷、銫、鍶等核素，如何評(píng)價(jià)這些核素對(duì)環(huán)境的影響也成了當(dāng)務(wù)之急。

作為自然界中數(shù)量最多、生物量最大、對(duì)生命元素循環(huán)具有最大影響的種群，在水體環(huán)境監(jiān)測(cè)上，微生物具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[7]。低等微生物對(duì)環(huán)境中包括核素在內(nèi)的金屬污染物、有機(jī)化合物等污染會(huì)表現(xiàn)得更加敏感，它們能夠最快地感受到生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)境質(zhì)量的變化，并通過(guò)相關(guān)機(jī)制做出反應(yīng)。因此，微生物被認(rèn)為是最有潛力的指示生物[8]。大腸桿菌是重要的微生物研究材料，也是重要的環(huán)境污染指示菌，以大腸桿菌為研究對(duì)象，能夠更普遍地反應(yīng)核素泄漏對(duì)環(huán)境的影響，也能夠通過(guò)跟蹤污染區(qū)域的大腸桿菌生長(zhǎng)情況來(lái)評(píng)估該區(qū)域的污染程度。

MTT（噻唑藍(lán)）比色法一般用于細(xì)胞活性檢測(cè)，利用雙波長(zhǎng)法可以有效地去除包括死菌體、培養(yǎng)基在內(nèi)的干擾物對(duì)試驗(yàn)的影響[9]。傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)，與之相比，MTT法工作量小，操作快捷并且重復(fù)性高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)。近年來(lái)MTT法也越來(lái)越多地應(yīng)用于活菌數(shù)的測(cè)量，本試驗(yàn)利用MTT法測(cè)量大腸桿菌的存活率，數(shù)據(jù)可靠且重復(fù)性高。

目前，在農(nóng)藥等污染領(lǐng)域中，將微生物作為污染指示生物的相關(guān)研究已經(jīng)取得了令人矚目的成就[10]。然而，在核素污染領(lǐng)域，選用微生物進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)研究Co、Sr、Cs 3種核素外源添加對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)速率的影響，定性反映核素對(duì)大腸桿菌的抑制作用，再利用MTT法定量檢測(cè)3種核素對(duì)大腸桿菌的半致死濃度，最后從細(xì)胞壁通透性變化以及氧化損傷2個(gè)方面研究鈷、銫、鍶3種金屬離子的致毒機(jī)理，為核電站泄漏污染物的生物監(jiān)測(cè)提供相關(guān)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coil-DH5α）：2017年6月購(gòu)置于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，并于農(nóng)業(yè)生物學(xué)院資源環(huán)境實(shí)驗(yàn)室完成本試驗(yàn)。

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)、實(shí)驗(yàn)室高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、振蕩渦旋器、水浴搖床、酶標(biāo)儀、冷凍離心機(jī)、移液槍和超凈工作臺(tái)。

1.3 試劑

金屬離子均為氯化物：氯化鈷、氯化鍶、氯化銫。相關(guān)研究表明，不同陰離子對(duì)金屬離子的毒性有不同影響，在研究較為廣泛的Cl-、NO3-、OAc-這3種陰離子中，氯離子對(duì)金屬離子毒性影響較小[11]。其他試劑：MTT（噻唑藍(lán)）、二甲亞砜（DMSO）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、氯化鈉、活性氧ROS檢測(cè)試劑盒、堿式磷酸酶檢測(cè)試劑盒。

1.4 培養(yǎng)基

R2A液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.25 g，酸水解酪蛋白 0.5 g，酵母浸粉0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氫二鉀0.3 g，硫酸鎂0.1 g，丙酮酸鈉0.3 g，蛋白胨0.25 g，葡萄糖0.5 g，蒸餾水1 000 mL自然溶解，pH值為7.1～7.3。試驗(yàn)前需要121 ℃高溫滅菌20 min。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 濃度梯度培養(yǎng)基配制 反應(yīng)體系總體積均為 100 mL，體系營(yíng)養(yǎng)成分均為R2A液體培養(yǎng)基，加入適量金屬離子溶液，配制不同濃度梯度金屬離子液體培養(yǎng)基：Co2+液體培養(yǎng)基中Co2+濃度分別為0（對(duì)照組）、5、10、20、40 mg/L;Cs+液體培養(yǎng)基中銫離子濃度分別為0（對(duì)照組）、10 、100、1 000、2 000 mg/L;Sr2+液體培養(yǎng)基中Sr2+濃度分別為0（對(duì)照組）、10、100、1 000、2 000 mg/L。通過(guò)繪制各金屬離子脅迫下大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線，來(lái)確定最佳孵育時(shí)間以及后續(xù)試驗(yàn)的濃度范圍。

MTT法定量測(cè)量核素的金屬毒性中，根據(jù)生長(zhǎng)曲線判斷合適的離子濃度。此時(shí)的濃度梯度設(shè)置為Co2+液體培養(yǎng)基中Co2+濃度分別為0（對(duì)照組）、1、2.5、5、10、15、20 mg/L;Cs+液體培養(yǎng)基中Cs+濃度分別為0（對(duì)照組）、200、400、800、1 600、3 200 mg/L;Sr2+液體培養(yǎng)基中Sr2+濃度分別為0（對(duì)照組）、10、50、100、200、400、800、1 600 mg/L。每組設(shè)置3個(gè)平行樣。

磷酸酶活性、活性氧含量測(cè)量試驗(yàn)組中各濃度梯度：Co2+液體培養(yǎng)基中Co2+濃度分別為0（對(duì)照組）、1、2、4、6、8、10 mg/L;Cs+液體培養(yǎng)基中Cs+濃度分別為0（對(duì)照組）、200、400、800、1 600、3 200 mg/L;Sr2+液體培養(yǎng)基中Sr2+濃度分別為0（對(duì)照組）、10、50、100、150、200、250 mg/L。每組設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.5.2 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線繪制 從細(xì)菌平板上挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的細(xì)菌接種至100 mL R2A液體培養(yǎng)基中，恒溫水浴（37 ℃）振蕩培養(yǎng)24 h，復(fù)蘇細(xì)菌待用。

按照1 ∶ 100的接種比例，從已復(fù)蘇的菌液中吸取1 mL接入盛有100 mL各濃度梯度Co2+液體培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩混合均勻后分裝至具塞試管，每試管分裝5 mL，封口，置于37 ℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)。每隔1 h左右取出1組試管，測(cè)量其在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度。氯化鍶、氯化銫試驗(yàn)組除培養(yǎng)基配制不同外其余操作相同。

1.5.3 MTT法檢測(cè)大腸桿菌在3種核素影響下的存活率 噻唑藍(lán)[3-3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，簡(jiǎn)稱MTT]法是常用于檢測(cè)細(xì)胞存活的一種方法，其原理是活細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶能夠還原外源性MTT為不溶于水的藍(lán)色晶體甲瓚（formazan），通過(guò)二甲亞砜溶解甲瓚，測(cè)量溶液在特定波長(zhǎng)下的吸光度，間接反映細(xì)胞存活數(shù)量。

稱取250 mg MTT溶于50 mL PBS緩沖溶液（0.01 mol/L，pH=7.2），振蕩使其充分溶解，使用微孔過(guò)濾器除菌，鋁箔包好放置于-20 ℃下冷凍待用。按照濃度梯度設(shè)置配制氯化鈷液體培養(yǎng)基并接種活化的大腸桿菌，水浴振蕩培養(yǎng)4 h。

孵育培養(yǎng)4 h后于試管中吸取1 mL菌液至1.5 mL EP管中，加入200 μL 5 mg/mL MTT溶液，振蕩搖勻，避光放置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育1 h。

孵育完成后取出EP管，放入高速冷凍離心機(jī)12 000 g離心10 min，小心吸去上清液，加入1 mL二甲亞砜溶液，振蕩搖勻后將混合液鋪至96孔板，每孔200微升并設(shè)置復(fù)孔，酶標(biāo)儀檢測(cè)510 nm以及690 nm波長(zhǎng)下的吸光度。Co2+、Sr2+、Cs+試驗(yàn)組操作除培養(yǎng)基配制外均相同。

1.5.4 大腸桿菌在3種核素影響下的堿式磷酸酶活性測(cè)量 按照濃度梯度要求配制100 mL R2A液體培養(yǎng)基，同時(shí)接種1 mL新鮮菌液至培養(yǎng)基中，水浴振蕩孵育4 h。完成孵育培養(yǎng)后取菌液于12 000 g加速度條件下離心10 min，并按照堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明書要求，取0.05 mL樣本加入0.5 mL PBS緩沖液，37 ℃水浴振蕩15 min，加入顯色劑 1.5 mL，并在520 nm條件下進(jìn)行吸光度測(cè)量，通過(guò)公式轉(zhuǎn)換得到堿性磷酸酶活性。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5 大腸桿菌在3種核素影響下的活性氧含量測(cè)量 按照“1.5.4”節(jié)中方法制取不同試驗(yàn)樣本并離心取菌體，在加速度為12 000 g的條件下離心樣本10 min，小心吸去上清液并用生理鹽水充分洗滌細(xì)菌菌體，按照活性氧（ROS）試劑盒說(shuō)明書要求，測(cè)試其活性氧含量。加入DCFH-DA（2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽）于上述菌體中，并保證工作濃度為 10 μmol/L，37 ℃孵育細(xì)胞30 min，12 000 g離心10 min，收集細(xì)菌菌體，并用PBS緩沖液洗滌2次，在次離心收集菌體用于熒光檢測(cè)。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，用于熒光強(qiáng)度檢測(cè)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.6 大腸桿菌在3種核素影響下的蛋白質(zhì)含量測(cè)量 按照“1.5.4”節(jié)中方法制取不同試驗(yàn)樣本。12 000 g離心 10 min，生理鹽水充分洗滌，取菌體溶于1 mL細(xì)菌裂解液。按照總蛋白定量試劑盒要求方法測(cè)定樣本中總蛋白的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種核素脅迫作用對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)速率的影響

由圖1可知，孵育2 h內(nèi)大腸桿菌在新的培養(yǎng)環(huán)境中處于適應(yīng)期，其生長(zhǎng)速度較為緩慢，隨后的7 h內(nèi)處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。在接觸培養(yǎng)前期，10 mg/L的Cs+濃度對(duì)大腸桿菌損傷作用較小，但隨著接觸培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，10 mg/L試驗(yàn)組中的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組的差異逐漸增大，說(shuō)明Cs+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響作用會(huì)隨接觸時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。在培養(yǎng)5 h后，10、100 mg/L試驗(yàn)組的吸光度與對(duì)照組相比下降8%、11%，而1 000、2 000 m/L試驗(yàn)組與對(duì)照組相比分別下降了31%、45%?？梢钥闯?，Cs+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)主要表現(xiàn)為抑制作用，且隨著劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng);隨著培養(yǎng)接觸時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制作用也在逐漸增強(qiáng)。

由圖2可知，Sr2+對(duì)大腸桿菌的作用具有雙向性，主要表現(xiàn)在低濃度（10 mg/L）Sr2+下，大腸桿菌的生長(zhǎng)比較迅速并且超過(guò)對(duì)照組，而隨著Sr2+濃度的增加，濃度大于等于 100 mg/L 后，大腸桿菌生長(zhǎng)變緩、數(shù)量越來(lái)越少。培養(yǎng)4 h后，與對(duì)照組相比，100 mg/L Sr2+濃度的培養(yǎng)基中，大腸桿菌菌液D600 nm值下降25%，1 000 mg/L Sr2+濃度試驗(yàn)組D600 nm值下降42%?？梢钥闯?，與Cs+培養(yǎng)條件相比，添加Sr2+培養(yǎng)基中大腸桿菌的生長(zhǎng)更緩慢;同時(shí)，在1 000、2 000 mg/L高濃度試驗(yàn)組中大腸桿菌出現(xiàn)了提前進(jìn)入衰亡期的現(xiàn)象，即接觸反應(yīng)7 h后，低濃度試驗(yàn)組的大腸桿菌還處于對(duì)數(shù)期，而高濃度試驗(yàn)組大腸桿菌已經(jīng)進(jìn)入衰亡期。

由圖3可知，5 mg/L Co2+對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯影響，其生長(zhǎng)數(shù)量明顯低于對(duì)照組，且20、40 mg/L試驗(yàn)組中大腸桿菌幾乎無(wú)法生長(zhǎng)。在培養(yǎng)5 h后，與對(duì)照組相比，5、10 mg/L 試驗(yàn)組中大腸桿菌D600 nm值分別下降58%、91%，高濃度Co2+（>20 mg/L）培養(yǎng)條件下大腸桿菌基本無(wú)法生長(zhǎng)。

2.2 MTT法檢測(cè)3種核素離子對(duì)大腸桿菌毒害性

2.2.1 不同濃度Co2+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)情況的影響 由圖4可知，在Co2+濃度為10 mg/L時(shí)大腸桿菌的死亡率已經(jīng)達(dá)到93.2%，而當(dāng)Co2+濃度增加至20 mg/L時(shí)可以使98%以上的大腸桿菌死亡。對(duì)濃度取對(duì)數(shù)，繪制大腸桿菌生長(zhǎng)抑制效應(yīng)曲線，并通過(guò)直線擬合發(fā)現(xiàn)Co2+濃度與大腸桿菌生長(zhǎng)抑制率呈現(xiàn)高度的線性關(guān)系，通過(guò)濃度擬合直線可以估算出Co2+對(duì)大腸桿菌的半致死效應(yīng)劑量約為3.38 mg/L。

2.2.2 不同濃度Cs+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)情況的影響 如圖5所示，隨著Cs+濃度增高大腸桿菌的存活率逐漸減小。觀察曲線發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cs+濃度在1 500 mg/L以下時(shí)，隨著Cs+濃度升高大腸桿菌的死亡率迅速增大，但當(dāng)Cs+濃度高于 1 500 mg/L 后，大腸桿菌死亡率的增長(zhǎng)逐漸趨于平緩。對(duì)濃度取對(duì)數(shù)，使其為橫坐標(biāo)， 繪制Cs+的抑菌效應(yīng)曲線， 擬合可得到Cs+對(duì)大腸桿菌的半致死率濃度約為1 600 mg/L。

2.2.3 不同濃度Sr2+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)情況的影響 由圖6可知，在10 mg/L Sr2+濃度劑量下，大腸桿菌的死亡率為負(fù)值，說(shuō)明其生長(zhǎng)狀況優(yōu)于對(duì)照組。而隨著Sr2+濃度繼續(xù)提高，大腸桿菌的存活率逐漸減小，取濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制抑制曲線，通過(guò)直線擬合可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Sr2+濃度為13 mg/L時(shí)，Sr2+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)情況與對(duì)照組基本持平，其生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相同，隨著Sr2+濃度的增加，大腸桿菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制，當(dāng)Sr2+濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)抑制率為40%。當(dāng)Sr2+濃度超過(guò)200 mg/L后，隨著Sr2+濃度提高大腸桿菌生長(zhǎng)抑制率的增幅逐漸減緩，當(dāng)濃度達(dá)到400 mg/L時(shí)抑制作用達(dá)到最大，隨后抑制作用存在但隨著劑量的增大而開始減小。取濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)Sr2+濃度為0～400 mg/L時(shí)的大腸桿菌生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行擬合，可估算Sr2+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)半致死量約為251 mg/L。在試驗(yàn)階段發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Sr2+濃度超過(guò)400 mg/L后，培養(yǎng)液中出現(xiàn)了肉眼可見的渾濁，并且隨著氯化鍶配制濃度的增加，渾濁度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。這可能是由于培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與Sr2+形成部分沉淀，降低了溶液中游離態(tài)Sr2+的存在，削弱了氯化鍶對(duì)大腸桿菌的毒害作用。

2.3 3種核素離子對(duì)大腸桿菌堿性磷酸酶活性的影響

由圖7可知，在1、2、4 mg/L Co2+濃度處理下，大腸桿菌胞外菌液中的堿式磷酸酶活性稍有增強(qiáng)，由0.11 U/L增加到0.17 U/L，增幅約50%。隨著Co2+濃度從4 mg/L增大至 10 mg/L， 大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性由0.17 U/L增大至0.79 U/L，酶活性提高約4倍。由圖8可知，在0～800 mg/L Cs+濃度下，大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性也出現(xiàn)提升，其活力由0.29 U/L上升至0.47 U/L，但當(dāng)Cs+濃度大于 800 mg/L 時(shí)，其胞外堿式磷酸酶活力基本不變。Sr2+對(duì)大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性的影響較小，在0～50 mg/L Sr2+濃度范圍內(nèi)，大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性由0.26 U/L上升到0.33 U/L，隨后隨著Sr2+濃度的升高，其胞外堿式磷酸酶活性小幅波動(dòng)，平均保持在0.33 U/L左右（圖9）。

2.4 3種核素離子對(duì)大腸桿菌菌體活性氧含量的影響

圖10顯示，在Co2+的作用下，大腸桿菌菌體活性氧含量隨著Co2+濃度升高呈現(xiàn)先緩慢增高后緩慢減弱的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，其相對(duì)熒光強(qiáng)度沒有明顯變化。而在Cs+、Sr2+的影響下，隨著金屬離子濃度的增加，大腸桿菌活性氧含量快速上升。由圖11可知，與對(duì)照組相比，400 mg/L Cs+濃度下，活性氧含量升高9.7%，1 600 mg/L Cs+濃度下活性氧含量升高74%，結(jié)合大腸桿菌在Cs+培養(yǎng)基中的存活率可以看出，Cs+的抑菌效應(yīng)與活性氧含量可能存在正相關(guān)關(guān)系。由圖12可知， 與對(duì)照組相比， 10 mg/L Sr2+濃度下， 活性氧含量相對(duì)減

少4.7%，隨后增加Sr2+濃度，活性氧含量隨之上升;其中，與對(duì)照組相比，50 mg/L試驗(yàn)組中活性氧含量上升14.7%，200 mg/L 試驗(yàn)組中活性氧含量上升55.1%，此時(shí)繼續(xù)增加Sr2+濃度，活性氧含量的增加量基本趨于平緩，與大腸桿菌在Sr2+作用下的存活率可能存在一定的正相關(guān)關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

目前在環(huán)境污染物生物監(jiān)測(cè)方向，主要監(jiān)測(cè)污染物為Pb2+、Ag+、Hg+、Cd2+、Cu2+、Zn2+，相關(guān)研究表明急性毒性由強(qiáng)到弱依次為Cd2+>Cu2+>Zn2+[12]。本試驗(yàn)以核電站的泄漏污染檢測(cè)為出發(fā)點(diǎn)，主要研究Co2+、Cs+、Sr2+ 3種穩(wěn)定核素對(duì)大腸桿菌的影響，后續(xù)通過(guò)MTT法定量研究了大腸桿菌在3種核素下的抑制效應(yīng)，反映了Co2+、Cs+、Sr2+ 3種核電站常見污染物對(duì)環(huán)境的毒性。

研究發(fā)現(xiàn)，Co2+的毒性最強(qiáng)，在濃度為10 mg/L即可對(duì)大腸桿菌造成明顯的毒害作用，能夠抑制90%以上細(xì)菌生長(zhǎng)，徐芳芳的研究表明Co2+濃度在11 mg/L時(shí)已經(jīng)具有明顯的抑菌作用[13]，本試驗(yàn)結(jié)果與之相符。而Cs+的毒性最小，Sr2+則表現(xiàn)出了雙向性，在10 mg/L濃度下對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)了促進(jìn)作用，隨著濃度增高，促進(jìn)作用削弱抑制作用增強(qiáng)，在400 mg/L時(shí)抑制作用最大，為48%。近年來(lái)有許多關(guān)于Sr2+對(duì)植物生長(zhǎng)影響的報(bào)道，大多數(shù)研究成果表明，低濃度的Sr2+促進(jìn)植物生長(zhǎng)而高濃度的鍶抑制植物生長(zhǎng)[14-15]，本試驗(yàn)中鍶對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)作用與之類似。Cs+比Sr2+、Co2+對(duì)大腸桿菌的毒性稍小，500 mg/L Cs+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)抑制率低于20%。董新姣等通過(guò)最小抑菌濃度反映重金屬對(duì)大腸桿菌的毒性，發(fā)現(xiàn)Hg+（1 mg/L）>Cd2+（50 mg/L），Pb2+（50 mg/L）>Cu2+（100 mg/L）>Zn2+（200 mg/L）[16]。由此可以得出，Co2+對(duì)大腸桿菌毒性較強(qiáng)，介于Hg+與Pb2+之間，而Sr2+、Cs+毒性較小。

金屬離子對(duì)細(xì)菌的毒害表現(xiàn)為多方面聯(lián)合作用。Avery等研究發(fā)現(xiàn)，Sr2+能夠改變酵母菌的細(xì)胞壁通透性[17]。細(xì)菌細(xì)胞壁具有抑制機(jī)械和滲透損傷的作用，能夠保持細(xì)胞外形，阻止大分子入侵。堿性磷酸酶主要存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，正常情況下細(xì)菌的培養(yǎng)液中檢測(cè)不到堿性磷酸酶的存在[18-19]。侯偉峰等通過(guò)測(cè)定菌液堿式磷酸酶活性，結(jié)合電導(dǎo)率的測(cè)定反映了植酸對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁的損壞情況[20]。Sun等研究結(jié)果證實(shí)，Al3+的脅迫作用能改變植物細(xì)胞壁的通透性，致使磷酸酶外泄[21]。碳酸鹽礦物中的陽(yáng)離子主要包括鈣、鎂、鐵、銅等元素。陳武研究表明，碳酸鹽礦物與大腸桿菌作用后堿性磷酸酶大量溢出，并通過(guò)電鏡掃描證明了這種堿性磷酸酶的溢出源自于大腸桿菌細(xì)胞壁被破壞后通透性增大導(dǎo)致[22]。本試驗(yàn)中，在Co2+作用下，大腸桿菌胞外堿性磷酸酶活性隨著Co2+濃度增加迅速上升，表明Co2+對(duì)大腸桿菌的細(xì)胞壁具有破壞作用，使得大腸桿菌的細(xì)胞壁通透性增加，繼而在胞外出現(xiàn)大量AKP?？梢酝茰y(cè)Co2+對(duì)大腸桿菌的至毒機(jī)理可能是破壞細(xì)胞壁完整性，使細(xì)菌內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性受到破壞，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。Cs+、Sr2+試驗(yàn)組中大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性變化不大，其抑菌作用與細(xì)胞壁的通透性完整性變化相關(guān)性不大。

金屬離子對(duì)微生物的毒性還體現(xiàn)在氧化損傷層面，研究表明金屬離子會(huì)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，通過(guò)線粒體呼吸鏈引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化損傷[23]。金屬離子也能抑制抗氧化酶系統(tǒng)，從而對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷[24]。馮德玉等在油菜對(duì)鍶脅迫的生理生態(tài)響應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，Sr2+對(duì)細(xì)胞同樣具有氧化損傷作用，在Sr2+脅迫作用下其氧化損傷作用增強(qiáng)，POD酶和SOD酶等抗氧化系統(tǒng)酶活性都出現(xiàn)了增高的現(xiàn)象[25]。本試驗(yàn)中在Co2+試驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)各組樣本中活性氧含量隨著Co2+濃度上升出現(xiàn)了先升后降的現(xiàn)象，但其變化幅度均在10%之內(nèi)。而Cs+、Sr2+試驗(yàn)組中活性氧含量檢測(cè)結(jié)果表明，外源添加的Cs+和Sr2+這2種金屬離子明顯提高了大腸桿菌菌體內(nèi)部活性氧含量，結(jié)合2種離子培養(yǎng)下的抑菌率可以推測(cè)Cs+與Sr2+對(duì)大腸桿菌的致毒效應(yīng)與其活性氧含量的積累有關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Co2+對(duì)大腸桿菌半致死濃度約為 3.38 mg/L，Sr2+對(duì)大腸桿菌半致死濃度約為251 mg/L，Cs+對(duì)大腸桿菌半致死濃度約為1 600 mg/L。Sr2+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)影響表現(xiàn)了雙向性，即低濃度（小于10 mgL）是表現(xiàn)為刺激生長(zhǎng)，而高濃度下表現(xiàn)為抑制生長(zhǎng)。Co2+的脅迫作用使大腸桿菌壁膜通透性發(fā)生改變?cè)斐蓧A性磷酸酶出現(xiàn)大量泄漏，表明Co2+毒性機(jī)理與其改變細(xì)胞壁膜通透性有關(guān)。Cs+與Sr2+的毒性與氧化損傷有關(guān)，離子誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧的積累，達(dá)到了抑菌作用。

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