付昕怡，馬詩凝，張 偉，謝汶姍，陳烯琳，郭長青

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是慢性、退行性肌肉骨關(guān)節(jié)常見病，常因膝關(guān)節(jié)周圍軟組織受損[1]導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)力失常而發(fā)生軟骨退變甚至缺失。臨床研究顯示，針刀對膝骨關(guān)節(jié)炎具有良好的治療效果[2]，進(jìn)一步探究其作用機制對臨床應(yīng)用和治療思路有著重要意義?？v觀前期研究，多以電針為主要干預(yù)手段來研究Akt/mTOR信號通路及其對KOA的影響[3]。研究證實，電針可通過上調(diào)PI3K的表達(dá)，調(diào)控Akt/mTOR通路，促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，延緩去神經(jīng)骨骼肌衰老[4]。而Akt/mTOR通路的激活是如何促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞修復(fù)？深入研究發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR通路及其下游p70S6K和PHAS-1/4E-BP1通路的激活與骨骼肌纖維大小的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，并能促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，抑制肌肉萎縮[5]。而針刀是否能通過影響Akt/mTOR通路來促進(jìn)股直肌細(xì)胞的損傷修復(fù)進(jìn)而實現(xiàn)治療KOA？本研究以膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)模型兔為載體，進(jìn)行相應(yīng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6月齡新西蘭雄兔36只，體質(zhì)量約3.20 kg ，SPF級，購自北京科宇動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司(動物許可證號:SYXK 京 2016-0013)，動物均單籠飼養(yǎng)在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所大實驗動物室(SPF級)，室溫(20±2)℃，濕度40%～70%。

1.1.2 主要試劑與儀器 Trizol(美國Invitrogen公司)，氯仿、異丙醇、DEPC水、無水乙醇(均為北京化學(xué)試劑有限公司);瓊脂糖、PCR引物Rnasefree-dH2O、10×RNA Loading buffer(均為廣州復(fù)能基因技術(shù)有限公司);超凈工作臺(ABI9700型，蘇州凈化設(shè)備廠);熒光定量PCR儀電熱恒溫(7500型，ABI公司);鼓風(fēng)干燥箱(DH-101，北京利康科技發(fā)展有限公司);3 mL、5 mL玻璃勻漿器(海門弘潘實驗器材制造有限公司);低溫高速離心機、高速冷凍離心機(均為美國Sigma公司);FM100 制冰機(美國GRANT公司);-20℃/4℃冰箱(日本SANYO公司);-80℃冰箱(中國中科美菱公司);Biophotometer紫外分光光度計(Eppendorf公司);高壓滅菌鍋(上海予騰生物科技有限公司)。

1.2 分組及造模

將36只兔按體重編號，并按照隨機數(shù)字表法隨機分為正常組、模型組、針刀組、電針組，每組9只，其中1只用于造模后檢測是否造模成功。實驗期間嚴(yán)格按照動物倫理學(xué)要求對待動物。

參照改良的Videman左后腿伸直位固定制動法[6]造KOA模型。兩研究人員一人抓取兩前肢，一人抓取兩后肢，將兔子仰臥固定于兔臺。先將樹脂繃帶放于65～85℃熱水中，然后單手將兔左后腿的膝關(guān)節(jié)保持在伸直位(膝關(guān)節(jié)伸直180°，踝關(guān)節(jié)背屈60°)，另一手在膝關(guān)節(jié)和大腿根部分別纏繞一層脫脂棉，后將樹脂繃帶取出固定膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)，再用高分子繃帶從腹股溝逐層螺旋式包繞至趾尖，待定型后在外層纏繞防啃咬繃帶，并用醫(yī)用膠帶固定。為方便觀察造模后是否影響兔腿血供，將足趾末端裸露。每日檢查模型制動情況，松動脫落則加固，血供受限則半松解制動。制動6周，后各組隨機抽取1只處死，取關(guān)節(jié)軟骨觀察其形態(tài)學(xué)，若示造模成功則拆除模具。

1.3 干預(yù)方法

各組實驗動物按如下方法進(jìn)行干預(yù)治療。①正常組：常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處理。②模型組：造模后同期常規(guī)飼養(yǎng)，不予干預(yù)治療。③針刀組：拆除模具1周后予以針刀干預(yù),每周2次，治療4周。具體操作方法：股內(nèi)、外側(cè)肌腱、股直肌肌腱、股二頭肌肌腱的止點：依次松解各肌腱延續(xù)處，針刀刃與肌腱平行，刀柄垂直于皮膚刺入，向肌腱附著在骨連接的方向做“十字”疏通松解；另在膝關(guān)節(jié)周圍，沿肌肉肌腱的走行進(jìn)行循按觸摸，若遇硬結(jié)節(jié)或條索則用記號筆標(biāo)記，消毒后，針刀刃平行于條索結(jié)節(jié)所在的肌肉肌腱紋理走向，垂直刺入松解。操作完成后即拔出針刀，用棉球按壓針孔片刻止血。④電針組：拆除模具后第8天予以電針治療。參照《實驗針灸學(xué)》[7]結(jié)合模擬骨度取穴法，針刺血海、梁丘和內(nèi)、外膝眼穴，用韓式穴位神經(jīng)刺激儀分別連接梁丘與血海，內(nèi)膝眼與外膝眼進(jìn)行電針刺激治療(波形：疏密波，頻率：2/100 Hz，強度:3 mA，10 min/次，3次/周)，以實驗兔四肢微顫且無掙扎為度，共治療4周。

1.4 取材

各組實驗兔在干預(yù)結(jié)束1周后，以3%戊巴比妥溶液予以耳緣靜脈注射麻醉(30 mg/kg)，待完全麻醉后將兔左后肢剖皮，逐層分離暴露整個膝關(guān)節(jié)，于膝關(guān)節(jié)髕骨上2 cm處取一塊0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肌肉，迅速放入液氮罐。

1.5 指標(biāo)檢測

Real-time PCR法檢測Akt、mTOR、4EBP1和p70s6k的基因表達(dá):將冷凍的肌肉組織研磨后，采用Trizol法提取各組樣本組織中的總RNA，電泳檢測RNA質(zhì)量，并用紫外透射光測定RNA濃度。根據(jù)濃度取1 μL總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42℃ 60 min，85℃ 10 min將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列見表1。

將配置好的Real-Time PCR反應(yīng)液(20 μL體系)混合均勻后離心，迅速置入PCR儀中，擴增程序為：95℃預(yù)變性10 min；變性95℃ 15 s、 退火58℃ 35 s、95℃ 15 s，以上擴增循環(huán)40次;延伸55℃ 30 s、95℃ 15 s。獲得的各樣本待測基因的Ct值，以GAPDH的基因作為內(nèi)參校正，用相對定量2-△△Ct法進(jìn)行分析處理，即相對mRNA表達(dá)量=2-△△Ct。

表1 引物和探針序列表

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組 Akt、mTOR基因表達(dá)比較

實時熒光定量PCR法檢測Akt、mTOR的基因表達(dá)，模型組均低于正常組(P<0.01);電針干預(yù)后，電針組與模型組相比：mTOR的基因表達(dá)電針組高于模型組(P<0.01)，但Akt的基因表達(dá)電針組與模型組無顯著差異(P>0.05)；針刀干預(yù)后，針刀組與模型組相比：Akt、mTOR的基因表達(dá)針刀組均高于模型組(P<0.05或P<0.01)；見表2、封三彩圖1、圖2。

表2 各組兔左側(cè)股直肌Akt、mTOR的mRNA表達(dá)水平(即與GAPDH的比值)

注:與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01;與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 各組4EBP1、p70s6k基因表達(dá)比較

實時熒光定量PCR法檢測p70s6k的基因表達(dá)，模型組低于正常組(P<0.05); 電針干預(yù)后，電針組與模型組相比： p70s6k的基因表達(dá)電針組高于模型組 (P<0.01);針刀干預(yù)后，針刀組與模型組相比：p70s6k的基因表達(dá)針刀組高于模型組(P<0.01)；4EBP1的基因表達(dá)，4組之間無顯著差異(P>0.05)。其他組間比較均無顯著差異。見表3、封三彩圖1、圖2。

注:與正常組相比，**P<0.01;與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。圖2 各組實驗兔股直肌Akt、mTOR、4EBP1和p70s6k的mRNA表達(dá)比較

組別n4EBP1p70s6k正常組81.00±0.001.00±0.00模型組80.88±0.800.78±0.07?針刀組80.92±0.080.85±0.07△△電針組80.90±0.090.86±0.09△△

注:與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01;與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

KOA屬中醫(yī)學(xué)“膝痹”范疇[8]，《張氏醫(yī)通》云:“膝為筋之府, 膝痛無有不因肝腎虛者, 虛則風(fēng)寒濕氣襲之?！薄端貑枴け哉摗吩? “痹在骨則重，在脈血凝而不流，在筋則屈不伸”。以上論述指出本病是以肝腎虧虛、風(fēng)寒濕邪入侵淤阻經(jīng)脈為病機，以關(guān)節(jié)疼痛、筋骨屈伸不利為主癥的疾病[9]。從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)角度講，針刺治療本病歷史悠久，其相關(guān)記載可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》[10]，而電針是在特定穴位針刺得氣后，接以微量脈沖電流，針與電刺激相結(jié)合的治療方法[11]。電針可有效促進(jìn)血液循環(huán)，提高機體免疫功能，辨證分經(jīng)取穴以平衡陰陽，暢達(dá)血氣，疏通經(jīng)絡(luò)使之通則不痛；更可根據(jù)疾病性質(zhì)選擇不同波形頻率帶動局部肌肉有節(jié)律的收縮恢復(fù)肌肉功能；相較于單純針刺，電針可增強刺激量，防止耐受，在改善局部循環(huán)代謝和消炎止痛方面有著獨特優(yōu)勢[12]。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度講，“筋”對膝骨周圍軟組織如肌肉、肌腱、韌帶、筋膜等進(jìn)行了高度概括[13]。軟組織損傷發(fā)生在膝骨關(guān)節(jié)炎早期，貫穿疾病發(fā)展始終，陳玉佩[14]證實，在骨骼肌質(zhì)量與力量的恢復(fù)中，電針可通過促進(jìn)mTOR的表達(dá)、激活肌衛(wèi)星細(xì)胞、協(xié)調(diào)蛋白合成與分解發(fā)揮顯著治療作用。針刀把中醫(yī)的針與西醫(yī)的手術(shù)刀相結(jié)合，在解除關(guān)節(jié)異常應(yīng)力、減張減壓等方面有著獨特的優(yōu)勢，已證實針刀可通過調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白表達(dá)[15]、改變生物力學(xué)[16]等對KOA有明顯療效。

實驗研究從膝骨關(guān)節(jié)炎肌肉生物力學(xué)的角度進(jìn)行了深入的探索[17]。研究表明股四頭肌作為膝骨周圍唯一的伸膝肌群，在吸收平衡荷重、防止內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)中發(fā)揮動力性作用，膝關(guān)節(jié)疼痛的存在與股四頭肌力量呈負(fù)相關(guān)，因此股四頭肌的肌力下降是KOA癥狀加重和功能退化的一個重要危險因素[18]。而KOA患者的廢用性肌萎縮和肌力減退是由多要素共同影響，前期研究已從分子生物學(xué)角度驗證Akt/mTOR通路及其下游p70S6K和PHAS-1/4E-BP1通路的激活與骨骼肌纖維大小、蛋白質(zhì)合成等密切相關(guān)[19]。且本團隊前期以KOA模型兔為載體的研究發(fā)現(xiàn)，針刀干預(yù)對膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞FAK-PI3K-AKT通路有激活作用[20]。因此本次研究，筆者延用改良的Videman左后腿伸直位模型制作方法，進(jìn)一步探索針刀干預(yù)對股直肌細(xì)胞Akt/mTOR通路的作用關(guān)系，為推進(jìn)臨床更廣泛的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

mTOR即雷帕霉素的絲氨酸激酶哺乳動物靶點，通過控制肌源性基因的表達(dá)，是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖和能量代謝的關(guān)鍵因子，對衛(wèi)星細(xì)胞功能和骨骼肌再生至關(guān)重要[21]。mTOR上游激酶之一即為Akt(絲氨酸蛋白激酶)，可直接或間接磷酸化mTOR，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、對抗細(xì)胞凋亡[22]。研究表明，抑制mTOR信號傳導(dǎo)到其下游因子如4E-BP1和p70s6k，足以減少肌肉生長導(dǎo)致肌肉萎縮[23]。在本次實驗中，通過對比分析Akt和mTOR的基因表達(dá)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)模型組顯著低于正常組，說明Akt、mTOR信號被抑制，證實了KOA兔模型的建立。經(jīng)過4周干預(yù)治療后，電針與模型組相比，mTOR的基因表達(dá)顯著升高，而Akt的基因表達(dá)僅有上升趨勢，無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是針刀與電針對股直肌起修復(fù)作用的不同之處；針刀組與模型組相比，Akt的基因表達(dá)顯著上升，同時mTOR的基因表達(dá)也明顯上調(diào)，說明針刀治療可啟動Akt/mTOR通路，并增加蛋白合成，對抗肌肉質(zhì)量下降，抑制股直肌萎縮治療KOA，與相關(guān)試驗結(jié)論一致[24]。

p70s6k是mTOR下游靶核糖體蛋白S6激酶1，4EBP1是真核起始因子結(jié)合蛋白，二者是mTOR翻譯的最佳研究靶點[25]。研究顯示p70s6k通過多種機制調(diào)控蛋白合成的多個步驟，如p70s6k在Ser-422位點磷酸化4EBP1來控制mRNA的翻譯起始，增加核糖體的生物生成，從而保持蛋白質(zhì)質(zhì)量和肌肉力量[26]。可見4EBP1的上游信號通路較多，影響復(fù)雜，這也從側(cè)面解釋了本實驗結(jié)果中各組間4EBP1的mRNA表達(dá)沒有差異的原因。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)雖然4EBP1和p70s6k在mRNA翻譯中發(fā)揮著重要的作用[27]，但翻譯過程中可能存在其他未被鑒定的mTOR靶點，其中一些反式作用因子被認(rèn)為是抑制TOP mRNA翻譯的調(diào)控因子(如LARP1)，但其機制和與mTOR活性的關(guān)系仍不清楚。此外，研究指出，mTOR/p70s6k通路可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞系的生長、增殖，包括成纖維細(xì)胞、血管平滑肌和上皮細(xì)胞，通路的活性升高，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[28]。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)干預(yù)治療后，針刀組和電針組股直肌p70s6k的基因表達(dá)均較模型組有顯著上調(diào)。一方面說明，針刀和電針治療均可在激活A(yù)kt/mTOR通路的同時，也上調(diào)p70s6k的基因表達(dá)，共同參與蛋白合成的調(diào)控，改善股直肌力量，對抗肌肉萎縮；但另一方面，成纖維細(xì)胞的增殖可能使萎縮肌纖維化、瘢痕等，不利于肌細(xì)胞的恢復(fù)。因此，針刀干預(yù)對p70s6k和4EBP1的調(diào)控和其對股直肌細(xì)胞損傷修復(fù)的影響還需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，針刀和電針干預(yù)可通過有效激活mTOR、p70s6k的基因表達(dá)，促進(jìn)損傷或萎縮的骨骼肌細(xì)胞得以恢復(fù)。此外，針刀還可激活A(yù)kt，進(jìn)而使mTOR的基因表達(dá)上調(diào)，實現(xiàn)對骨骼肌損傷的協(xié)同修復(fù)作用，這可能是針刀與電針修復(fù)股直肌機制的差異所在，有待后續(xù)的深入研究和探索。