王玉全，李程程，蘇路路，管博文，盧延華，關(guān)菲菲，榮 利，王小春，孟愛民*，樊飛躍

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021； 2.北京市化工職業(yè)病防治院，北京市職業(yè)病防治研究院，北京 100093)

醫(yī)療診斷和治療中電離輻射(ionizing radiation，IR)手段應(yīng)用增多、核能生產(chǎn)、太空活動(dòng)增加，給人類帶來巨大的利益與幫助。同時(shí)，人類對(duì)IR暴露機(jī)會(huì)增多，可能對(duì)人類健康產(chǎn)生損害[1-3]。機(jī)體的造血系統(tǒng)對(duì)IR最為敏感，短期的高劑量輻射暴露和長(zhǎng)期的低劑量輻射暴露均能引起造血系統(tǒng)輻射損傷，IR對(duì)造血系統(tǒng)的損傷主要表現(xiàn)為兩方面：急性骨髓抑制和長(zhǎng)期骨髓抑制。急性骨髓抑制臨床上表現(xiàn)為外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，容易引發(fā)急性感染或死亡，主要是由IR引起造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)和少量造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的凋亡[4]，可以給予造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hematopoietic growth factors，HGFs)治療以緩解癥狀[5]，但是也會(huì)影響HSCs功能，加重HSCs功能損傷[6]；長(zhǎng)期骨髓抑制臨床表現(xiàn)為再生障礙貧血，甚至誘發(fā)白血病，是IR遠(yuǎn)期輻射損傷的主要表現(xiàn)，同時(shí)也是臨床上進(jìn)行腫瘤放化療治療時(shí)出現(xiàn)的嚴(yán)重毒副作用之一[4]，主要是由于IR引起大量HSCs凋亡、衰老，導(dǎo)致骨髓衰竭[7-8]。長(zhǎng)期骨髓抑制具有遲發(fā)性，臨床治療上容易被忽視，目前尚無有效治療手段，死亡率較高[1]。由此，造血系統(tǒng)輻射損傷防護(hù)與治療方法的研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

IR誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是造血細(xì)胞輻射損傷的重要機(jī)制，IR誘導(dǎo)的造血細(xì)胞及其微環(huán)境中活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，促進(jìn)HPCs、HSCs凋亡，HSCs分化異常導(dǎo)致造血細(xì)胞數(shù)量減少，誘導(dǎo)HSCs衰老導(dǎo)致其自我更新能力下降，損傷骨髓基質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致造血干細(xì)胞龕穩(wěn)態(tài)紊亂，最終導(dǎo)致骨髓抑制，骨髓衰竭[8-10]。生理情況下，機(jī)體細(xì)胞存在有效的ROS清除機(jī)制。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞族3(forkhead box transcription factor O 3，F(xiàn)OXO3/FOXO3A)在氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)上發(fā)揮重要作用，ROS可以誘導(dǎo)FOXO3A轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)抗氧化酶系基因的表達(dá)上調(diào)，清除ROS，減輕氧化應(yīng)激損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)FOXO3A轉(zhuǎn)錄因子在HSCs穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)上發(fā)揮重要作用[11]，F(xiàn)OXO3A基因敲除小鼠表現(xiàn)HSCs自我更新能力的喪失和過早衰竭[12]。同時(shí)，F(xiàn)OXO3A可以通過調(diào)節(jié)毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變(ataxia telangiectasia mutated，ATM)基因和抗氧化酶系的表達(dá)調(diào)節(jié)HSCs中ROS水平，維持HSCs功能[13]。范科尼貧血蛋白2(Fanconi anemia protein 2，F(xiàn)ancd2)基因介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路與FOXO3A基因介導(dǎo)的應(yīng)激調(diào)節(jié)通路在HSCs維持上存在功能性協(xié)同調(diào)節(jié)作用[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)全身照射(total body irradiation，TBI)小鼠給以抗氧化劑白藜蘆醇治療，可以抑制輻射誘導(dǎo)骨髓HSCs ROS合成增加，阻止輻射誘導(dǎo)的HSCs衰老，緩解輻射誘導(dǎo)的長(zhǎng)期損傷[13]。而白藜蘆醇對(duì)HSCs輻射損傷的緩解作用可能是誘導(dǎo)去乙?；窼irt1激活FOXO3A調(diào)節(jié)[15-16]。這提示FOXO3A在抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)緩解造血細(xì)胞輻射損傷中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究FOXO3A在造血細(xì)胞輻射損傷中的作用及機(jī)制可以為造血系統(tǒng)輻射損傷的診斷治療提供資料。由此我們擬利用FOXO3A基因敲除小鼠模型來探討FOXO3A對(duì)全身照射小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

FVB品系SPF級(jí)FOXO3A基因敲除小鼠(FOXO3A-/-)及野生型小鼠(FOXO3A+/+，WT)，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK (京) 2015-0035]中自行繁育鑒定[17]，雄性，體重25～30 g，8～12周齡。實(shí)驗(yàn)方案通過中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)審批，IACUC號(hào)為：MAM17002。實(shí)驗(yàn)過程中，在不影響實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則關(guān)注實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。

1.2 主要試劑與儀器

EDTA-K3購(gòu)自Sigma公司；甲基纖維素培養(yǎng)基購(gòu)自Stem cell Technologies公司；流式抗體CD4、CD8、B220、Ter119、Gr-1、CD11b、streptavidin、scal-1、ckit均購(gòu)自BD Bioscience和eBioscience公司。X-RAD 225高能量生物學(xué)X射線輻照儀(美國(guó))；FACS AriaTMⅡ流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)；DX120全自動(dòng)血液分析儀(ABX Pentra)；CKX41倒置顯微鏡(奧林帕斯)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠分組和照射

小鼠均分為四組(每組3～6只)：野生型小鼠對(duì)照組(WT組)，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠對(duì)照組(FOXO3A-/-組)，野生型小鼠照射組(WT+IR)，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠照射組(FOXO3A-/-+IR)，對(duì)照組接受假照射，照射組接受4 Gy X射線TBI，照射劑量率為0.9 Gy/min。接受TBI的小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，每天觀察記錄體重變化。

1.3.2 小鼠外周血常規(guī)檢測(cè)

小鼠TBI后14 d小鼠眼眶靜脈叢取血，抗凝管收集外周血，全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定外周血中白細(xì)胞數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)和血小板(PLT)等指標(biāo)。

1.3.3 小鼠胸腺、脾指數(shù)測(cè)定

小鼠TBI后14 d稱重安樂死，取胸腺、脾并稱重，計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器(mg)/體重(g)。

1.3.4 骨髓細(xì)胞有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

小鼠TBI后14 d，無菌分離小鼠脛骨和股骨，剔除肌肉，注射器沖洗骨髓細(xì)胞，過濾后采用KOVA一次性計(jì)數(shù)板，顯微鏡下人工骨髓計(jì)數(shù)。最終細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以每只小鼠×107個(gè)細(xì)胞表示。

1.3.5 小鼠骨髓細(xì)胞表型分析

小鼠TBI后14 d，收集骨髓細(xì)胞至流式管，加入Biotin標(biāo)記的混合一抗抗體(CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、CD11b)，孵育后洗滌并重懸細(xì)胞，加入混合二抗抗體streptavidin(percp標(biāo)記)、scal-1(PE標(biāo)記)、ckit(APC標(biāo)記)，孵育后洗滌并重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)HPCs(Lin-c-kit+Sca1-or LSK- cells)，HSCs(Lin-c-kit+Sca1+or LSK+cells)[18]在骨髓中所占的比例。

1.3.6 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位測(cè)定[6]

小鼠TBI后14 d安樂死，分離骨髓細(xì)胞并分組混合，每組接種40 000個(gè)細(xì)胞到分裝好的2 mL 3534培養(yǎng)基中。按操作說明進(jìn)行后續(xù)接種。接種細(xì)胞培養(yǎng)5～7 d后于倒置顯微鏡下讀取粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位(colony forming unit-granulocyte and macrophage，CFU-GM)數(shù)，細(xì)胞數(shù)≥50為陽(yáng)性集落。結(jié)果換算為每105個(gè)BMNCs中CFU-GM的個(gè)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 FOXO3A對(duì)受照小鼠外周血計(jì)數(shù)的影響

TBI小鼠外周血計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1所示：生理情況下，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠與WT小鼠，白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例均未見明顯差異(P>0.05)。接受4 Gy TBI后，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠和WT小鼠白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)下降，血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)與FOXO3A-/-對(duì)照組小鼠和WT對(duì)照組小鼠相比均降低(P<0.05); 淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例仍未見明顯差異(P>0.05)。接受4 Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠間相比，白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白含量、血小板含量、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例均未見明顯差異(P>0.05)。結(jié)果表明：生理情況下，小鼠FOXO3A基因敲除不影響其外周血計(jì)數(shù)。小鼠接受4 Gy X射線TBI后14 d出現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)下降，血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)降低；FOXO3A基因敲除小鼠受照后外周血改變與野生型小鼠沒有差異。這提示FOXO3A基因敲除不會(huì)影響受照小鼠外周血計(jì)數(shù)改變。

注：與WT組相比，aP<0.05；與FOXO3A-/-組相比，bP<0.05。圖1 FOXO3A基因?qū)κ苷招∈笸庵苎?jì)數(shù)的影響Note. Compared with the WT group, aP<0.05. Compared with the FOXO3A-/- group, bP<0.05.Figure 1 Effect of FOXO3A on peripheral blood cell counts of the irradiated mice

2.2 FOXO3A對(duì)受照小鼠的臟器指數(shù)的影響

TBI小鼠體重及臟器指數(shù)結(jié)果如圖2所示：生理情況下，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠與WT小鼠，體重、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均未見明顯差異(P>0.05)。接受4 Gy TBI后，WT組小鼠體重與WT對(duì)照組小鼠相比降低(P<0.01)，F(xiàn)OXO3A-/-組小鼠體重與FOXO3A-/-對(duì)照組小鼠相比未見明顯差異(P>0.05)；WT組和FOXO3A-/-組小鼠胸腺指數(shù)與WT對(duì)照組小鼠和FOXO3A-/-對(duì)照組小鼠相比均未見明顯差異(P<0.05)，而脾指數(shù)均顯著下降(P<0.01),但兩者下降幅度上未見明顯差異(P>0.05)。結(jié)果表明：生理情況下，F(xiàn)OXO3A基因敲除不影響小鼠體重及臟器指數(shù)。FVB品系小鼠接受4 Gy X射線TBI后14 d，小鼠體重和脾指數(shù)降低，F(xiàn)OXO3A基因敲除小鼠受照后體重和脾指數(shù)下降與野生型小鼠相比未見明顯差異。未發(fā)現(xiàn)FOXO3A基因敲除影響受照小鼠體重及臟器指數(shù)變化。

注：與WT組相比，aP<0.05；與FOXO3A-/-組相比，bP<0.05；與WT+IR組相比，cP<0.05。圖2 FOXO3A基因?qū)κ苷招∈篌w重及臟器指數(shù)的影響Note. Compared with the WT group, aP<0.05. Compared with the FOXO3A-/- group, bP<0.05. Compared with the WT+IR group, cP<0.05.Figure 2 Effect of FOXO3A on body weight and organ index of the irradiated mice

2.3 FOXO3A對(duì)受照小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生理情況下，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)低于WT小鼠(P<0.05)。接受4 Gy TBI后，WT小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)與WT對(duì)照組小鼠相比降低(P<0.01);FOXO3A-/-小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)與FOXO3A-/-對(duì)照組小鼠相比未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P>0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)受4 Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)下降率為9%，低于WT小鼠51%。結(jié)果表明：生理情況下，小鼠FOXO3A基因敲除會(huì)降低小鼠體內(nèi)骨髓有核細(xì)胞數(shù)；接受4 Gy X射線TBI后14 d，受照小鼠出現(xiàn)骨髓有核細(xì)胞數(shù)目降低，F(xiàn)OXO3A基因敲除減輕受照小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)目降低。這提示FOXO3A基因敲除對(duì)小鼠骨髓有核細(xì)胞具有一定損傷作用，同時(shí)又能抑制輻射誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞數(shù)目降低。

注：與WT組相比，aP<0.05。圖3 FOXO3A基因?qū)κ苷招∈蠊撬杓?xì)胞計(jì)數(shù)的影響Note. Compared with the WT group, aP<0.05.Figure 3 Effect of FOXO3A on bone marrow cell counts of the irradiated mice

2.4 FOXO3A對(duì)受照小鼠骨髓細(xì)胞分型的影響

TBI小鼠骨髓細(xì)胞分型結(jié)果如圖4所示：生理情況下，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠HPCs比例高于WT小鼠(P<0.05)，HSCs比例和數(shù)目、HPCs數(shù)目均未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P>0.05)。接受4 Gy TBI后，WT小鼠HSCs數(shù)目與WT對(duì)照組小鼠相比降低(P<0.01)，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠HSCs比例和數(shù)目、HPCs比例和數(shù)目與FOXO3A-/-對(duì)照組小鼠相比均降低(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，接受4 Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠HSCs/HPCs比例下降率均顯著高于WT小鼠。上述結(jié)果表明：生理情況下，F(xiàn)OXO3A基因敲除小鼠體內(nèi)HPCs比例升高；接受4 Gy X射線TBI后14 d，F(xiàn)OXO3A-/-受照小鼠出現(xiàn)明顯HSCs、HPCs比例和數(shù)目下降，F(xiàn)OXO3A基因敲除加重受照小鼠HSCs、HPCs比例下降。這提示FOXO3A基因敲除能夠影響小鼠體內(nèi)造血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，同時(shí)又能加重電離輻射誘導(dǎo)小鼠HSCs、HPCs損傷。

注：流式圖中的A、B、C、D分別代表流式細(xì)胞儀分析時(shí)門的設(shè)置。柱形圖中，與WT組相比，aP<0.05；與FOXO3A-/-組相比，bP<0.05；與WT+IR組相比，cP<0.05。圖4 FOXO3A對(duì)受照小鼠的骨髓細(xì)胞分型的影響Note. A, B, C, and D in the flow chart represents the gating strategy as analyzed by the flow cytometry, respectively. In the column charts, compared with the WT group, aP<0.05, compared with the FOXO3A-/- group, bP<0.05, and compared with the WT+IR group, cP<0.05.Figure 4 Effect of FOXO3A on bone marrow cell typing of the irradiated mice

2.5 FOXO3A對(duì)受照小鼠造血祖細(xì)胞增殖功能的影響

TBI小鼠CFU-GM實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生理情況下，F(xiàn)OXO3A-/-小鼠與WT小鼠CFU-GM形成數(shù)未見明顯差異(P>0.05)。接受4 Gy TBI后，WT小鼠CFU-GM形成數(shù)與WT對(duì)照組小鼠相比降低(P<0.001)；FOXO3A-/-小鼠CFU-GM形成數(shù)與FOXO3A-/-對(duì)照組小鼠相比未見明顯差異(P>0.05)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，接受4 Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠CFU-GM形成數(shù)高于WT小鼠(P<0.001)。結(jié)果表明：生理情況下，小鼠FOXO3A基因敲除不影響HPCs CFU-GM形成能力。小鼠接受4 Gy X射線TBI后14 d，F(xiàn)OXO3A基因敲除抑制受照小鼠CFU-GM形成降低。這提示FOXO3A基因敲除抑制受照小鼠造血祖細(xì)胞增殖功能減退。

注：與WT組相比，aP<0.05；與WT+IR組相比，cP<0.05。圖5 FOXO3A對(duì)受照小鼠造血祖細(xì)胞增殖功能的影響Note. Compared with the WT group, aP<0.05. Compared with the WT+IR group, cP<0.05.Figure 5 Effect of FOXO3A on hematopoietic progenitor cell proliferation of the irradiated mice

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：生理情況下，F(xiàn)OXO3A基因敲除會(huì)降低小鼠體內(nèi)骨髓有核細(xì)胞數(shù)，骨髓HPCs比例升高。骨髓有核細(xì)胞數(shù)降低可能是由于FOXO3A基因敲除導(dǎo)致的造血細(xì)胞損傷性改變。HPCs比例升高可能是由于FOXO3A基因敲除影響了HSCs維持靜止和自我更新的能力[12]，導(dǎo)致HSCs數(shù)目下降，出現(xiàn)HPCs比例相對(duì)升高；也可能FOXO3A基因敲除加速HSCs分化，導(dǎo)致HPCs數(shù)目增多，這些提示了FOXO3A基因?qū)SCs功能維持的作用。接受4 Gy X射線照射后14 d，F(xiàn)OXO3A基因敲除抑制輻射誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞數(shù)目降低和造血祖細(xì)胞CFU-GM形成能力減退。FOXO3A基因敲除減輕輻射誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞數(shù)目降低，可能與FOXO3A基因敲除小鼠未照射時(shí)骨髓細(xì)胞水平較低有關(guān)，也有可能是因?yàn)镕OXO3A基因敲除影響了HSCs穩(wěn)態(tài)維持能力，促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖。FOXO3A基因敲除抑制輻射誘導(dǎo)的造血祖細(xì)胞CFU-GM形成能力減退，可能是由于FOXO3A基因敲除阻斷電離輻射誘導(dǎo)的HPCs增殖抑制，促進(jìn)HPCs的增殖。上述結(jié)果中受照后FOXO3A基因敲除小鼠HPCs比例明顯下降，反映HPCs增殖功能的CFU-GM沒有明顯改變，提示損傷較重的可能不是粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而是巨核系細(xì)胞和紅系細(xì)胞[19]，與外周血計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)一致。最為明顯的是FOXO3A基因敲除加重受照小鼠HSCs、HPCs比例和數(shù)目下降，表明了FOXO3A基因敲除增加了HSCs和HPCs的輻射敏感性。

綜上，生理情況下，F(xiàn)OXO3A基因敲除會(huì)降低小鼠體內(nèi)骨髓有核細(xì)胞數(shù)，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)HPCs比例升高；這說明生理情況下，F(xiàn)OXO3A基因敲除會(huì)影響小鼠造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的維持，導(dǎo)致造血細(xì)胞損傷性改變。受到照射后，F(xiàn)OXO3A基因敲除小鼠HSCs和HPCs損傷最為明顯，提示了FOXO3A基因?qū)SCs和HPCs輻射保護(hù)中具有重要作用。

FOXO3A作為機(jī)體抗氧化應(yīng)激和DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路中重要的調(diào)節(jié)分子，F(xiàn)OXO3A基因敲除可能損傷造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)維持能力和加重造血系統(tǒng)輻射損傷。我們結(jié)果顯示全身照射后小鼠HSCs、HPCs變化符合預(yù)期。FOXO3A是否能夠成為造血細(xì)胞輻射損傷保護(hù)的靶點(diǎn)還有待于進(jìn)一步研究。

致謝：感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所張連峰教授課題組老師在實(shí)驗(yàn)中給予的指導(dǎo)幫助。