李沛哲

摘要：CRISPR/Cas9是一種用于靶向特定基因的DNA修飾工具，產(chǎn)生于細(xì)菌和古細(xì)菌，是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，就像文字糾錯(cuò)軟件，可以檢測(cè)到病毒DNA并將其消滅并修復(fù)。經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展，已有多個(gè)物種應(yīng)用這一系統(tǒng)用于研究，還可能將應(yīng)用于基因編輯的科研、臨床治療等，現(xiàn)已證明CRISPR/Cas9技術(shù)擁有一定優(yōu)勢(shì)，比如設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作容易，但是背后還存在道德倫理問(wèn)題，以及該技術(shù)本身存在的問(wèn)題如脫靶效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9基因編輯疾病治療免疫防御

1.研究背景

20世紀(jì)70年代DNA重組技術(shù)開(kāi)始發(fā)展，這標(biāo)志著生物學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新階段。分子生物學(xué)家第一次獲得了操縱DNA分子的能力，使研究基因和利用它們開(kāi)發(fā)新的藥物和生物技術(shù)成為可能。

廣義來(lái)說(shuō)，基因組工程指的是對(duì)基因組進(jìn)行有針對(duì)性的修改、其上下片段（如表觀遺傳標(biāo)記）或其輸出（如轉(zhuǎn)錄本）的過(guò)程。在真核生物中，特別是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠十分容易且有效地做到這一點(diǎn)，對(duì)改變基礎(chǔ)科學(xué)、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)有著巨大的作用

生物的遺傳信息儲(chǔ)存在基因中，蛋白質(zhì)是由編碼基因決定的?；蛲蛔儠r(shí)，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸組成也會(huì)改變，有些蛋白質(zhì)會(huì)提前終止翻譯，遺傳疾病就會(huì)發(fā)生。特異性的修飾基因組靶點(diǎn)，可以用來(lái)治療遺傳病，人們研究修飾位點(diǎn)時(shí)，在細(xì)菌和古細(xì)菌中找到了某種 RNA，它可以用來(lái)標(biāo)記位點(diǎn)，命名為gRNA。CRISPR/Cas9蛋白和gRNA彼此之間相互作用，使得切割都發(fā)生在正確的位置。

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一種用于靶向基因特定DNA修飾的工具，細(xì)菌在其成長(zhǎng)環(huán)境中需要不斷對(duì)抗病毒，CRISPR指的是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其產(chǎn)生于細(xì)菌和古細(xì)菌，它們?yōu)榱藨?yīng)對(duì)病毒的攻擊而逐漸進(jìn)化，產(chǎn)生了這種系統(tǒng)，在CRISPR作用之下，可以檢測(cè)到病毒的DNA并將其消滅，該機(jī)制中，Cas9是一種蛋白質(zhì)，作用是尋找并切斷病毒的DNA，使其降解，crRNA（CRISPR-derived RNA）與tracrRNA（trans-activating RNA）會(huì)結(jié)合形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物能特異性識(shí)別靶基因序列，引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶在定位點(diǎn)將雙鏈DNA剪斷，然后，其非同源末端與修復(fù)機(jī)制相連接，將重新連上斷裂處的基因組DNA，精準(zhǔn)插入特定的DNA片段，這就是說(shuō)，假如能夠造成雙鏈斷裂，則可以誘發(fā)細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，方式為干預(yù)或融入新基因，另外還有一種修飾DNA的方法即將外源DNA的一個(gè)片段整合進(jìn)斷裂處。

基于CRISPR-associated RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶Cas9的基因組工程技術(shù)的最新進(jìn)展，讓我們有機(jī)會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物基因組系統(tǒng)功能進(jìn)行探究。就像文字糾錯(cuò)軟件，Cas9可以通過(guò)短的RNA字符引導(dǎo)到復(fù)雜基因組中的特定位置并修改錯(cuò)誤。這一系統(tǒng)使得內(nèi)源性基因組內(nèi)的DNA序列及其功能輸出可以所有有機(jī)體中輕松調(diào)控或編輯。這篇綜述描述了CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了存在的問(wèn)題以及未來(lái)的展望。

2.CRISPR的發(fā)展歷程

CRISPR的研究開(kāi)始于1987年，Nakata和同事在研究大腸桿菌中參與堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化的iap酶時(shí)，報(bào)告了iap基因下游29個(gè)nt重復(fù)序列并不像大多數(shù)重復(fù)的元素，采取串聯(lián)重復(fù)的形式，這29個(gè)nt重復(fù)被5個(gè)中間的32個(gè)nt非重復(fù)序列間隔。在接下來(lái)的10年里，隨著更多的微生物基因組被測(cè)序，從不同細(xì)菌的基因組中報(bào)告了更多的重復(fù)元素。Mojica和他的同事最終將間隔重復(fù)序列作為一個(gè)獨(dú)特的重復(fù)元素家族進(jìn)行了分類。2007年，研究表明，以增添或消除與噬菌體DNA相匹配的間隔區(qū)DNA這一方式，可以達(dá)到改變嗜熱鏈球菌對(duì)噬菌體的抵抗力的目的。2011年科學(xué)家著手研究與CRISPR相關(guān)的蛋白質(zhì)的各種功能，并且成功分離出了Cas9蛋白質(zhì)的CRISPR系統(tǒng)，這項(xiàng)研究解釋了間隔區(qū) DNA是如何在細(xì)菌免疫防御中發(fā)揮作用的。2013年，兩項(xiàng)研究同時(shí)展示了如何從嗜熱鏈球菌和膿鏈球菌中成功構(gòu)建II型CRISPR系統(tǒng)，達(dá)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組編輯目的。成熟crRNA-tracrRNA雜交體的異體表達(dá)，還有sgRNAs指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中的Cas9裂解，會(huì)刺激NHEJ基因組編輯。多個(gè)引導(dǎo)RNA也可以同時(shí)用于定位多個(gè)基因。自此，Cas9已被數(shù)千家實(shí)驗(yàn)室用于各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)的基因組編輯應(yīng)用。Cas9技術(shù)的迅速應(yīng)用也通過(guò)開(kāi)源分銷商和一些在線用戶論壇而大大加快。

從發(fā)現(xiàn)到2013年系統(tǒng)的建立，CRISPR在多種物種中已經(jīng)得到應(yīng)用，并且用于應(yīng)用的物種的數(shù)目還會(huì)繼續(xù)增加。

3.CRISPR的工作原理

盡管科學(xué)家到現(xiàn)在為止還沒(méi)有徹底發(fā)掘CRISPR/Cas9系統(tǒng)的具體的作用機(jī)制，但該系統(tǒng)的作用過(guò)程已基本清楚，即大致分為以下3個(gè)階段。

（1）當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒攜DNA進(jìn)入細(xì)胞，在一個(gè)細(xì)菌體內(nèi)，CRISPR會(huì)將病毒內(nèi)的 DNA抽出，然后以碎片的形式插入細(xì)菌 DNA中，其基因組裂解。

（2）Cas9與RNA的復(fù)合體切斷基因組中的雙鏈間隔序列，再整合至宿主基因組，其中較短的參入間隔序列轉(zhuǎn)錄，因而crRNAs產(chǎn)生。

（3）細(xì)胞有能力尋找斷鏈的DNA，并對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，是在Cas蛋白復(fù)合物的參與下，靶向干擾噬菌體的基因組序列。

4.CRISPR/Cas9技術(shù)在疾病研究中的應(yīng)用

4.1疾病模型的構(gòu)建

現(xiàn)如今，大多數(shù)遺傳病的研究是通過(guò)對(duì)患者的iPS細(xì)胞的研究來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間，同時(shí)也受到細(xì)胞是否可以得到和遺傳背景多樣性的限制?，F(xiàn)在研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了新的可以模擬阿爾茲海默癥的疾病表現(xiàn)的方法，正是利用CRISPR/Cas9技術(shù)，可以將一種阿爾茲海默癥的遺傳突變引入，在引入突變的位置和切割的位點(diǎn)之間，他們發(fā)現(xiàn)存在一段序列距離，而干細(xì)胞基因組的編輯就可以用到這種距離關(guān)系，因此，研究人員將干細(xì)胞基因組加以編輯，疾病基因就成功包含在干細(xì)胞中，再利用誘導(dǎo)技術(shù)，干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元細(xì)胞，這就起到了模擬疾病的作用。

4.2疾病的治療

目前，病毒治療的方法尚且缺乏，但是 CRISPR/Cas9系統(tǒng)給治療病毒提供了新的方法，當(dāng)DNA中出現(xiàn)了一個(gè)雙鏈斷裂時(shí)，就可以引入修復(fù)機(jī)制，其效果也十分顯著，比如糾正鐮狀細(xì)胞貧血突變基因，另外研究表明HIV病毒可以利用CRISPR/Cas9技術(shù)從體外培養(yǎng)的人體T細(xì)胞中有效清除。遺傳病防治中，血友病B非常適合基因治療和基因編輯技術(shù)，GuanY等人發(fā)現(xiàn)人的F9基因上的突變Y371D引起的血友病比突變Y371S更加嚴(yán)重，通過(guò)靶向這一基因位點(diǎn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，他們對(duì)小鼠加以治療，結(jié)果顯示，當(dāng)以腺病毒為載體時(shí)，基因編輯系統(tǒng)的糾正率較高，但是因?yàn)楦味拘允謬?yán)重，因此還要進(jìn)一步改進(jìn)。

人們還在研究如何利用CRISPR/Cas9技術(shù)治療癌癥，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，敲除相關(guān)基因會(huì)是一個(gè)十分有效的方法。在2015年，正是利用了CRISPR技術(shù)，人類關(guān)于癌癥的治療有了重大突破：利用一種慢病毒載體，研究者發(fā)現(xiàn) CRISPR系統(tǒng)會(huì)被doxycycline誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞的編輯也十分高效，而最關(guān)鍵的是癌基因 MCL-1被成功敲除，且包括體內(nèi)和體外兩種環(huán)境都得以實(shí)現(xiàn)。自此，腫瘤治療迎來(lái)了新的機(jī)遇，利用敲除癌基因這一技術(shù)，人們有機(jī)會(huì)在未來(lái)將其用于臨床治療。

5.Cas9的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

首先，CRISPR/Cas9技術(shù)的一大應(yīng)用就是可以用來(lái)對(duì)菌種進(jìn)行分類，得益于其重要特性，分類效果顯著提高;第二，CRISPR/Cas9系統(tǒng)會(huì)構(gòu)成特異性的單鏈切口，這與遺傳學(xué)中常常使用的人工核酸酶（ZFN或TALEN）有所不同，細(xì)胞的同源重組會(huì)被其有效激活，這就展現(xiàn)了與原有技術(shù)相比更有利的一面。第三，對(duì)CRISPR/Cas9進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)修飾途徑，達(dá)成較長(zhǎng)片段缺失的突變改造機(jī)制，這給長(zhǎng)期困擾人們的遺傳病的治療提供了新思路。

如果能充分利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其相關(guān)的基因編輯技術(shù)，很有可能使人們漸漸接受轉(zhuǎn)基因這一至今仍備受爭(zhēng)議的技術(shù)，轉(zhuǎn)基因的動(dòng)植物，比如一些重要的家畜，我們可以利用CRISPR/Cas9技術(shù)修飾它們的基因組，使其表現(xiàn)出更優(yōu)良的性狀，現(xiàn)在，研究人員已經(jīng)可以利用這一技術(shù)改良和提高綿羊的肌肉含量，還有家豬的瘦肉率等等。

6.存在的問(wèn)題

基因編輯引發(fā)了不少道德倫理方面的問(wèn)題，這是因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)不僅可以應(yīng)用于成人細(xì)胞上，還可以用在一些生物體的胚胎身上，包括我們?nèi)祟惐旧怼Ａ硗?，脫靶現(xiàn)象也是科學(xué)家正在研究和盡力控制的一個(gè)問(wèn)題。

何為脫靶？最開(kāi)始，人們普遍認(rèn)為 CRISPR/Cas9若想要切割一段DNA序列，就必須與DNA所攜帶的速查表能夠完全匹配，不過(guò)現(xiàn)如今已經(jīng)證實(shí)這一想法并不是正確的。與靶DNA相近的DNA序列有時(shí)也會(huì)被切割，但是這些序列卻含有與靶DNA不相同的堿基，且數(shù)目較大。研究者發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9這一脫靶現(xiàn)象會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生有利影響，使它們能夠免受病毒攻擊，因?yàn)镃RISPR/Cas9系統(tǒng)可以跟蹤不斷變異的病毒的進(jìn)化過(guò)程，但是對(duì)人類是無(wú)益的，一旦脫靶，人類的遺傳物質(zhì)就會(huì)被破壞，這將造成十分嚴(yán)重的影響。

7.展望

CRISPR/Cas9是一種較為安全的“剪刀”，會(huì)給臨床治療提供一個(gè)嶄新的思路，隨著 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展和普及，不僅可以用于科研的基因編輯領(lǐng)域，還可以用來(lái)治療疾病，減少食品安全問(wèn)題等等，在接下來(lái)的10年中，我們將看到這項(xiàng)技術(shù)在臨床上的應(yīng)用，尤其是適用于成年人身上的應(yīng)用，我們會(huì)看到很多臨床試驗(yàn)，甚至還有可能被批準(zhǔn)用于治療，正是因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)越性，很多新公司打算要將它商業(yè)化，也會(huì)有很多的投資者表現(xiàn)出對(duì)這些公司的興趣，但不得不考慮的是這項(xiàng)技術(shù)還應(yīng)該可以深度優(yōu)化，尤其是當(dāng)我們知道了關(guān)于人類的一些基因信息，CRISPR就提供了一種工具，這就會(huì)引起一系列道德倫理問(wèn)題，需要我們認(rèn)真對(duì)待。我們所有人都有責(zé)任去考慮這項(xiàng)技術(shù)背后的預(yù)期和非預(yù)期后果。

（作者單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)）