郭彤彤，宋 丹，張 鑫

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800)

近年來，超重和肥胖逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，并已成為全球經(jīng)濟(jì)和健康的負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2016年世界上近40%的成年人超重，約有13%的人肥胖，該比例在過去40年中增加了兩倍。肥胖是能量破壞的結(jié)果，也是許多慢性疾病的重要危險(xiǎn)因素，包括非酒精性脂肪性肝病，II型糖尿病和心血管疾病[2]。因此，肥胖的預(yù)防和治療已成為重要的公共衛(wèi)生問題，減肥藥的開發(fā)亦勢在必行。

人體腸道中的微生物多達(dá)1014種微生物，比人類細(xì)胞總數(shù)高10倍，已知的細(xì)菌種類至少1000種[3]。這種復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)在人類健康中發(fā)揮著重要作用[4]。研究表明，接受肥胖人類糞便微生物的無菌小鼠比接受正常體重人類糞便微生物的小鼠的體重顯著增加[5]。腸道微生物菌群與肥胖之間的關(guān)系引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。

飲食對(duì)腸道微生物的組成，多樣性和豐富度有顯著影響[6]。改變腸道微生物群或補(bǔ)充特定益生元或益生菌可減輕肥胖或糖尿病嚙齒動(dòng)物模型中的肥胖和代謝功能障礙[7]。茶在世界各地廣泛消費(fèi)，其推定的活性成分歸因于多酚。烏龍茶多酚(Oolong tea polyphenols, OTP)可以為有益微生物提供有利生長條件，并改變腸道微生物群的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮類似的益生元功能[8]。OTP中的主要酚類化合物是兒茶素，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)，表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate, ECG)，表沒食子兒茶素(Epigallocatechin, EGC)和表兒茶素(Epicatechin, EC)，它們是茶中最重要的生物活性物質(zhì)[9]。作為一種獨(dú)特的甲基化形式的EGCG，表沒食子兒茶素3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯(Epigallocatechin 3-O-(3-O-methyl)gallate, EGCG3”Me)已顯示出有效的抗肥胖活性[10]。此外，EGCG3”Me有益于腸道菌群系統(tǒng)的穩(wěn)定性，特別是在高脂肪飲食(High fat diet, HFD)誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中引發(fā)的微生物失衡[11]。然而，關(guān)于OTP與腸道微生物群之間相互作用的研究鮮見報(bào)道。在本研究采用高脂日糧飼養(yǎng)建立高脂肥胖小鼠模型，應(yīng)用16S rDNA測序技術(shù)，探究OTP對(duì)HFD小鼠腸道菌群的影響，以期為OTP的深入研究及減肥產(chǎn)品的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑、儀器與動(dòng)物

1.1.1 試驗(yàn)試劑

烏龍茶多酚(純度98%)，實(shí)驗(yàn)室自制；TC、TG、HDL-C和LDL-C試劑盒，南京建成生物工程研究所；油紅O染色試劑，美國Sigma公司；氯化鈉、異丙醇、無水乙醇、多聚甲醛購于國藥集團(tuán)有限公司；DNA提取試劑盒(D4015-02)，美國Omega Bio-tek公司；DL 2000 DNA Maker(3427A)，日本寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖(RA1011-Agarose LE-100G)，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

AY-120型電子精密天平(日本Shimadzu公司)；無菌硬質(zhì)糞便收集袋(上海申安醫(yī)療器械廠)；BioTekSYNERGY H1四光柵全功能酶標(biāo)儀(美國BioTek儀器有限公司)；5418R小型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；5804R高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Leica CM1950冷凍切片機(jī)(德國Leica公司)；Leica CM2245組織切片機(jī)(德國Leica公司)；MX-S/MX-F型旋渦混合器(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司)；NanoDrop ND-2000型核酸定量儀(美國Thermo公司)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

6周齡、雄性C57BL/6J小鼠(體重為20±2 g)，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)于寧波大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，試驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙江)2013-0191，溫度控制在22±2℃，濕度控制在55%±5%，自由攝食和飲水，單籠飼養(yǎng)，12 h光照和12 h黑暗交替。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為3組，低脂飲食組(LFD組)，高脂飲食組(HFD組)，高脂飲食-烏龍茶多酚組(HFD-OTP組，0.1% OTP)，每組8只小鼠。他們的體重，食物和水?dāng)z入量每周記錄兩次，并且每周計(jì)算他們的平均值。在0周(OTP-0)，2周(OTP-2)，4周(OTP-4)和8周(OTP-8)對(duì)HFD-OTP組收集糞便樣品用于16S rDNA測序分析。所有給藥連續(xù)進(jìn)行8周，然后在戊巴比妥麻醉下進(jìn)行剖腹手術(shù)。分離肝臟和附睪脂肪并立即稱重，并立即將所有樣品快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃直至使用。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測

小鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的測試盒進(jìn)行檢測，測定方法嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行測定。

1.2.3 肝臟組織病理學(xué)檢測

將經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定24 h后的肝臟組織，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行油紅O染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性程度。

1.2.4 糞便細(xì)菌DNA提取與16S rDNA測序分析

參考文獻(xiàn)中報(bào)道的方法加以改進(jìn)用于提取糞便中細(xì)菌的總DNA[12]。采用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit (D4015-02，Omega，美國)，按照說明書進(jìn)行。采用NanoDrop system檢測DNA濃度與純度。

參照文獻(xiàn)[13]，取用10 ng的DNA模板，依16S rDNA V3-V4區(qū)序列，用帶Barcode的特異引物(引物序列為314F5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’和805R 5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，將構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，運(yùn)用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。

將各組的樣品數(shù)據(jù)從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出來，截去Barcode與引物序列之后，采用FLASH對(duì)雙端序列進(jìn)行拼接，過濾成高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)。進(jìn)行Tags截取與長度過濾，處理去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。使用Verseach(Version 2.3.4)軟件過濾嵌合序列，將具有97%一致性序列聚類成為操作單元(OTUs)?；跇悠稯UT結(jié)果，使用QIIME軟件(Version 1.8.0)，計(jì)算用于分析樣品物種多樣性和豐度的指數(shù)包括Chao1，Shannon和Simpson。同時(shí)選取OTUs代表性序列，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行物種注釋且獲得分類學(xué)信息，在門(phylum)與屬(genus)分類水平上，統(tǒng)計(jì)樣本的群落結(jié)構(gòu)組成并進(jìn)行分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料進(jìn)行Duncan’s多重比較檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTP處理可減輕體重，降低脂肪量，減少肝臟脂肪變性

在第8周試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，比較各組小鼠平均體重，結(jié)果如圖1，發(fā)現(xiàn)HFD組和HFD-OTP組小鼠體重與LFD組相比均具有顯著性差異(P<0.05)；HFD-OTP組平均體重顯著小于HFD組(P<0.05)，這表明OTP顯著緩解了肥胖小鼠的體重增加。

鑒于在8周飲食干預(yù)期結(jié)束時(shí)HFD-OTP組的體重增加比HFD組低4.0 g，我們隨后檢查了不同實(shí)驗(yàn)組中脂肪和肝臟組織的變化。在這里，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)OTP處理后，有效減少了HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂肪量(P<0.01，圖2A)。同時(shí)，HFD-OTP組肝臟重量略有下降，與HFD組相比無顯著差異(圖2B)。然而，OTP處理后油紅O染色區(qū)域的百分比顯著下降，表明OTP可以降低HFD誘導(dǎo)的肝臟脂肪積累，降低肝臟病變的風(fēng)險(xiǎn)(圖2C)。

圖1 補(bǔ)充OTP期間各組小鼠體重變化Fig.1 The changes in body weight of mice in each group during OTP supplementation注：LFD組與HFD組比較，#P < 0.05差異顯著，##P<0.01差異極顯著；HFD-OTP組與HFD組比較，*P < 0.05差異顯著，**P < 0.01差異極顯著；圖2同。

2.2 OTP處理對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

研究表明肥胖等疾病有著高水平的總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)[14]。從表1可以看出，與LFD組相比，HFD組小鼠血清TC、TG、LDL-C明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HFD組相比，HFD-OTP組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低，高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可見，OTP能在一定程度上調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠體內(nèi)血脂水平，長期飲用烏龍茶對(duì)身體有益。

2.3 OTP處理對(duì)飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠腸道微生物多樣性的影響

為了構(gòu)建由HFD誘導(dǎo)的肥胖引起的腸道菌群改變和OTP處理對(duì)腸道微生物群的影響，我們通過16S rDNA測序方法，得到了糞便菌群多樣性和菌群豐度。如表2，Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)隨著OTP處理時(shí)間的延長而提高，Simpson指數(shù)則隨著OTP處理時(shí)間的延長而顯著降低。該結(jié)果表明，肥胖小鼠腸道細(xì)菌群落的多樣性對(duì)著OTP處理時(shí)間的延長而增加并且在第8周時(shí)達(dá)到最大值(P< 0.05)。這說明OTP增加了HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠腸道內(nèi)微生物菌群的多樣性。

圖2 OTP處理對(duì)小鼠脂肪量和肝臟脂肪變性的影響Fig.2 Effect of OTP treatment on fat mass and hepatic steatosis in mice注：A：小鼠脂肪組織重量；B：小鼠肝臟組織重量；C：小鼠肝臟組織油紅O染色圖片(400倍)。

表1 小鼠血清生化指標(biāo)的變化Table 1 The changes of biochemical parameters of mice.

注：同行中不同字母表示數(shù)值間差異性達(dá)到顯著水平(P<0.05)；表2同。

表2 OTP對(duì)HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型的生物多樣性的影響Table 2 The influence of OTP on the biodiversity of the HFD-induced obesity mouse model

為了進(jìn)一步表明OTP對(duì)腸道菌群組成的影響，我們在門(phylum)和屬(genus)水平上比較了不同時(shí)間處理下小鼠糞便腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成(圖3)。研究表明，在門分類水平上，HFD誘導(dǎo)的小鼠中優(yōu)勢菌群包括擬桿菌門(Bacteroidetes)，厚壁菌門(Firmicutes)，放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)。在4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，Actinobacteria和Proteobacteria的相對(duì)豐度變化不大，而OTP處理中Bacteroidetes的相對(duì)豐度隨著處理時(shí)間的增加而顯著增加(P< 0.05)，與此同時(shí)，F(xiàn)irmicutes的相對(duì)豐度降低(P< 0.05)。這表明菌群Bacteroidetes及Firmicutes對(duì)OTP的攝入敏感。此外，F(xiàn)/B從0.80±0.02(OTP-0)降至0.41±0.01(OTP-8)。

熱圖( heatmap) 是以顏色的變化反映各種細(xì)菌在樣本中的相對(duì)豐度變化。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用熱圖對(duì)相對(duì)豐度較大的前20個(gè)細(xì)菌OTU在屬的水平進(jìn)行比較(圖4)，結(jié)果表明，在屬的分類水平上，擬桿菌屬(Bacteroides)，另枝菌屬(Alistipes)，雙歧桿菌屬(Bifidbacterium)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，勞特氏菌屬(Blautia)，瘤胃球菌屬(Ruminococcus)，Barnesiella和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)等菌群的相對(duì)豐度在OTP喂養(yǎng)8周后顯著增加(P< 0.05)。其中，菌群Bacteroides和普雷沃氏菌屬(Prevotella)在每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)上均為菌群。同時(shí)，菌群Prevotella，Odoribacter，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)和梭菌屬XlVa (ClostridiumXlVa)的相對(duì)豐度隨著OTP處理時(shí)間的延長顯著降低(P<0.05)。

圖3 HFD-OTP組小鼠腸道菌群在門水平的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of gut microbiota in mouse at the revel of phylum

圖4 HFD-OTP組小鼠腸道菌群在屬水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of gut microbiota in mouse at the revel of genus

3 結(jié)論與討論

肥胖是一種常見的代謝疾病，伴隨著許多健康問題，并可以增加II型糖尿病和相關(guān)代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)[15]。近年來，越來越多的研究表明腸道微生物菌群多樣性和組成變化與肥胖及其并發(fā)癥之間存在著不可分割的聯(lián)系[16]。多酚是茶葉中的主要活性成分，可改善脂質(zhì)代謝紊亂，高血壓和代謝綜合征，發(fā)揮類似益生元作用[17-18]，有效緩解肥胖引起的腸道菌群失調(diào)，調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸(Short- chain fatty acids, SCFAs)水平和脂質(zhì)代謝[19]。雖然之前的研究表明烏龍茶兒茶素可以在體外抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖和脂肪形成[10]，但OTP在體內(nèi)的減重機(jī)制仍然未知。因此，本文采用高通量測序技術(shù)研究OTP對(duì)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。

本文研究結(jié)果表明，OTP對(duì)宿主腸道微生物菌群的調(diào)節(jié)具有時(shí)間效應(yīng)。OTP改善了HFD喂養(yǎng)誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)。在門的水平，在試驗(yàn)進(jìn)行的第8周，OTP顯著降低了HFD喂養(yǎng)的小鼠的F/B比率，該比率的增加通常被認(rèn)為是“肥胖腸道微生物群”標(biāo)志[20]。這可能是因?yàn)槎喾蛹捌浯x物在腸道中促進(jìn)Bacteroidete繁殖的同時(shí)抑制了Firmicutes的生長。茶兒茶素在某些有益細(xì)菌上表現(xiàn)出與低聚果糖類似的增殖作用，同時(shí)在體外抑制溶組織梭菌(Clostridiumhistolyticum)和Clostridium的生長。此外，它促進(jìn)了總SCFAs的產(chǎn)生[21]。SCFA的產(chǎn)生是腸道微生物群代謝的結(jié)果。這些SCFA被認(rèn)為可以促進(jìn)纖維攝入，促進(jìn)結(jié)腸健康和代謝健康，而SCFA在調(diào)節(jié)宿主代謝，免疫系統(tǒng)和細(xì)胞增殖方面起著關(guān)鍵作用[22]。在我們的研究結(jié)果中，在補(bǔ)充OTP的HFD喂養(yǎng)的小鼠中，產(chǎn)生SCFA的微生物菌類Bacotoides，Blautia和Ruminococcus的相對(duì)豐度增加。此外，在第8周，OTP顯著增加了Alistipes，Barnesiella，Bifidobacteria和Lactobacillus的相對(duì)豐度，尤其是Bifidobacteria和Lactobacillus被認(rèn)為是與人類健康最重要的菌群。Bifidobacteria已被證明可增強(qiáng)腸屏障功能，刺激宿主免疫系統(tǒng)，預(yù)防腹瀉或過敏，參與維生素激活和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[23]。先前已經(jīng)表明Prevotella與西方飲食中的碳水化合物比例相關(guān)，并且與慢性炎癥狀況相關(guān)[24]。在我們的研究中，隨著OTP的攝食，Prevotella的相對(duì)豐度逐漸降低，在8周時(shí)達(dá)到最低值(18.08 ± 0.03)。

綜上所述，OTP能緩解高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，降低體重和體內(nèi)脂肪含量，而這可能與OTP可以提高小鼠腸道菌群多樣性和特定菌群的相對(duì)豐度有關(guān)。因此，OTP可能具有益生元活性，可用作功能性食品成分，具有治療腸道微生物群的潛在治療效用，對(duì)提高人體健康具有重要意義。