李瑩馨，原 茜，王震宇，黃 磊，覃文君，趙 勤

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，四川 成都 611130)

【研究意義】鎘(Cd)是一種毒性極強(qiáng)的環(huán)境污染物，近年來(lái)，隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境中的鎘污染已經(jīng)嚴(yán)重危害到人類和動(dòng)物的健康[1-2]。除腎臟之外，肝臟是鎘進(jìn)入機(jī)體后的重要的靶器官[3]。鎘引發(fā)的肝臟毒性包括鎘進(jìn)入體內(nèi)可致多種組織器官受損，從而產(chǎn)生急性毒性或者慢性毒性[4]，對(duì)骨骼、肝臟、腎臟、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性影響[5-7]。鎘能在肝臟線粒體內(nèi)引起氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致相應(yīng)的氧化損傷[8-10]，可導(dǎo)致相關(guān)的酶含量的變化。其中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)都屬于轉(zhuǎn)氨酶，它們的值升高提示機(jī)體組織的損傷，尤其ALT是肝細(xì)胞損傷最敏感和特異的指標(biāo)；丙二醛(MDA) 含量的變化可直接反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[11]；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶[12]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物多糖具有廣泛的藥理作用，已成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[13]。魔芋葡甘露聚糖(Konjac Glucomannan，簡(jiǎn)稱KGM)是魔芋的主要有效成分，是由葡萄糖和甘露糖以β-1,4糖甘鍵結(jié)合而形成的一種高分子化合物[14-15]。對(duì)KGM的研究已經(jīng)證明，它能夠有效地降低膽固醇、血糖和減肥，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制腫瘤、抗衰老、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化等多種生物活性[16-19]而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、環(huán)保、生物學(xué)等領(lǐng)域。目前對(duì)KGM的利用報(bào)道主要集中在作為增稠劑、保水劑、膠凝劑、成膜劑、改善食品品質(zhì)、改性等方面[18, 20]。但是KGM能否有效保護(hù)鎘所致的LO2細(xì)胞的毒性損傷，尚未見(jiàn)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以人正常肝細(xì)胞(LO2細(xì)胞)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別觀察不同濃度的鎘與LO2細(xì)胞單獨(dú)作用及其與KGM聯(lián)合作用后對(duì)細(xì)胞活力的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以探討KGM對(duì)鎘引發(fā)的肝損傷的影響，為綜合利用KGM和控制鎘污染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑

氯化鎘(CdCl2·2.5 H2O)購(gòu)自天津光復(fù)科技有限公司，氯化鎘臨用前用無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基配制成所需濃度并用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌后待用；魔芋葡甘露聚糖(KGM)(純度≥98 %)購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自北京Solarbio公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自澳大利亞AusGeneX公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒(比色法)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(微板法)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器設(shè)備

倒置熒光顯微鏡(Nikon公司生產(chǎn)，TS100型號(hào))；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)，型號(hào)3001)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)，型號(hào)3111)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)，型號(hào)SW-CJ-1FD)；超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)UPH-I-20T)；高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，型號(hào)HC-2062)；高壓蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)YX-280D)等。

1.3 細(xì)胞株

LO2細(xì)胞株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院袁志翔老師惠贈(zèng)(ATCC來(lái)源)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 LO2細(xì)胞培養(yǎng)及鋪板 細(xì)胞接種于含10 % FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5 %CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換1次培養(yǎng)液，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至90 %融合后，進(jìn)行傳代或凍存。傳代時(shí)以0.5 %胰酶消化，1∶3比例傳代培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LO2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5000個(gè)/150μl·孔，加入96孔細(xì)胞板后培養(yǎng)至貼壁融合度達(dá)90 %時(shí)，棄去原培養(yǎng)液換為無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以排除血清對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾后用于正式試驗(yàn)[21]。

1.4.2 確定KGM溶液對(duì)LO2細(xì)胞的最適作用濃度和無(wú)菌處理方式 因KGM是一種分子量大，水合能力強(qiáng)和不帶電荷的高粘度的分子，溶于水后黏度極高[22]，故需要進(jìn)行KGM溶液對(duì)細(xì)胞作用的最適宜濃度和無(wú)菌處理方式的研究。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基作為溶劑來(lái)配制0.2、0.5和1 mg/mL的KGM溶液，分別采用0.22 μm濾膜過(guò)濾滅菌及121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌方法滅菌后，再將經(jīng)以上處理過(guò)的KGM溶液分別加入LO2細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)12 h，MTT法測(cè)定其對(duì)細(xì)胞活力的影響，確定KGM溶液對(duì)細(xì)胞作用的最適宜濃度和無(wú)菌處理方式。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 分為正常細(xì)胞對(duì)照組(無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基+細(xì)胞)、不同濃度的CdCl2(0.5、1、5、10、20、30、40、50 μmol/L)單獨(dú)作用細(xì)胞組、不同濃度的CdCl2先作用3 h后再用KGM作用的細(xì)胞組、KGM先作用3 h后再用不同濃度的CdCl2作用的細(xì)胞組，空白調(diào)零組(無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基)。以上各組細(xì)胞在分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。每組設(shè)重復(fù)12孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)間終點(diǎn)前4 h，所有試驗(yàn)孔每孔都加入20 μl濃度為5 mg/mL的MTT溶液后繼續(xù)無(wú)菌培養(yǎng)4 h，吸棄掉孔中液體，每孔再加入150 μl的DMSO后震蕩10 min，在570 nm處測(cè)定OD值[23]，細(xì)胞存活率的計(jì)算按以下公式進(jìn)行：

細(xì)胞存活率(%)=

1.4.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、GSH-Px、MDA的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組與加藥處理同2.3，細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔細(xì)胞板中，處理12 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、GSH-Px、MDA的含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與空白對(duì)照組比較(* P < 0.05) Comparison with control group (* P < 0.05)圖1 KGM溶液的無(wú)菌處理方式對(duì)LO2細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of the different aseptic treatment ways for KGM solution on LO2 cell viability

2 結(jié)果與分析

2.1 KGM的最適作用濃度和無(wú)菌處理方式的選擇

從圖1中可以看出，采用121 ℃、30 min高壓滅菌方法處理的0.2 和0.5 mg/mL KGM組與經(jīng)濾膜過(guò)濾處理的0.2 mg/mL的KGM組均對(duì)LO2細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，其他組別均存在不同程度的抑制作用。倒置顯微鏡下觀察同樣可見(jiàn)，滅菌方法處理的0.2 mg/mL的KGM組的鏡下形態(tài)和狀態(tài)與對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)液處理組)差別不大。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用最明顯的用高壓滅菌方法處理的0.2 mg/mL的KGM進(jìn)行試驗(yàn)。

與空白對(duì)照組比較 (* P < 0.05)Comparison with control group (* P < 0.05)圖2 不同濃度的CdCl2處理 LO2細(xì)胞后在不同時(shí)間段對(duì)細(xì)胞存活率的影響 Fig.2 Effect of different concentrations of CdCl2 on the viability of LO2 cells at different time

與鎘單獨(dú)作用組比較(* P < 0.05)Comparison with single Cd treatment group(P < 0.05)圖3 KGM和不同濃度的CdCl2組合處理LO2細(xì)胞不同時(shí)間段后對(duì)細(xì)胞活力的影響 Fig.3 Effects of KGM combined with CdCl2 on the viability of LO2 cells in different time

表1 培養(yǎng)12 h 后ALT、AST、GSH-Px、MDA的檢測(cè)

注：與空白對(duì)照組比較，*P< 0.05；與鎘單獨(dú)處理組比較，△P< 0.05。

Note: Compare with control group, *P< 0.05; Compare with single Cd treatment group, △P< 0.05.

2.2 鎘單獨(dú)作用對(duì)LO2細(xì)胞活力的影響

從圖2可以看出，隨著時(shí)間和濃度的增加，MTT法測(cè)出的LO2細(xì)胞活力均逐漸下降，結(jié)果表明，氯化鎘對(duì)LO2細(xì)胞的增殖存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.3 KGM對(duì)鎘所致的LO2細(xì)胞毒性的保護(hù)效果

從圖3可以看出，在12、24、36和48 h時(shí)的細(xì)胞活力中，除了12 h這一組的單獨(dú)染鎘組細(xì)胞活力比先用鎘處理3 h再用KGM處理12 h的細(xì)胞活力高之外，其余各個(gè)時(shí)間段，隨著時(shí)間的增加，單獨(dú)染鎘組的細(xì)胞活力最低，先用鎘處理3 h再用KGM處理的組細(xì)胞活力次低，而先用KGM處理3 h再用鎘處理的組細(xì)胞活力最高。說(shuō)明KGM對(duì)鎘染毒的細(xì)胞具有保護(hù)效果，而且從保護(hù)效果來(lái)看，先用KGM處理3 h再用鎘處理的組要比先用鎘處理3 h再用KGM處理的組效果更好。

2.4 培養(yǎng)12 h后ALT、AST、GSH-Px、MDA的檢測(cè)

由表1可以看出，與對(duì)照組相比：鎘單獨(dú)處理組、先用鎘處理3 h再用KGM處理的組、先用KGM處理3 h 再用鎘處理的組，其ALT、AST、MDA的檢測(cè)結(jié)果都呈顯著性差異；而僅有鎘單獨(dú)處理組的GSH-Px檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出顯著性差異，其余各組無(wú)顯著性差異。

與鎘單獨(dú)處理組相比：在ALT的檢測(cè)結(jié)果上，空白對(duì)照組、KGM組、先用KGM處理3h再用鎘處理的組均表現(xiàn)出顯著性差異，而先用鎘處理3 h 再用KGM處理的組則無(wú)顯著性差異；在AST的檢測(cè)結(jié)果上，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組都表現(xiàn)出顯著性差異，但鎘單獨(dú)處理組的AST值最高，其次是先用鎘處理3 h 再用KGM處理的組，而先用KGM處理3 h再用鎘處理的組的AST值則明顯降低；在GSH-Px的檢測(cè)結(jié)果上，僅空白對(duì)照組差異顯著，其余各組無(wú)顯著性差異；在MDA的檢測(cè)結(jié)果上，僅空白對(duì)照組和KGM組差異顯著，其余各組則無(wú)顯著性差異。

以上結(jié)果說(shuō)明KGM對(duì)鎘導(dǎo)致的細(xì)胞毒性具有保護(hù)效果，而保護(hù)效果的強(qiáng)弱與KGM對(duì)細(xì)胞的染毒作用方式相關(guān)，即先用KGM進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)后，對(duì)鎘的毒性保護(hù)效果更好。

2.5 光鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察

將正常細(xì)胞對(duì)照組、CdCl2(30 μmol/L)單獨(dú)作用細(xì)胞組、CdCl2(30 μmol/L)先作用3 h 后再用KGM(0.2 mg/mL)作用的細(xì)胞組、KGM(0.2 mg/mL)先作用3 h 后再用CdCl2(30 μmol/L)作用的細(xì)胞組分別培養(yǎng)12 h 后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，如圖4～8所示。與對(duì)照組和KGM作用組相比， CdCl2(30 μmol/L)單獨(dú)作用組的漂浮死細(xì)胞最多，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)量極少；而CdCl2(30 μmol/L)先作用3 h后再用KGM(0.2 mg/mL)作用的細(xì)胞組其漂浮的死細(xì)胞也較多；KGM(0.2 mg/mL)先作用3 h后再用CdCl2(30 μmol/L)作用的細(xì)胞組雖有漂浮死細(xì)胞，但數(shù)量明顯要少于CdCl2(30 μmol/L)單獨(dú)作用組和CdCl2(30 μmol/L)先作用3 h 后再用KGM(0.2 mg/mL)作用的細(xì)胞組。說(shuō)明從細(xì)胞形態(tài)上來(lái)看，KGM對(duì)鎘導(dǎo)致的細(xì)胞毒性有保護(hù)效果。

3 討論與結(jié)論

LO2細(xì)胞系是在人正常肝細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，經(jīng)特殊處理而獲得的能連續(xù)傳代的肝細(xì)胞，其生長(zhǎng)和死亡的規(guī)律和人正常肝細(xì)胞較為接近，利用其進(jìn)行試驗(yàn)，從而繞過(guò)從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)果向人體外推的環(huán)節(jié)，較好地解決物種差異問(wèn)題，而且還可以從細(xì)胞水平研究外源化學(xué)物質(zhì)肝損傷的機(jī)制[24-25]。故本試驗(yàn)用LO2細(xì)胞系來(lái)研究鎘引發(fā)的細(xì)胞損傷及探討KGM的保護(hù)效果，所用細(xì)胞模型是可行的。

圖4 空白對(duì)照組×100NFig.5 Blank control group x 10N

圖5 KGM組×100NFig.5 KGM group x 10N

圖6 單獨(dú)鎘染毒組×100NFig.6 Cd exposure group x 10N

有研究已經(jīng)證明，鎘進(jìn)入體內(nèi)后可導(dǎo)致多種組織器官受損從而產(chǎn)生急性或者慢性毒性[3]，并能引起AST和ALT活性增高， GSH-PX活性升高和MDA量增加[26-27]，導(dǎo)致LO2細(xì)胞存活率的下降[28]。在小鼠上的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)KGM可以通過(guò)降低MDA含量來(lái)提高機(jī)體的抗氧化活性[20, 29]。經(jīng)氧化處理的KGM還可以增強(qiáng)LO2細(xì)胞的GSH-Px和CAT的活性，并提高細(xì)胞的抗氧化能力[30]。

本試驗(yàn)的研究表明，隨著時(shí)間和CdCl2染毒濃度的增加，LO2細(xì)胞活力逐漸下降，符合劑量-效應(yīng)關(guān)系，這為后續(xù)KGM保護(hù)效果的實(shí)驗(yàn)開(kāi)展提供了細(xì)胞損傷的建模依據(jù)。而進(jìn)行了KGM處理的細(xì)胞組，其細(xì)胞活力也都比鎘單獨(dú)處理組有明顯的提高。而且從細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察情況來(lái)看，各試驗(yàn)組細(xì)胞的死亡好損傷情況與MTT法測(cè)定的結(jié)果也吻合。并且先用KGM對(duì)LO2細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)處理后再用鎘染毒培養(yǎng)的LO2的細(xì)胞活力比直接用鎘染毒后再用KGM處理的細(xì)胞活力高，且在ALT、AST、MDA這幾個(gè)指標(biāo)的測(cè)定中也表現(xiàn)出顯著性。說(shuō)明KGM作為一種功能性多糖可以通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)ALT、AST、MDA水平的變化，從而對(duì)鎘導(dǎo)致的LO2 細(xì)胞毒性起到一定的保護(hù)作用。

圖7 先鎘后KGM組×100NFig.7 Cd treated 3hours then treated with KGM group x 10N

圖8 先KGM后鎘組×100NFig.8 KGM treated then treated 3hours with Cd group x 10N